Tesi: Studio dell eterocromatina costitutiva in Ophisurus serpens Actinopterygii Anguilliformes

R.M.CUMMINGSBandeggio C

Questa tecnica, messa a punto da Sumner nel 1972, permette di localizzare le regioni eterocromatiche presenti in un complemento cromosomico, la cui distribuzione e composizione è specie-specifica; l'eterocromatina che si evidenzia con questa tecnica è quella costitutiva e non quella facoltativa, come dimostrato da falliti tentativi di bandeggio sul cromosoma X inattivo nelle femmine dei mammiferi. L'eterocromatina costitutiva non decondensa durante l'interfase ed è costituita da DNA altamente ripetuto. Sui cromosomi le bande C positive appaiono come regioni intensamente colorate. La dimensione, il numero, la posizione delle bande (centromerica, pericentromerica, interstiziale o terminale) facilitano il riconoscimento e l'appaiamento degli omologhi.

La tecnica si basa su un trattamento alcalino a caldo dei vetrini, una incubazione in una soluzione salina a caldo e infine la colorazione con colorante di Giemsa o di Wright.

È ancora del tutto chiaro il meccanismo d'azione; probabilmente le regioni eucromatiche vengono denaturate e quindi estratte, e per questo risultano più chiare (non colorate) dopo colorazione di Wright, mentre l'eterocromatina è più difficile da estrarre a causa del più stretto legame delle proteine al DNA altamente ripetuto, e appare quindi fortemente colorata. Bandeggio con endonucleasi di restrizione. La digestione con endonucleasi di restrizione è particolarmente utile per lo studio dei cromosomi dei pesci su cui non sempre, probabilmente a causa della struttura stessa della cromatina, è possibile ottenere risultati con altri metodi di bandeggio, come il bandeggio G. Essi sono molto utilizzati perché permettono di mettere in evidenza diverse classi di eterocromatina in base alla risposta all'attacco degli enzimi, permettendo quindi di ricavare interessanti informazioni sulla distribuzione e struttura dell'eterocromatina.

Si differenziano quindi dal bandeggio C che localizzando tutta l'eterocromatina costitutiva non permette di fare ipotesi sulla composizione della stessa.

Essi catalizzano il taglio di entrambi i filamenti del DNA in corrispondenza di specifiche sequenze di basi, di solito 4, 5 o 6 basi, dette "target" dell'enzima, spesso palindromiche (viene definita palindrome una regione in cui sono presenti due porzioni di DNA con questa caratteristica: la sequenza letta da destra a sinistra presente su una porzione, è uguale alla sequenza letta da sinistra a destra dell'altra porzione).

A causa della loro stretta specificità di sequenza, le endonucleasi di restrizione sono diventate indispensabili reagenti in biologia molecolare. La prima applicazione delle E.R. sui cromosomi metafasici risale a Lima De Faria et al. (1980), da quel momento il bandeggio con endonucleasi di restrizione è stato usato molto estesamente e in particolare si è dimostrato

capace di differenziare diverse classi di eterocromatina. Gli enzimi prendono il nome dagli organismi, di solito batteri, dai quali sono ottenuti; la prima lettera (maiuscola) è l'iniziale del genere, la seconda e la terza sono le prime due lettere del nome della specie. Se utilizzati su cromosomi metafasici, tali enzimi sono in grado di produrre un bandeggio in molti casi coincidente con la localizzazione di specifici DNA altamente o moderatamente ripetitivi. Il tipo di bandeggio ottenuto è specifico per ciascun enzima e può risultare simile alle bande C o G. La colorazione successiva al trattamento con l'enzima evidenzia regioni colorate e regioni chiare. In queste ultime la diminuzione di colorabilità è da attribuire all'attività enzimatica con conseguente rimozione di frammenti di DNA di varia lunghezza. Le regioni cromosomiche che rimangono intensamente colorate dopo la digestione del DNA con E.R., al contrario, dovrebbero essere

o n t e n e r e se q u e n z e n u c l e o t i d i c h e c h e n o np r e s e n t a n o i l s i t o d i riconoscimento specifico o lo presentano in frequenza moltobassa. Si suppone che i frammenti di DNA di dimensioni pari a 100 coppie di basi sistacchino prontamente dai cromosomi mentre frammenti più grandi di 1000 coppie dibasi potrebbero non essere rimossi. Altri fattori come la particolare struttura dellediverse regioni cromosomiche e la struttura degli enzimi stessi potrebbero influenzarne ladigestione in situ.

Gli enzimi più utilizzati per la digestione in situ sono: Alu I (sito di taglio: AG CT), Hae III (GG CC), Hinf I (G ANTC), Msp I (C CGG) e Dde (C TNAG).

Negli Anguilliformi il bandeggio con endonucleasi di restrizione ha permesso ladifferenziazione del cariotipo delle due anguille atlantiche (Salvadori et al.,1997) e lacaratterizzazione del cariotipo delle murena mediterranea (Salvadori et al.,1997).

Materiali e Metodi

Colture di sangue.È

È stato utilizzato un esemplare di O. serpens, proveniente dalla peschiera di Fera xi e tutt'ora presente in acquario di cui, perciò, non è stato possibile determinare il sesso.

I preparati cromosomici sono stati ottenuti tramite l'allestimento di colture cellulari di linfociti. Gli esemplari sono stati anestetizzati in acqua di mare contenente MS222 (SIGMA) (0,02%) ed è stato effettuato un prelievo di sangue dall'arteria dorsale mediante una siringa eparinata; quattro/cinque gocce di sangue intero sono state incubate in un terreno di coltura composto da:

• 8 ml di RPMI 1640 (GIBCO);
• 2 ml di siero bovino fetale (GIBCO);
• 0,1 ml di penicillina-streptomicina (GIBCO);
• 0,1 ml di fitoemoagglutinina (M GIBCO);
• 0,1 ml di L-glutammina 200 mM, (GIBCO).

Le cellule sono state incubate a 28°C per 72 ore, quindi è stata aggiunta Colcemid GIBCO ad una concentrazione finale di 0,12 μg/ml per 1 ora e mezza, per bloccare le

cellule in metafase mitotica. Le colture sono state centrifugate a 1200rpm per 6 minuti e sottoposte a shock ipotonico con KCl 0,075 M a 32 °C per 30 min,per rompere le membrane cellulari. I preparati sono stati quindi centrifugati a1000 rpm per 6 minuti e, dopo aver aspirato il surnatante, il pellet è stato fissatosecondo il metodo Terzoli, che prevede l'uso in successione di tre reagenti:

• miscela di Ibraimov (92 ml H 0 distillata, 3 ml di alcool metilico, 5 ml di2acido acetico);
• alcool metilico puro;
• fissativo di Carnoy (metanolo e acido acetico glaciale, in rapporto di 3:1).

Dopo ogni passaggio i preparati sono stati centrifugati a 1200 rpm per 6 minutied è stato eliminato il surnatante.

Per allestire i vetrini, sono state fatte cadere due o tre gocce del preparato,con una pipetta Pasteur, su un vetrino portaoggetti. I vetrini sono poi statiosservati al microscopio ottico per la ricerca delle piastre metafasiche. 19Bandeggio C.

particolare è stata seguita la seguente procedura:

1. I vetrini da trattare sono stati invecchiati almeno 7 giorni in essiccatore;
2. Successivamente sono stati immersi per un tempo compreso tra i 3-5 minuti a temperatura ambiente in HCI l N, dopo di che sono stati risciacquati con acqua distillata (3-5 min.) e asciugati all'aria e con carta bibula;
3. I vetrini sono stati immersi in una soluzione satura di Ba(OH) (5% in H202 distillata), a 50°C o 30°C (è stato confermato sperimentalmente che in Ophisurus serpens il bandeggio C è riscontrabile in entrambi i casi), per tempi variabili da 3 a 5 minuti. Sulla soluzione di Ba(OH) filtrata, si forma una patina di Ba che va eliminata con carta bibula, prima di immergere i vetrini.
4. Dopo l'incubazione in Ba(OH), i vetrini sono stati immersi in HCI 0.1 N, per eliminare l'idrossido di Ba, poi in H 0 distillata e infine fatti asciugare all'aria;
5. I vetrini sono poi stati incubati in 2xSSC per 1 ora a 60°C,

Risciacquati con acquadistillata e fatti asciugare all'aria;

Infine i vetrini sono stati colorati con colorante di Wright per 10-12 minuti.

Il trattamento con idrossido di bario produce ottimi risultati ma è lo stadio critico della procedura, infatti un trattamento prolungato può produrre l'eccessiva denaturazione del DNA, colorazione pallida dei cromosomi e progressiva perdita delle bande C. Bandeggio con Endonucleasi di restrizione.

Circa 30 unità di HaeIII (INVITROGEN) (sito di taglio: GG CC) sono state sciolte in tampone specifico. I vetrini, invecchiati a temperatura ambiente per circa 7 ore, sono stati incubati con questa soluzione a 37°C per 16 ore. I vetrini di controllo sono stati trattati con il tampone di incubazione in assenza di enzima nelle stesse condizioni.

I vetrini sono stati poi colorati con il colorante di Wright e osservati in un microscopio Zeiss Axiophot. Le piastre metafasiche sono state acquisite con una fotocamera analogica e

analizzate con il software Cromowin System(TESI imaging) per la costruzione dei cariogrammi. Sono stati utilizzati 8 cariogrammi per l'analisi del pattern di bandeggio di 20 pattern di bandeggio che è stato poi rappresentato graficamente nell'ideogramma della specie e confrontato con il pattern di bandeggio C. Colorazione di Wright. La polvere di Wright è stata sciolta in alcool metilico (0,25 g/100 ml); dopo la completa solubilizzazione del colorante, la soluzione è stata mantenuta per 48/72 ore a 37°C, quindi è stata diluita 1:3 in tampone fosfato 1/15 M (KH2PO4 + 24NaHPO4) a pH 6.8 per 8 min. e utilizzata per colorare i vetrini. Risultati e Discussione Risultati. Il numero cromosomico diploide di O. serpens è 2n=38. Il cariotipo della specie è costituito da 11 coppie di cromosomi metacentrici e da 8 coppie di submetacentrici. Allo scopo di caratterizzare la struttura e la

distribuzione delle regioni eterocromatiche, sulle piastremetafasiche sono state applicate due diverse tecniche: il bandeggio C e la digestione in situcon l' endonucleasi di restrizione HinfI. Nel cariogramma i cromosomi sono stati disposti inordine di lunghezza decrescente (Fig. 1).

Bandeggio C.Questa tecnica ha messo in evidenza bande centromeriche in tutti i cromosomi delcomplemento, inoltre alcuni di essi presentano ampie bande paracentromeriche (Fig. 1).

In particolare, la coppia 1 presenta una larga banda paracentromerica in entrambi i bracci,mentre nelle coppie 2, 3, 6 e 7 la banda paracentromerica sul braccio corto è più estesa diquella sul braccio lungo e nella coppia 5 la banda sul braccio lungo è più estesa di quellasul braccio corto. oSul braccio corto della coppia n 9 è stata in precedenza localizzata, in posizione distale,la regione organi