Tesi Valutazione dei sierotipi da HPV come fattore di rischio per la carcinogenesi

Scopo della tesi

Materiali e metodi

A 20-26°C (temperatura ambiente), poiché tutti i reagenti sono stabili a questa temperatura, fino alla data di scadenza indicata sulle etichette. Poly A Carrier e Proteinase K, una volta risospesi, devono essere conservati tra -18 e -22°C.

Protocollo di estrazione

Il materiale di partenza è rappresentato da campioni citologici, ovvero secrezioni vaginali, cervicali o uretrali, cellule della cavità orale o liquido seminale. Questi vengono raccolti con uno swab o con un piccolo spazzolino sterile e successivamente depositi in un contenitore sterile adatto al trasporto, contenente una soluzione fisiologica isotonica (PapilloCheck Sample Tube). Il contenitore viene quindi portato in laboratorio per l'estrazione del DNA.

Il campione può essere conservato da +2°C a +8°C e l'estrazione degli acidi nucleici deve essere effettuata entro le 48 ore (se non è fattibile entro le 48 ore, i campioni devono essere conservati da -20°C a -30°C).

μl diWorking Wash Buffer 2.

− Centrifugare a 6000 RCF per 1 minuto a temperatura ambiente.

− Gettare la soluzione contenuta nel tubo e centrifugare a 14.000 RCF per 3 minuti a temperatura ambiente.

− Gettare il tubo e inserire la colonnina in un nuovo tubo da microcentrifuga di 1,5 ml.

− Aggiungere 50 μl di Elution Buffer e incubare a temperatura ambiente per 1-2 minuti.

− Centrifugare a 13.000 RCF per 1 minuto a temperatura ambiente.

Dosaggio del DNA

Lo strumento utilizzato per il dosaggio del DNA prende il nome di ‘’QuBit 4.0 (codiceQ332266)’’ e la ditta produttrice è la ‘’Thermo Fischer Scientific’’. Questo strumento permette di dosare gli acidi nucleici, mediante rilevazione della fluorescenza emessa da uno specifico fluorocromo, che lega gli acidi nucleici in modo aspecifico.

Materiali necessari

− Tubi di reazione da 0,5 ml

− →QuBit Reagent (Reagente A) non deve essere esposto alla luce

Perché è fotosensibile?

QuBit Buffer - QuBit Standard (Standard 1 e Standard 2)

Protocollo di lavoro:

1. Accendere lo strumento inserendo il cavo nella presa elettrica (assicurarsi che non ci siano tubi all'interno).
2. Programmare lo strumento.
3. Preparare una provetta con la Working Solution, mediante l'aggiunta in un tubo di reazione di 0,5 ml, di QuBit Buffer e QuBit Reagente (Reagente A). Sono necessari 119 μl di Buffer e 1 μl di Reagente A per il numero di campioni da dosare (considerando anche i 2 standard), aggiungendo al volume ottenuto il 10% di esso (ad esempio se è necessario dosare un campione e i due standard, moltiplicare 119 μl di QuBit Buffer per 3,3 e 1 μl di Reagente A per 3,3). Invertire la provetta.
4. Preparare la provetta Standard 1, mediante l'aggiunta in un tubo di reazione di 0,5 ml, di 190 μl di Working Solution e 10 μl di QuBit Standard 1. Agitare tramite vortex.

per 2-3 secondi.

Preparare la provetta Standard 2, mediante l'aggiunta in un tubo di reazione di 0,5 ml, di 190 μl di Working Solution e 10 μl di QuBit Standard 2. Agitare tramite vortex per 2-3 secondi.

Preparare la provetta Campione, mediante l'aggiunta in un tubo di reazione di 0,5 ml, di 199 μl di Working Solution e 1 μl di campione. Agitare tramite vortex per 2-3 secondi.

Incubare gli Standard e i Campioni per 2 minuti a temperatura ambiente.

Avviare lo strumento QuBit.

Leggere la concentrazione del DNA, espressa in ng/μl, sia per i 2 standard che per il campione.

Procedure alternative

Una volta effettuati estrazione e dosaggio del DNA, è possibile ricorrere a 3 procedure alternative per l'identificazione dell'HPV. Due di queste procedure si basano sull'utilizzo di kit diagnostici rapidi in commercio e quindi sono ufficialmente valide; si parla quindi di procedure CE (certificate) IVD (in vitro diagnostic).

La procedura per la diagnosi di laboratorio delle malattie genetiche può essere eseguita utilizzando diverse tecniche. Una delle tecniche più comuni è la PCR (Polymerase Chain Reaction), che consente di amplificare una sequenza di DNA in modo esponenziale. Questo metodo richiede la denaturazione della doppia elica di DNA ad alte temperature, seguita dall'annealing di un oligonucleotide di innesco (primer) all'estremità del singolo filamento di DNA stampo. Successivamente, la Taq polimerasi sintetizza una nuova catena di DNA complementare.

Un'altra tecnica utilizzata è il sequenziamento diretto del DNA, che consente di leggere direttamente ogni base della sequenza genomica. Questa procedura è più classica e richiede più tempo, in quanto si parte dalla PCR e si arriva al sequenziamento diretto del DNA.

Per garantire una maggiore affidabilità dei risultati, è consigliabile sottoporre il campione ad almeno due delle procedure contemporaneamente.

La procedura classica per la diagnosi di laboratorio delle malattie genetiche comprende i seguenti step:

1. PCR
2. Elettroforesi su gel
3. EXOSAP
4. Reazione di sequenziamento
5. Purificazione della sequenza

La PCR è il primo step della procedura classica. Durante la PCR, la sequenza di DNA viene amplificata utilizzando un oligonucleotide di innesco (primer) e la Taq polimerasi.

Dopo la PCR, si procede con l'elettroforesi su gel, che consente di separare i frammenti di DNA in base alla loro dimensione.

Successivamente, si esegue l'EXOSAP, una reazione che rimuove gli oligonucleotidi di innesco e le basi libere non incorporate durante la PCR.

Dopo l'EXOSAP, si passa alla reazione di sequenziamento, che consente di determinare l'ordine delle basi nella sequenza di DNA.

Infine, si esegue la purificazione della sequenza, che rimuove eventuali impurità e prepara il campione per l'analisi finale.

Il filamento complementare ad esso.Ovviamente questo avviene sia sul filamento senso (a partire dall'estremità 3' con il primer Reverse), sia sul filamento antisenso (a partite dall'estremità 5' con il primer Forward). Per allestire una reazione di amplificazione è necessario preparare una MIXin una provetta da 1,5 ml, miscelando le seguenti quantità di reagenti: 10 μl di HotStarTaq Master Mix, 5,5 μl di acqua, 1μl primer Forward e 1 μl di primer Reverse. La MIX, quindi, contiene i primer Forward e Reverse relativi al gene che vogliamo amplificare ed è quindi necessario preparare tante MIX per quanti sono i geni da amplificare nel campione. Nel caso specifico della ricerca del genoma di HPV, i geni da amplificare sono: MY09, MY11, GP05 e GP06. I primer utilizzati per l'amplificazione sono appositamente costruiti in laboratorio grazie e sistemi bio-36In realtà, per essere sicuri che l'amplificazione sia

avvenuta correttamente, informatici. Oltre ad amplificare i geni di nostro interesse, si amplifica il Bianco, cioè un campione che contiene esclusivamente acqua (privo di DNA). Questo vuol dire che al momento della lettura del gel, se l'amplificazione è avvenuta correttamente, in corrispondenza del bianco non dovremo rilevare alcuna banda. La prova del Bianco si effettua relativamente ad ogni gene, per cui i reagenti di ogni MIX dovranno essere moltiplicati per 2,2 (2 per il campione e per il bianco + il 10%). Quindi complessivamente la MIX sarà composta da: 22μl di HotStar Taq Master Mix, 12,1 μl di acqua, 2,2 μl di primer Forward e 2,2 μl di primer Reverse. Una volta preparate le MIX, ciascuna di esse viene suddivisa in 2 provette da 0,2 ml. In una di queste provette aggiungeremo alla MIX il DNA del nostro campione; nell'altra provetta aggiungeremo l'acqua (prova del Bianco), per arrivare in entrambi i casi ad un volume finale di reazione di