Tesi Valutazione dei sierotipi da HPV come fattore di rischio per la carcinogenesi

Dipartimento di scienze e tecnologie biologiche ed ambientali

Corso di laurea magistrale in biologia

Tesi di laurea sperimentale in genetica umana

Valutazione dei sierotipi da papillomavirus umano (HPV) come fattore di rischio per la carcinogenesi

Human Papillomavirus (HPV) sierotypes evaluation as risk factor for carcinogenesis

Relatore: Prof.ssa Serafina Massari
Correlatore: Dott.ssa Maria Carmina Manzorra
Laureando: Silvana Danese
Anno accademico: 2019/2020

Indice

• Riassunto .......................................................................................................................... 3
• Introduzione .................................................................................................................. 4
  • Caratteristiche strutturali ................................................................................................................. 4
  • Morfologia ......................................................................................................................................... 4
  • Genoma ............................................................................................................................................. 5
  • Classificazione .................................................................................................................................. 9
  • Modalità di trasmissione ................................................................................................................ 11
  • Ciclo infettivo ................................................................................................................................. 11
  • Epidemiologia ................................................................................................................................ 14
  • Manifestazioni cliniche .................................................................................................................. 19
  • Vaccinazione .................................................................................................................................. 21
• Approcci molecolari per la tipizzazione dell'HPV ................................................................................. 24
  • Tecniche di ibridazione in situ ......................................................................................................... 24
  • Tecniche di amplificazione ............................................................................................................... 25
• Scopo della tesi ......................................................................................................... 31
• Materiali e metodi .................................................................................................. 32
  • Estrazione del DNA......................................................................................................................... 32
  • Composizione del kit ........................................................................................................................ 32
  • Protocollo di estrazione ................................................................................................................... 33
  • Dosaggio del DNA .......................................................................................................................... 34
  • Materiali necessari ........................................................................................................................... 34
  • Protocollo di lavoro.......................................................................................................................... 35
  • Procedure alternative .................................................................................................................... 35
  • Procedura classica............................................................................................................................ 36
  • PCR (Polymerase Chain Reaction) ............................................................................................... 36
  • Elettroforesi su gel ........................................................................................................................... 38
  • EXOSAP ........................................................................................................................................ 39
  • Reazione di sequenziamento .......................................................................................................... 39
  • Purificazione di sequenza ............................................................................................................... 41
  • Genotipizzazione dell'HPV ............................................................................................................. 43
  • Procedure CE (certificate) IVD (in vitro diagnostic) ......................................................................... 44
  • AMPLIQUALITY HPV-TYPE EXPRESS (AB Analitica) ................................................................... 44
  • PapilloCheck (Greiner Bio-One) .................................................................................................... 50
• Risultati ......................................................................................................................... 60
• Discussione .................................................................................................................... 66
• Bibliografia ................................................................................................................. 70

Riassunto

L’HPV (Human Papilloma Virus) è un virus a doppio filamento di DNA, facente parte della famiglia dei Papillomaviridae. Nell’uomo si trasmette sessualmente, attraverso il sesso vaginale, anale o orale e tramite il contatto pelle-pelle e può essere definito cutaneo o mucosale, a seconda che infetti la cute o le mucose. Attualmente sono stati sequenziati circa 120 differenti genotipi di HPV, alcuni dei quali diffusi a livello globale. Tra questi, circa 40 tipi di HPV sono ad alto rischio, poiché possono potenzialmente causare displasie connesse al successivo sviluppo di forme di cancro vulvari, vaginali, cervicali, anali, orofaringee o del pene. Data la forte associazione tra infezioni da hrHPV e insorgenza di lesioni precancerose e cancerose, rilevare gli hrHPV nei primi stadi di sviluppo della lesione risulta essere di fondamentale importanza per prevenire la progressione tumorale. Questo è stato il presupposto che ha portato allo sviluppo di tecniche di genotipizzazione per l’HPV sempre più sviluppate, basate su metodi molecolari via via più avanzati, con la messa a punto di nuovi primer e nuovi kit automatizzati. Tutto ciò ha permesso una sempre crescente efficacia nella capacità di rilevazione dell’HPV (Gautam et al., 2019). Durante il mio periodo di tesi utilizzando tre differenti metodiche ho tipizzato 18 pazienti (16 donne e 2 uomini) con sospetta infezione da HPV, rilevando la presenza del virus nel 50% dei casi, con una maggiore incidenza nei soggetti più giovani. Tra i 9 soggetti positivi (7 donne e 2 uomini), tutti i soggetti di sesso femminile sono risultati positivi ad un ceppo ad alto rischio, mentre i 2 uomini sono risultati positivi per un ceppo a basso rischio. Ciò dimostra l'importanza di eseguire la tipizzazione dell'HPV in tutti i casi di sospetta presenza del virus per la prevenzione delle patologie cancerose.

Introduzione

Caratteristiche strutturali

Morfologia

Il papillomavirus umano o HPV (Human Papilloma Virus) è una specie di virus appartenente al genere dei Papillomavirus e alla famiglia dei Papillomaviridae. Strutturalmente i Papillomavirus sono dotati di un capside icosaedrico di rivestimento (un poliedro a 20 facce) con un diametro compreso tra i 52 e i 55nm, formato da 72 capsomeri pentamerici (Fig. 1A). Questi capsomeri sono costituiti dalla proteina capsidica maggiore L1 (più abbondante), ed internamente sono associati alla proteina capsidica minore L2 (meno abbondante). La funzione di questo capside di rivestimento è quella di proteggere il genoma virale e complessivamente la particella virale matura così formata prende il nome di virione (Fig. 1B). I virioni sono privi di componenti di natura lipidica e glicosidica e sono resistenti al trattamento con acidi, eteri o calore (Santos-López et al., 2015).

Figura 1 - A) Struttura in 3D del Papillomavirus ottenuta tramite microscopio elettronico. B) Rappresentazione grafica della struttura di capside e genoma del Papillomavirus- (Santos-López et al., 2015)

Genoma

Il genoma dei Papillomavirus è una doppia elica di DNA circolare, con dimensioni di 7.9 kb, che codifica per 7-8 proteine (Fig. 2). Tra queste, quelle altamente conservate sono le proteine strutturali L1 ed L2 e le proteine regolatrici E1 ed E2. Tuttavia, la maggior parte degli HPV codifica anche:

• Per le proteine E6 ed E7, che assicurano ottimali condizioni per il loro ciclo vitale;
• Per una piccola proteina idrofobica transmembrana (E5 o E10);
• Per la proteina E4, molto diversa dalle altre ma altamente espressa, inclusa nella ORF (open reading frame) più ampia della proteina E2;
• Per la proteina E8, inclusa nello schema di lettura della proteina E1.

La proteina E5 è codificata dalla regione localizzata tra la ORF della proteina E2 e quella della proteina L2. Questa regione in realtà può codificare per diversi tipi di proteine E5, che condividono una piccola regione di omologia e che sono per questo classificate in gruppi: E5-alpha, E5-beta, E5-gamma, E5-delta, E5-epsilon e E5-zeta. La proteina E10, invece, pur essendo molto simile alla proteina E5, è codificata da una regione inclusa nello schema di lettura di E6, all’estremità 5’. Inoltre, tra la ORF della proteina L1 e quello della proteina E6 è presente una LCR (Long Control Region), anche nota come URR (Upstream Regulatory Region), ovvero una regione che codifica per complessi trascrizionali e coattivatori in grado di promuovere la trascrizione e la replicazione di geni distali (Van Doorslaer et al., 2017).

L’RNA messaggero (mRNA) corrispondente a ciascuna di queste proteine, per dare origine alla proteina funzionante, subisce un processo di splicing (rimozione degli introni). Nel caso del trascritto corrispondente alla proteina E6, la regione che va incontro a splicing è altamente conservata nell’ambito dei ceppi ad alto rischio, conosciuti come Alphapapillomaviruses. In seguito allo splicing viene prodotta questa proteina, costituita da un dominio che lega lo zinco (zinc-binfing motif), seguito da alcuni amminoacidi, variabili a seconda del ceppo considerato. Un altro esempio è quello della proteina L1, ottenuta da un trascritto che subisce il processo di splicing di una regione altamente conservata (YYNYAGATG, dove Y può essere T o C). Un aspetto importante è legato al fatto che, grazie al processo di splicing, si possono ottenere proteine di fusione. Tra queste abbiamo la proteina di fusione E1^E4, ottenuta grazie ad uno splicing alternativo, grazie al quale una piccola parte del trascritto E1 si fonde con il trascritto E4. Un altro esempio è quello della proteina di fusione E8^E2, nella quale, grazie ad un processo di splicing alternativo, la proteina E8, inclusa nella ORF di E1, si fonde all’estremità C-terminale di una parte della proteina E2. Si ottiene in questo modo una proteina funzionante con il compito di reprimere la trascrizione e la replicazione virale (Van Doorslaer et al., 2017).

Figura 2 - Il genoma di HPV - (Stanley, 2010)

Ognuna delle proteine codificate dal genoma dell’HPV ha una specifica funzione.

• La proteina L1 è la principale costituente del capside virale. Questa è in grado di riconoscere i recettori presenti sulla cellula ospite e quindi, essendo altamente immunogena, è utilizzata come anticorpo neutralizzante (Santos-López et al., 2015).
• La proteina L2 è una costituente del capside meno prevalente ed insieme a L1 è implicata nel legame della particella virale con la cellula ospite, in modo da favorirne l’ingresso, il trasporto a livello del genoma dell’ospite o il rilascio del genoma virale per l’assemblaggio dei virioni (Santos-López et al., 2015).
• Le proteine E1 ed E2 hanno il compito di regolare il livello di replicazione e di trascrizione dei geni virali, cioè possono promuovere o arrestare la trascrizione. La proteina E1 è un’elicasi, cioè ha il compito di scindere i legami a idrogeno tra i due filamenti del DNA per consentirne la trascrizione e la replicazione. La proteina E2, oltre ad essere essenziale per trascrizione e replicazione del genoma virale durante l’incapsidamento, garantisce la segregazione. In alcuni casi, per l’insorgenza di mutazioni, o per l’integrazione del genoma virale in quello dell’ospite, il gene codificante per la proteina E2 può subire inattivazione. Il problema è che se il gene E2 è represso, viene meno l’inibizione trascrizionale esercitata da E2 nei confronti di E6 ed E7. La conseguenza quindi è che i geni E6 ed E7 vengono espressi in grandi quantità e questo contribuisce alla progressione maligna in caso di HPV ad alto rischio (Pal et al., 2020; Santos-López et al., 2015).
• La proteina E4 regola l’espressione dei geni tardivi, presiede alla maturazione virale e al rilascio dei virioni (Santos-López et al., 2015).
• La proteina E5 è composta da 83 amminoacidi e si associa alla membrana del reticolo endoplasmatico della cellula ospite. Questa è considerata una proteina oncogena, poiché stimola una sovraespressione del recettore per il fattore di crescita epidermico (EGF-R), inibisce l’apoptosi virale attraverso la degradazione dei recettori Fas e aiuta le cellule cancerogene a sfuggire al controllo del sistema immunitario per progredire verso la malignità (Pal et al., 2020).
• Le proteine E6 ed E7 sono entrambe implicate nella deregolamentazione dei soppressori della crescita, provocando così una proliferazione incontrollata del virus. Nel caso della proteina E6, il target principale è il fattore p53, mentre la proteina E7 ha come principale obiettivo il fattore pRB. La proteina p53, con un peso molecolare di 53 kDa, è un soppressore tumorale, conosciuto anche come ‘’guardiano del genoma’’, che interviene in condizioni di stress per la cellula, come il danno ossidativo, per indurre apoptosi o arresto del ciclo cellulare, quando è necessario. La proteina E6, con l’aiuto della proteina EAP6, lega l’oncosoppressore p53, favorendone in questo modo l’ubiquitinazione e quindi la disgregazione via proteasoma. La perturbazione di p53 da parte di E6 induce una significativa proliferazione virale e può quindi predisporre allo sviluppo di diverse forme tumorali. Inoltre, la proteina E6, interagendo con proteine tipiche dell’immunità innata, contribuisce a garantire la persistenza virale, evadendo il sistema immunitario. Il fattore pRB, invece, è fondamentale per il controllo della transizione del ciclo cellulare dalla fase G1 alla fase S. Infatti, normalmente, quando la cellula non è pronta per entrare nella fase S, la proteina pRB resta legata ai fattori di trascrizione della famiglia E2F, per impedire ad essi di trascrivere precocemente i geni necessari per l’ingresso in fase S. Nelle cellule infette, E7 si lega a pRB, inducendo l’ubiquitinazione e di conseguenza la degradazione. Per questo motivo i fattori di trascrizione E2F vengono rilasciati da pRB e quindi sono in grado di promuovere la trascrizione dei geni necessari per l’ingresso prematuro della cellula in fase S, tra cui quelli che codificano per le cicline, portando quindi a un forte incremento della proliferazione virale (Pal et al., 2020; Santos-López et al., 2015).

Figura 3 - Meccanismo d'azione delle proteine E6 ed E7 - (Pal et al., 2020)

Classificazione

I Papillomavirus possono differire tra loro per il genotipo, cioè esistono 300 diversi genotipi attribuibili a questo virus, di cui 200 appartengono a HPV che possono essere dannosi per l’uomo. Confrontando la ORF L1 relativa a 118 diversi HPV, è stato possibile classificarli in generi, specie, tipi e sottotipi. In base al genere, gli HPV sono suddivisi in:

• → α-Papillomavirus comprendono 65 tipi di HPV, tra cui HPV 16, 18, 31, 33, ecc…
• → β-Papillomavirus comprendono 53 tipi di HPV, tra cui HPV 5, 9, 49, ecc…
• → γ-Papillomavirus comprendono 98 tipi di HPV, tra cui HPV 4, 48, 50, ecc…
• → μ (mu)-Papillomavirus comprendono 3 tipi di HPV, ovvero HPV 1, 63 e 204.
• → ν (nu)-Papillomavirus comprende un solo tipo di HPV, ovvero l’HPV 41.

Tra questi diversi generi, gli α-Papillomavirus sono quelli più comunemente implicati nello sviluppo del cancro provocato da HPV, che rappresenta il 5% di tutte le forme di cancro che insorgono a livello mondiale. Gli α-Papillomavirus sono ulteriormente suddivisi in tipi cutanei o mucosali, in base alla loro capacità di infettare le cellule epiteliali cutanee o le cellule dei tessuti più interni, rispettivamente. Ciascuna di queste due tipologie di α-Papillomavirus è ulteriormente suddivisa in sottotipi ad alto rischio e a basso rischio, a seconda della loro capacità di provocare il cancro alla cervice o lesioni precancerose, rispettivamente. Il gruppo 1, costituito dagli HPV a massimo rischio di cancerogenesi, comprende: HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 59. L’HPV 68, invece, appartiene al gruppo 2A ed è per questo considerato un probabile cancerogeno per l’uomo, anche se le evidenze a tal proposito sono limitate. Infine, c’è il gruppo 2B che, come stabilito dalla IARC (agenzia per la ricerca sul cancro), comprende tutti gli HPV che, per limitate evidenze epidemiologiche, potrebbero risultare cancerogeni per l’uomo. A questa categoria appartengono: HPV 26, 30, 34, 53, 66, 67, 69, 70, 73, 82, 85.