Processo di replicazione del DNA

Introduzione

Per poter replicare esattamente tutta la sequenza del DNA bisogna essere precisi.
Nel ‘900, erano state formulate ipotesi per spiegare il modo in cui la cellula replica il proprio materiale genetico:
Modello semiconservativo= ciascuna molecola di DNA contiene un intero filamento vecchio e un intero filamento nuovo.
Modello conservativo= la molecola originaria viene mantenuta e affiancata ad una molecola completamente nuova.
Modello dispersivo= due molecole i cui filamenti sono costituiti da frammenti di DNA vecchio e nuovo.
Esperimento di Meselson e Stahl nel 1957: avevano usato l’isotopo dell’azoto 15N, il più pesante del comune isotopo 14N. I ricercatori avevano fatto crescere colonie di Escherichia coli su un substrato che conteneva 15N, perciò il DNA di questi batteri era “pesante”. Successivamente trasferirono i batteri su un substrato con 14N:
Prima replicazione= DNA aveva un peso intermedio, quindi conteneva sia 14N che 15N
Seconda replicazione= DNA per metà un peso intermedio e per metà era leggero
L'unico modello che poteva spiegare questo fenomeno era il modello semiconservativo.

Questo fondamentale processo viene catalizzato da enzimi specifici, in particolare, da una famiglia enzimatica, chiamata famiglia delle polimerasi.
Altre precise condizioni:
nucleotidi trifosfato per costruire la nuova molecola
DNA preesistente
complesso di replicazione→ apparato che possa innescare la replicazione, per esempio costituente di enzimi ecc
primer→ segnale d’inizio
numerose proteine

Il doppio filamento di DNA che deve replicarsi si divide: ci saranno degli enzimi che romperanno i legami a idrogeno tra le basi azotate, per permettere la separazione dei due filamenti→ denaturazione, il calore rompe i legami a idrogeno. La catena DNA si denatura perché si rompono i legami, anche se non è presente il calore.
I nucleotidi liberi si uniranno a quelli del nuovo filamento mano a mano seguendo un appaiamento complementare fra le basi. La formazione dei legami fosfodiesterici è catalizzata dall’enzima DNA polimerasi.

I nuovi nucleotidi trifosfato sono aggiunti sull’estremità 3’ del filamento in crescita, dove presenta un gruppo ossidrile libero sul carbonio 3’, attraverso un legame fosfodiestere.

Complesso di replicazione→ complesso proteico che catalizza le reazioni.
Svolgimento e separazione (denaturazione) dei filamenti:
topoisomerasi
DNA elicasi→ utilizza l’energia ottenuta dall’idrolisi dell’ATP per separare i due filamenti rompendo i legami a H
proteine leganti il singolo filamento→ dopo la separazione, si legano ai filamenti per impedire che si riassocino
Il complesso di replicazione si lega ad una sequenza di basi, chiamata ori. A partire da questo punto, il DNA si replica in entrambe le direzioni, formando due forcelle di replicazione, che avanzano in direzioni opposte, allontanandosi l’una dall’altra.
Forcella di replicazione→ specie di x che si forma quando il DNA si apre. Queste aperture piano piano si allargano finché non si staccano completamente.

Caratteristiche della DNA-polimerasi

DNA polimerasi→ complesso enzimatico che avvolge il complesso di replicazione

Primasi che sintetizza il primer (breve filamento di RNA) che fa scattare il processo
La primasi si stacca e poi la DNA polimerasi si lega e sintetizza il nuovo DNA. La forcella si apre, facendo arrivare un nuovo filamento di DNA, e i suoi nucleotidi si aggiungono dall’estremità 3’. Di conseguenza, l’allungamento procede in modo diverso sui due filamenti antiparalleli.
Il filamento con l’estremità 3’ libera dalla forcella procede in modo continuo, è detto filamento veloce. L’altro filamento procede in modo discontinuo, infatti viene chiamato filamento lento; si vengono a formare degli spazi vuoti, non replicati, per risolvere questo problema vengono prodotti brevi segmenti discontinui, i frammenti di Okazaki. La DNA ligasi catalizza la formazione di legami fosfodiestere che uniscono i due frammenti di Okazaki.

La primasi occupa un determinato pezzo di DNA, quindi alla fine rimane escluso e non viene replicato. Si attivano dei meccanismi per tagliare via questi pezzi. Di conseguenza, a ogni divisione cellulare, il cromosoma si accorcia.
In molti eucarioti le estremità dei cromosomi portano delle sequenze ripetitive chiamate telomeri. Nella specie umana, la sequenza del telomero è TTAGGG ed è ripetuta circa 2500 volte.

N.B. → i telomeri hanno solo uno scopo strutturale per non disperdere quei pezzi utili

La perdita dei telomeri, durante ogni ciclo di replicazione del DNA e divisione cellulare, spiega perché le cellule non durano per tutta la vita dell’organismo.
Alcune cellule, però, conservano il loro DNA telomerico→ cellule staminali del midollo osseo e cellule che producono gameti. In queste cellule esiste un enzima, la telomerasi, che sintetizza i telomeri.

Correzione degli errori di replicazione del DNA

Ci sono delle correzioni, se non ci fossero tutti avremmo vite molto brevi perché avremmo delle cellule danneggiate.
Correzione di bozze→ quando l’appaiamento delle basi non è complementare, quindi le basi sono appaiate in modo sbagliato, la DNA polimerasi si ferma e rimuove le basi sbagliate sostituendole con quelle corrette.
Riparazione delle anomalie di appaiamento→ quando sfugge un errore delle basi, quindi la polimerasi riesamina il DNA dopo essersi replicato e corregge eventuali appaiamenti sbagliati.
Riparazione per escissione→ rimuove le basi anomale, modificate da agenti chimici, con delle basi funzionali.

Il meccanismo di riparazione delle anomalie riesce a riconoscere la base sbagliata perché un filamento di DNA appena replicato subisce dei cambiamenti chimici. Per esempio, nei procarioti ad alcune adenine si va ad aggiungere un gruppo metile (metilazione). Dopo la replicazione, il filamento non è ancora metilato ed è quindi riconoscibile dal meccanismo di riparazione.

RNA→ acido ribonucleico
E’ simile al DNA, con tre differenze:
l’RNA è formato da un unico filamento
la molecola di zucchero dell’RNA è il ribosio, anziché il desossiribosio del DNA
tre basi azotate→ adenina, guanina, citosina e uracile (al posto della timina)

Esistono numerosi classi di RNA:
RNA messaggero (o mRNA) → porta una copia delle informazioni di un tratto di DNA ai ribosomi che deve essere tradotto in proteine
RNA transfer (o tRNA) → porta gli amminoacidi ai ribosomi
RNA ribosomiale (o rRNA) → entra a far parte dei ribosomi e permette la sintesi proteica

Trascrizione

-Inizio
-Allungamento
-Terminazione

L’inizio richiede un promotore, il primer, che permette l’azione. E’ una sequenza di DNA preciso alla quale si lega la RNA polimerasi e da dove inizierà la trascrizione.
Ci sono differenze fra i promotori degli eucarioti e quelli dei procarioti.

Procarioti→ promotore in prossimità dell’estremità 5’. Possiede: una sequenza di riconoscimento e il TATA box (costituito da coppie di basi AT) ed è il punto da cui comincia la denaturazione del DNA.

Eucarioti→ l’RNA polimerasi si lega al DNA dopo che si sono legate altre sequenze proteiche, chiamate fattori di trascrizione. Queste si legano al TATA box, cambiando forma e creando un complesso di trascrizione, così che si possa unire all’RNA polimerasi e iniziare la trascrizione.
Altre sequenze di promotori sono specifiche e vengono riconosciute da fattori di trascrizione presenti in particolari tessuti. Questi specifici fattori di trascrizione svolgono un ruolo importante nella specializzazione cellulare.

La seconda fase della trascrizione è l’allungamento.
La RNA polimerasi apre il DNA e legge il filamento dall’estremità 3’ a quella 5’. Il nuovo RNA si allunga partendo dall’estremità 5’, andando verso la 3’, di conseguenza l’RNA che viene trascritto è antiparallelo al filamento del DNA.
Sul filamento stampo del DNA ci sono particolari sequenze di basi che permettono la terminazione.

Linguaggio del DNA - Codice genetico

Ogni sequenza di tre basi lungo la catena polinucleotidica dell’RNA è un codone (tripletta) che specifica un determinato amminoacido. Il codice genetico crea una corrispondenza tra i codoni e i loro specifici amminoacidi.
Con quattro possibili lettere (basi→ U, A, C, G) si possono scrivere 64 (43) triplette, ma gli amminoacidi sono solo 20.
AUG, che codifica la metionina, è anche il codone di inizio, il segnale che fa avviare la traduzione. Altre tre codoni (UAA, UAG, UGA) sono codoni di stop e funzionano come segnali di terminazione della traduzione.
Restano 60 codoni, togliendo quelli di inizio e di stop, che dovrebbero codificare i 19 amminoacidi: a quasi tutti gli amminoacidi corrispondono più codoni. Perciò si dice che il codice è degenerato. Per esempio, la leucina è rappresentata da sei codoni diversi.
Inoltre, il codice è quasi universale, cioè nella maggior parte delle specie un codone specifica sempre lo stesso amminoacido. Alcune eccezioni: il codice dei mitocondri e dei cloroplasti è un po’ diverso sia da quello dei procarioti sia da quello degli eucarioti.

Traduzione

- Inizio
- Allungamento
- Terminazione

tRNA→ composto da molecole di RNA a singolo filamento, che ha numerose funzioni fondamentali:
trasportatore di amminoacidi
funge da tramite tra il codice genetico nucleotidico e quello proteico (sequenze di amminoacidi)
adattatore tra codoni dell’mRNA e amminoacidi che devono trasportare al ribosoma
La sua struttura è tridimensionale. Il filamento è costituito da 75-80 nucleotidi.
E’ presente un sito di attacco dell’amminoacido, corrispondente alla sequenza 5’-CCA-3’.
Dispone di brevi tratti di doppia elica, permesso dall’appaiamento di basi complementari attraverso legami a idrogeno.
Nei “bracci” della struttura sono presenti regioni di riconoscimento per i ribosomi. Inoltre, c’è un gruppo di 3 basi (CCG), chiamato anticodone, che costituisce il sito di appaiamento fra basi complementari con l’mRNA.

Processo enzimatico→ realizzato dalla famiglia enzimatica di amminoacil-tRNA-sintetasi, che catalizza il legame tra tRNA e l’amminoacido.

Il ribosoma è costituito da due subunità, una maggiore e una minore. Negli eucarioti, la subunità maggiore è composta da tre molecole di rRNA e da 45 molecole proteiche; la subunità minore contiene una sola molecola di rRNA e 33 molecole proteiche.
Sulla subunità maggiore si trovano tre siti di legame per i tRNA:
Nel sito A, l’anticodone dell’RNA transfer riconosce il codone corrispondente.
Nel sito P, l’amminoacido si stacca dal tRNA e si attacca al sito P.
Nel sito E, l'amminoacido si stacca e si lega ad un altro amminoacido, intanto, il tRNA torna nel citosol e raccoglie un’altra molecola di amminoacido per ricominciare il processo.

Inizio→ AUG, cioè la metionina, codone d’inizio, si lega con l’anticodone di un tRNA. Avviene la formazione di un complesso d’inizio costituito dall’RNA con la metionina e la subunità inferiore del ribosoma.
L’rRNA della subunità minore si lega all’mRNA, più precisamente all’estremità 5’. Dopo che il tRNA con la metionina si è legato all’mRNA, la subunità maggiore si unisce al complesso. Il tRNA con la metionina si sposta nel sito P.
Queste componenti sono tenute insieme da un gruppo di proteine dette fattori di inizio.

Allungamento→ la subunità maggiore catalizza due reazioni:
Nel sito P, avviene la rottura del legame tra tRNA e il suo amminoacido
formazione di un legame peptidico fra questo amminoacido e quello attaccato al tRNA nel sito A, formandosi così la catena polipeptidica, piano piano gli amminoacidi si attaccano fra loro
Dopo aver consegnato la propria metionina, il primo tRNA si sposta nel sito E, quindi si stacca dal ribosoma e torna nel citosol per caricarsi con un’altra metionina.

Terminazione→ quando entrano in azione i codoni di stop (UAA, UAG, UGA), fermando l’allungamento e quindi la traduzione finisce. La catena polipeptidica si separa dal ribosoma, e la subunità inferiore si separa da quella superiore.

Post-traduzione→ le proteine vengono mandate nei vari organuli, ma possono anche rimanere nel reticolo endoplasmatico ruvido o nell’apparato di Golgi.
Inoltre, la catena polipeptidica quando esce dal ribosoma si ripiega formando la sua forma tridimensionale.
La sequenza polipeptidica contiene una sequenza segnale, una specie di etichetta con le informazioni inerenti a dove la proteina deve andare. (la traduzione avviene su un ribosoma legato al RER) Questa sequenza si lega ad uno specifico recettore nella membrana dell’organulo per essere riconosciuta, che poi viene rimossa nel lume del RER, successivamente, il polipeptide continua ad allungarsi e poi rilasciato definitivamente nel lume del RER.

Importanza di questi segnali→ nella mucolipidosi di tipo 2 (malattia genetica)
mutazione nel gene che codifica un enzima dell’apparato di Golgi, la cui funzione è aggiungere zuccheri alle proteine destinate ai lisosomi. Questi zuccheri funzionano come sequenze segnale. Senza questi enzimi, le macromolecole si accumulano nei lisosomi, fino alla morte precoce.