Tesi in Culture cellulari vegetali

PROPAGAZIONE CLONALE

L’attività di numerosi fattori di trascrizione (FT) è

coinvolta nella riprogrammazione della totipotenza necessaria

per indurre eventi di organogenesi e/o embriogenesi somatica

(Clark et al.,1996).

Tra questi rientrano di distinte tre classi geniche:

i) Alla prima classe, che regola la fase morfogenetica,

appartengono geni quali WUSCHEL (WUS), SHOOT

MERISTEMLESS (STM), SHORT-ROOT e SCARECROW che

sono essenziali per la formazione dei meristemi apicali sia

radicale sia caulinare;

ii) La seconda classe comprende fra gli altri, i geni

ABSCISIC ACID INSENSITIVE3 (ABI3), ABI4 e ABI5, che

agiscono sulla maturazione del seme.

iii) Altri geni, LEAFY COTYLEDON1 (LEC1), LEAFY

COTYLEDON1-LIKE (L1L), LEC2 e FUSCA3, raggruppati in un

terzo gruppo, controllano soprattutto gli eventi di

embriogenesi somatica (Vernoux et Traas.,2000 et

Fleming.,2005).

In Arabidopsis durante lo sviluppo embriogenetico il

gene WUS si esprime prima dello stabilirsi della nicchia di

cellule staminali nell’apice caulinare.

Il gene STM è un gene KNOX associato all’attività

meristematica del domo apicale insieme ai geni KNAT1 e

KNAT2. STM agisce in un meccanismo d’inibizione

dell’espressione di ASYMMETRIC LEAVES 1; ASI1 si esprime

nei primordi fogliari, dove reprime l’espressione di KNAT1 e

KNAT2 (Howell.,1998.)

I geni WOX svolgono ruoli importanti nelle prime fasi

dell’embriogenesi somatica. WOX2 e WOX9 sono quelli più

espressi, sono definiti geni d’identità embrionale.

In Arabidopsis WOX5 and WUS si esprimono prima dei geni

d’identità embrionale (Frlim et al.,2003 et Di Lauro et

al.,2008). Lo sviluppo del seme nelle piante dicotiledoni può

essere suddiviso in tre fasi principali:

i) La morfogenesi, che va dalla fecondazione al termine

della fase di crescita per divisione cellulare;

ii) La fase di maturazione, in cui sono sintetizzati le

sostanze di riserva, quali amido, lipidi e proteine;

iii) L’embriogenesi tardiva, che è caratterizzata dalla

disidratazione del seme, l’inibizione della germinazione

prematura e la dormienza.

Nella fase morfogenetica i geni LEC sono richiesti per

il mantenimento dell’identità cellulare del sospensore e dei

cotiledoni. I mutanti LEC, presentano un sospensore in grado

di andare in contro a una serie di divisioni cellulari, originando

un’anomala struttura a più strati cellulari invece della classica

fila a sei-otto cellule normalmente presente in Arabidopsi.

Tale anomalia nella divisione cellulare dà origine a embrioni

secondari che possono presentare sulla superficie adassiale

delle foglie dei tricomi che, in Arabidopsis, sono

caratteristici delle foglie adulte. Si assiste quindi alla

comparsa di un’anatomia dei cotiledoni intermedia tra quella

di una foglia embrionale ed una foglia adulta. I geni LEC sono

pertanto richiesti per la specificazione dell’identità degli

organi (Fleming.,2005).

L’espressione ectopica di LEC1 è sufficiente ad indurre la

formazione di embrioni somatici sulla superficie adassiale

delle foglie (Savona et al.,2012).

Tali osservazioni suggeriscono che quando nelle cellule

somatiche si riattiva l’espressione di geni che codificano per

proteine di tipo LEAFY COTYLEDON, è possibile ottenere una

drastica riprogrammazione del destino cellulare che culmina

nell’induzione di embrioni somatici (Koltunow et al.,2003).

Quindi, la capacità di LEC1 di indurre sia la fase

morfogenetica sia la fase di maturazione e di sopprimere lo

sviluppo vegetativo fa supporre che esso stabilisca un

ambiente cellulare idoneo allo sviluppo dell’embrione.

Lo sviluppo embrionale è controllato oltre che dai geni della

classe LEC (LEC1, LEC2 e FUS3) anche dagli ormoni. Infatti,

durante lo sviluppo embrionale l’incremento dei livelli endogeni

di acido abscissico inibisce la germinazione precoce, mentre

l’incremento della concentrazione delle gibberelline (GA)

interrompe la dormienza indotta dall’ABA.

A livello molecolare le GA e l’ABA influenzano l’espressione di

molti geni.

Per esempio i fattori di trascrizione LEC interagiscono

direttamente con geni coinvolti nella risposta all’ABA. In

particolare FUS3 può coordinare l’azione ABA/GA

nell’embriogenesi e, con un meccanismo a feedback, questi due

ormoni regolano la stabilità della proteina FUS3 (Koltunow et

al.,2003). CAPITOLO 5

GLI ORMONI VEGETALI

Gli ormoni vegetali sono coinvolti nei processi di

differenziamento e morfogenesi, quindi nel caso delle colture

in vitro la loro presenza è fondamentale. Sono definiti

messaggeri chimici e, prodotti in una specifica cellula o

tessuto, modulano i processi cellulari di un'altra cellula

interagendo con proteine specifiche definite recettori.

Gli ormoni vegetali sono molecole organiche a basso

peso molecolare, attive a concentrazioni micromolari. Possono

essere prodotte in organi differenti della stessa pianta ed

agire anche nello stesso sito di produzione. I fitormoni sono

composti capaci di regolare lo sviluppo e la differenziazione

nelle piante sia in vivo sia in vitro, svolgendo funzioni di

stimolatori e/o inibitori, a seconda del tessuto o organo

bersaglio.

Essi agiscono nella dormienza e germinazione dei semi,

nell’accrescimento, nella lignificazione, nella fioritura nella

fruttificazione (Taiz et al.,1996).

I regolatori di crescita più utilizzati nelle colture in

vitro sono le auxine e le citochinine, mentre meno usati sono

le gibberelline e l’acido abscissico.

Le auxine promuovono la formazione degli apici radicali

(rizogenesi),stimolano l’embriogenesi somatica e inibiscono lo

sviluppo delle gemme laterali.

Le citochinine invece, stimolano la divisione cellulare, lo

sviluppo delle gemme laterali, inducono la caulogenesi e

inibiscono la rizogenesi.

Le citochinine naturali più impiegate nelle colture in vitro

includono la zeatina e la 2-isopenteniladenina (2iP), spesso,

comunque si ricorre a citochinine sintetiche quali la BAP (6-

benzilaminopurina) e la chinetina per i costi più contenuti e la

loro maggiore stabilità.

5.1 AUXINA: L’ormone della crescita

L’Auxina è stata la prima molecola ormonale ad essere

scoperta e la forma di auxina più comune è l’acido indol-3-

acetico (IAA), sintetizzato nei meristemi apicali dei germogli

e nelle giovani foglie. Essa è sintetizzata dall’amminoacido

triptofano, attraverso tre principali vie metaboliche:

i) La via TAM detta anche via della triptammina è presente

in molte specie vegetali compresa Arabidopsis. Essa inizia con

la decarbossilazione del triptofano per formare TAM; una

serie di reazioni enzimatiche converte la triptammina in indol-

3-acetaldeide (IAAId) che quindi è ossidata da una specifica

deidrogenasi in IAA.

ii) La via IPA, via dell’acido 3-indol piruvico nella quale il

triptofano è dapprima deamminato per formare IPA e poi

decarbossilato per formare IAAId.

iii) La via IAN, via del 3-indolacetonitrile, il triptofano è

prima convertito in indol 3-acetaldossima (IAOx) e poi in

IAN, dopo di che l’enzima nitrilasi converte il composto IAN

in IAA. In Arabidopsis sono stati identificati quattro geni che

codificano per l’enzima nitilasi, dal NIT1 al NIT4 (Taiz et

al.,1996).

Per quanto riguarda la localizzazione cito-istologica,

circa un terzo dell’IAA è presente nel cloroplasto mentre il

resto è localizzato nel citosol.

Nelle piante l’auxina si muove dal luogo di sintesi verso

l’apparato radicale attraverso un trasporto polare, portando

così alla formazione di un gradiente di auxina. Il trasporto

polare avviene in cellula parenchimatiche associate al tessuto

vascolare nella radice e nel fusto, anche se un altro trasporto

basipeto si trova nei tessuti epidermici e corticali della

radice.

Il trasporto dell’auxina avviene secondo due modalità:

l’assorbimento/influsso e l’eflusso. Secondo il modello

chemiosmotico, proposto da Jacobs e Gilbert (1983) la forza

protonica motrice (ΔE+ΔpH) attraverso la membrana

plasmatica è responsabile dell'ingresso di auxina nella cellula,

mentre il suo efflusso dipende solo dal potenziale di

membrana, ΔE.

La caratteristica principale del modello di trasporto polare è

che i carriers responsabili dell'efflusso dell’ormone sono

localizzati solo nella parte basale delle cellule della guaina del

fascio. L'auxina è l'ormone coinvolto nella risposta fototropica

e gravitropica delle piante oltre che nella crescita per

distensione delle cellule.

Essa regola anche la dominanza apicale, la fillotassi, lo

sviluppo del meristema fiorale e la formazione delle radici

laterali ed avventizie.

(Abel.,1996 et Aducci et al.,1995 et Ottenschlager et

al.,2003).

5.2 GIBBERELLINE: regolatori dell’altezza delle piante e della

germinazione del seme

Le Gibberelline (GA) sono composti terpenici prodotti

dai funghi e dalle piante superiori e rappresentano una grande

famiglia che conta più di 125 molecole (MecMillan.,2002 et

Olszewski et al.,2002).

I composti terpenici sono formati da unità isopreniche a

cinque atomi di carbonio, uniti con legami testa-coda. Le GA

sono terpenoidi formati da quattro unità isopreniche. La loro

biosintetica può essere suddivisa in tre stadi, ognuno

presente in un comparto cellulare differente:

i) Nello stadio 1, che avviene nei plastidi, 4unità isopreniche

si assemblano per formare una molecola lineare a 20 atomi di

carbonio, il geranilgeranil difosfato che poi è convertito in

ent-kaurene.

ii) Nello stadio 2, che avviene nella membrana plastidiale e

nel reticolo endoplasmatico l’ent-kaurene è convertito in

GA12.

iii) Nello stadio 3, che avviene nel citosol, la GA12 e

convertita in GA1. Nelle piante superiori le GA sono prodotte

nei meristemi apicali e laterali del fusto, nelle giovani

foglioline, negli embrioni e nel seme. Le gibberelline

esercitano la loro azione su una grande varietà di processi di

sviluppo, oltre all'allungamento del fusto, possono stimolare

l'accrescimento del fusto delle piante nane. Sono coinvolte

nella transizione dalla fase giovanile a quella adulta e nella

formazione dei fiori (Hedden et al.,2000 et

Rademacher.,2000)

5.3 CITOCHININE: regolatore della divisione cellulare

Le Citochinine sono state scoperte durante la ricerca di

fattori che stimolassero la divisione delle cellule vegetali in

vitro. Fin da quando sono state scoperte, hanno dimostrato di

avere effetto su molti