Scoperte genetiche e meccanismi molecolari del DNA e dei virus

Inizio del XX secolo e Griffith

All'inizio del XX secolo sapevano che il materiale genetico poteva essere o nel DNA o nelle proteine, siccome entrambe contenevano i cromosomi. le proteine, che avevano una struttura più complessa in quanto formate da 20 amminoacidi mentre il DNA ne aveva solo 4, erano considerate l'opzione più probabile. Griffith stava studiando due ceppi di un batterio: uno era innocuo mentre l'altro provocava la polmonite nei topi. Scoprì che quando mescolava batteri patogeni uccisi con altri innocui ma vivi, alcuni di questi diventavano in grado di trasmettere la malattia perciò alcuni componenti chimici di quelli morti dovevano agire da fattore trasformante.

Esperimenti con il virus T2

Dimostrarono che era il DNA di virus T2 che infettava l'isterichia coli.

Il T2 è costituito da una testa formata da un rivestimento proteico che racchiude DNA e collegata ad una coda cava con 6 fibre articolate capaci di attaccarsi alla superficie di un batterio sensibile. Il T2 era in grado di riprogrammare la cellula ospite inducendola a produrre nuovi dati ma non si sapeva se fosse il DNA o le proteine a svolgere questo compito. Gli scienziati usarono isotopi radioattivi per marcare il DNA e le proteine del fago T2. Allevarono il fago e l’isterichia coli l’una soluzione contenente zolfo radioattivo. Dato che le proteine contenevano zolfo, gli atomi di zolfo radioattivo potevano incorporarsi solo nelle proteine dei fagi di nuova formazione. Coltivarono anche un altro gruppo di fagi con il fosforo radioattivo perché il DNA contiene fosforo.

Fasi:

1. i due gruppi diversi furono infettati dai virus

2. frullarono le due colture per poter staccare meccanicamente le parti dei fagi rimaste fuori dalle cellule batteriche

3. centrifugarono i campioni ottenuti per separare le cellule batteriche dai fagi che essendo più leggeri rimanevano a galla

4. misurarono la radioattività del precipitato e del liquido sovrastante

Quando i batteri erano infettati dai fagi con DNA, la radioattività si trovava nel precipitato. Se questi batteri venivano nuovamente inseriti in una coltura, le loro cellule andavano in lisi e liberavano nuovi fagi contenenti DNA con fosforo radioattivo ma senza zolfo. Gli scienziati dedussero che le istruzioni necessarie per produrre nuovi fagi si trovassero nel DNA.

Struttura del DNA e RNA

DNA e RNA sono acidi nucleici costituiti da catene di unità chimiche ripetute e legate tra loro, dette nucleotidi. Ognuno include 3 componenti: una base azotata, uno zucchero ed un gruppo fosfato.

Il DNA è costituito da quattro diversi tipi di nucleotidi che differiscono per base azotata: adenina, guanina, citosina e timina.

I nucleotidi sono uniti da legami covalenti che si formano tra lo zucchero di un nucleotide ed il gruppo fosfato di quello successivo. La struttura risultante è detta scheletro zucchero-fosfato: al suo esterno sporgono le basi azotate e la posizione dei nucleotidi è variabile.

Il gruppo fosfato ha un atomo di fosforo al centro. Lo zucchero ha 5 atomi di carbonio, 4 nell'anello ed uno esterno ed al vertice della struttura si trova l’ossigeno.

Nel DNA lo zucchero è chiamato desossiribosio perché rispetto al RNA ha un atomo di ossigeno in meno.

Le basi si dividono in pirimidine (timina e citosina), strutture ad anello singolo e purine (adenina e guanina), a doppio anello. Sono l’unico elemento distintivo dei nucleotidi.

È costituito da zucchero ribosio ed al posto della timina c’è l’uracile, che ha una struttura simile a quella della timina.

Scoperta di Watson e Crick

Watson e Crick per capire la forma del DNA si servirono della sua struttura chimica, del suo ruolo biologico, del rapporto 1:1 tra le basi azotate (A+T=1:1 e C+G=1:1 dove %A=%T e %C=%G) e della sua cristallizzazione (il DNA viene ridotto a sale e sottoposto a radiazioni produce un risultato che fa capire che è elicoidale e con diametro 2nm).

Il suo diametro indicava che questa dovesse essere costruita da sue filamenti uniti in una doppia elica, dove lo scheletro zucchero-fosfato dovesse essere all’esterno e le basi azotate all’interno.

Pensarono che le basi fossero appaiate secondo il metodo del simile (AA, CC…) ma l’appaiamento non corrispondeva a quello della cristallografia che suggeriva un diametro costante (AA avrebbe avuto un ingombro più grande di quello di CC). Scoprirono quindi che le basi erano complementari (purina con pirimidina) in quanto ogni base ha gruppi chimici che creano legami idrogeno con specifiche molecole.

La cellula applica o stesso principio di complementarietà quando copiava i geni.

Duplicazione del DNA

I due filamenti originali di DNA si separano ed ognuno di essi diventa uno stampo per l’assemblaggio di un filamento complementare a partire da una riserva di nucleotidi liberi nell’ambiente i quali si allineano lungo un filamento stampo. Appositi enzimi uniscono poi i nucleotidi formano il nuovo filamento di DNA. Questo processo è detto semiconservativo perché in ogni molecola figlia resterà metà della molecola originaria.

Il processo ha inizio nei punti di origine della duplicazione, tratti di DNA con una specifica sequenza di nucleotidi, nei quali alcuni enzimi* si attaccano per separare i filamenti.

La duplicazione procede in 2 direzioni, creando le bolle di duplicazione.

I filamenti del DNA originario si dividono a mano a mano che i filamenti nuovi si allungano su entrambi i lati della bolla fino a toccarsi.

*

- elicasi: rompe il legame idrogeno tra le 2 eliche

- topoisomerasi: evita il superavvolgimento tagliando uno dei filamenti e permettendo all’altro di non avvolgersi ed infine riagganciando i due

- primasi: sintetizza una molecola di RNA complementare detta primer che verrà poi sostituito con DNA dalla polimerasi I

- ligasi: lega i vari pezzetti di DNA alla fine del processo

- polimerasi: catalizza la sintesi d’un filamento di DNA. I due filamenti sono orientato in modo opposto e perciò vengono duplicati con meccanismi differenti: sulla leading strand la duplicazione avviene nello stesso verso della forcella, ovvero 5’ 3’, mentre nella lagging strand la duplicazione è discontinua e procede a partire dalla forcella. Questo verso corrisponde a quello della polimerasi (3’ 5’). In questo verso vengono creati più primer. La polimerasi III si attacca ad ogni primer dell’RNA e duplica un tratto di DNA fino al primer successivo. Questi primer verranno poi eliminati dalla ligasi.

Informazione genetica

Informazione genetica e mutazioni

Il genotipo di ogni individuo è l’informazione ereditaria contenuta nel DNA mentre il fenotipo corrisponde ai tratti specifici del DNA. Il legame tra i due sta nelle proteine.

Un gene fornisce le istruzioni per sintetizzare una proteina sotto forma di RNA che programma la sintesi. Le istruzioni partono dal DNA, procedono verso l’RNA e da qui al citoplasma. Le fasi principali del processo sono trascrizione (trasferimento dell’informazione dal DNA all’RNA) e traduzione (da RNA a proteina).

Ci sono 20 amminoacidi e 4 nucleotidi. durante la traduzione avviene un cambiamento di linguaggio, dalla sequenza di nucleotidi dell’RNA a quella degli amminoacidi. 3 nucleotidi (codone) vengono tradotti con un amminoacido. I codoni del DNA sono trascritti nei codoni complementari dell’RNA, i quali sono tradotti negli amminoacidi che formano un polipeptide.

L’RNA che codifica le sequenze di aminoacidi è detto messaggero (mRNA). Questo viene trascritto a partire dal DNA stampo ed il suo messaggio viene tradotto in catene polipeptidiche.

Nelle cellule procariote (no nucleo) trascrizione e traduzione avvengono nel citoplasma ma nelle eucariote le molecole di mRNA necessarie per la traduzione devono uscire dal nucleo. Prima di farlo, gli mRNA vengono modificati per esempio aggiungendo un cappuccio ed una coda alle due estremità, i quali non vengono tradotti ma facilitano l’uscita del DNA dal nucleo e lo proteggono.

Nella maggior parte dei geni la sequenza di DNA è discontinua ed includono delle regioni non codificanti, dette introni, mentre quelle codificanti sono dette esoni. Gli esoni cono copiati dal DNA nell’RNA ma prima che l’RNA lasci il nucleo, gli introni sono eliminati e gli esoni si uniscono producendo mRNA con una sequenza codificante continua. Questo processo è detto splicing.

Esso è catalizzato da un complesso di proteine e di piccole molecole di mRNA ma alcune volte l’mRNA può funzionare da enzima e rimuovere i propri introni.

La sintesi prosegue con il processo di traduzione che coinvolge tRNA, ribosomi, enzimi ed ATP.

Il tRNA converte i codoni in amminoacidi i quali non sono in grado di riconoscere da soli i codoni lungo l’mRNA. Il tRNA abbina gli amminoacidi giusti rispetto ai rispettivi codoni in modo da sintetizzare il nuovo polipeptide. Queste due funzioni sono svolte grazie alla struttura del tRNA.

Una molecola di tRNA è formata da un singolo filamento di RNA ed avvolgendosi e ripiegandosi su sé stesso, forma alcune regioni a doppio filamento nelle quali brevi segmenti di RNA appaiono le loro basi azotate a quelle complementari di un altro segmento. Un’estremità ripiegata contiene l’anticodone.

Ogni anticodone di tRNA è complementare ad uno di mRNA, al quale si appaia durante la traduzione. All’altra estremità della molecola di tRNA si trova il sito di legame per l’amminoacido.

Per completare il processo occorrono i ribosomi, situati nel citoplasma e divisi in due subunità formate da proteine e da rRNA.

Gli anticodoni del tRNA ed i codoni dell’mRNA si legano ai ribosomi che hanno un sito di legame per l’mRNA e due per il tRNA. Il tRNA occupa i due siti: le subunità agiscono come una morsa tenendo vicine le molecole di mRNA e tRNA e permettendo agli amminoacidi del tRNA di formare una catena polipeptidica.

La fase di inizio avviene in due tappe: una molecola di mRNA si unisce alla subunità ribosomiale più piccola mentre il tRNA con anticodone UAC si lega al codone di inizio AUG. Il tRNA si colloca nel sito p e un altro nel sito a.

Dopo questa fase nuovi amminoacidi vengono aggiunti al primo della sequenza. Il tRNA del sito p lascia il ribosoma e quello del sito a si trasferisce nel sito p e questo processo continua fino al codone d’arresto quando il polipeptide completo si stacca e le subunità ribosomiali si separano.

L’origine delle mutazioni è la sostituzione di un solo nucleotide nel filamento di DNA che codifica il polipeptide. Le mutazioni sono di tre tipi: cromosomiche, geniche e puntiformi.

Avvengono per due motivi:

1. sostituzione di basi: un nucleotide viene scambiato con un altro. Se una mutazione provoca nell’mRNA la trasformazione di un codone, nella proteina che si formerà non ci sarà alcun cambiamento perché questo potrà essere codificato. Alcune sostituzioni possono introdurre nel polipeptide un amminoacido diverso che però potrebbe mantenere inalterata la funzione della proteina, altre possono impedire il corretto funzionamento della proteina se la sostituzione di una base converte un codone che codifica per un amminoacido in un codone di arresto.

2. inserzione o delezione di basi: hanno effetti nocivi. Durante la traduzione l’mRNA viene tradotto come una serie di triplette di nucleotidi pertanto l’aggiunta o la sottrazione di nucleotidi può causare l’alterazione del quadro di lettura.

La trasmissione delle mutazioni può verificarsi in qualsiasi cellula del corpo che poi la trasmetterà alle cellule figlie per divisione cellulare. Questo tipo di mutazione è detta somatica e non è trasmissibile come quella germinale che avviene a livello della linea germinale da cui derivano le cellule riproduttive.

Cicli riproduttivi dei virus

I virus sono costituiti da acido nucleico racchiuso in un involucro proteico detto capside e provvisti di un rivestimento membranoso. Essi possono riprodursi solo all’interno di cellule ospiti di cui fruttano le molecole necessarie alla duplicazione, alla trascrizione ed alla traduzione.

I fagi hanno un ciclo riproduttivo detto litico che comporta la rottura (lisi) della cellula ospite con conseguente liberazione dei virus che si sono formati al suo interno ma alcuni fagi utilizzano il ciclo lisogeno durante il quale la duplicazione del DNA virale avviene senza la distruzione della cellula ospite.

All’inizio dei due cicli il fago si attacca alla cellula ed inietta il proprio DNA nel batterio. A questo punto il DNA batterico nel ciclo litico trasforma la cellula in una fabbrica di virus, subisce la lisi e libera i prodotti virali.

Nel ciclo lisogeno, il DNA si integra con il cromosoma batterico così ogni volta che la cellula si divide duplica il DNA del fago assieme al suo e ne trasmette una copia alle cellule figlie ed alla fine si torna al ciclo litico.

L’ingresso nella cellula ospite avviene grazie al legame tra i recettori della membrana plasmatica e le spine glicoproteiche del virus. L’involucro virale si fonde con la membrana, consentendo all’RNA ed al suo rivestimento proteico di entrare nel citoplasma. Alcuni enzimi rimuovono questo rivestimento ed un enzima del virus usa l’RNA virale come stampo per sintetizzare filamenti complementari di RNA che hanno due funzioni: fungono da mRNA per la sintesi di proteine virali e da stampo per produrre nuovo RNA virale. Le proteine di rivestimento si assemblano intorno all’RNA e le particelle virali nuove escono dalla cellula senza provocarne la lisi, utilizzando come involucro parte della sua membrana plasmatica.

Possiede un involucro membranoso ed estroflessioni glicoproteiche simili a chiodi, componenti che permettono al virus di entrare in una cellula ed uscirne. Contiene due copie identiche del suo RNA e si riproduce in modo diverso. Infatti è un retrovirus, ovvero inverte il normale flusso delle informazioni genetiche grazie alla trascrittasi inversa che catalizza la sintesi del DNA utilizzando come stampo una molecola di RNA.

La trascrittasi usa l’RNA virale come stampo per sintetizzare un filamento di DNA, l’enzima aggiunge un secondo filamento complementare di DNA ed entra nel nucleo della cellula, integrandosi con il DNA. Le nuove particelle virali che ne risultano escono dalla cellula e ne infettano altre.

Trasformazione, trasduzione e coniugazione

Esistono tre modi secondo i quali i geni possono spostarsi da una cellula all’altra:

1. Trasformazione: è l’acquisizione di DNA dall’ambiente circostante. I batteri possono contenere plasmidi, tratti di DNA esterni al cromosoma, i quali si duplicano e possono andare all’esterno dove vengono ricevuti da altre cellule molto facilmente. L’informazione contenuta può essere ad esempio la resistenza agli antibiotici (plasmide R=resistenza agli antibiotici)

2. Trasduzione: un fago viene inglobato un frammento di DNA appartenente alla cellula ospite del fago, anziché il DNA virale. Quando il fago infetta una nuova cellula, vi inietta questo DNA batterico clandestino.

3. Coniugazione: la cellula donatrice maschile con fattore F produce pili sessuali, strutture che permettono di costruire un ponte tra una cellula e l’altra. La cellula ricevente, cioè quella femminile diventa maschio. Il fattore F si integra con il DNA batterico e fa una specie di crossing over tra il DNA trasferito e quello batterico.