Tesi - Flusso genico da colza geneticamente modificata a senape nera per la valutazione del rischio di inquinamento genetico

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MODENA E REGGIO EMILIA

Facoltà di Agraria

Corso di Laurea Specialistica in Biotecnologie Vegetali

TESI

FLUSSO GENICO DA COLZA (BRASSICA NAPUS)

GENETICAMENTE MODIFICATA A SENAPE NERA (BRASSICA

PER LA VALUTAZIONE DEL RISCHIO DI

NIGRA) INQUINAMENTO GENETICO

Dissertazione di laurea di:

Marco Rivi

Matr. n. 14131

Relatore: Chiar. mo Prof. Giovanni Dinelli

Correlatore: Chiar. ma dott.ssa Ilaria Marotti

Anno Accademico 2006/2007

INDICE

1. INTRODUZIONE 3

3

1.1 IL COLZA COME COLTURA 3

1.1.1 Inquadramento sistematico 3

1.1.2 Origine del colza 4

1.1.3 Prodotti ottenuti dal colza 6

1.1 .4 Aree di produzione a livello mondiale, europeo ed italiano 9

1.1.5 Obiettivi del miglioramento genetico 10

1.1.6 Colza GM e varietà ottenute 11

1.1.7 Colza Bt 14

1.1.8 Tecniche di trasformazione genetiche

1.2 PRODUZIONE DI VARIETÀ VEGETALI GENETICAMENTE 16

MODIFICATE IN EUROPA E IN ITALIA: ASPETTI LEGISLATIVI 16

1.2.1 Legislazione europea e colture GM 17

1.2.2 La situazione italiana 19

1.2.3 Possibili rischi per l’ambiente 19

1.3 COLZA E FLUSSO GENICO 19

1.3.1 Definizione di flusso genico 21

1.3.2 Metodi per misurare il flusso genico verticale 21

1.3.3 Caratteristiche del colza che favoriscono il flusso genico verticale 22

1.3.4 Dispersione del polline di B. napus 25

1.3.5 Dispersione dei semi di B. napus 26

1.3.6 Flusso genico dal colza e sue implicazioni

1.4 VALUTAZIONE DEL FUSSO GENICO DA B. NAPUS A SPECIE 29

SELVATICHE AFFINI 29

1.4.1 Fattori che favoriscono l’incrocio interspecifico 31

1.4.2 Probabilità di incrocio tra B. napus e specie affini 34

1.5. BRASSICA NIGRA 34

1.5.1 Origine della coltura, caratteri botanici e ciclo colturale 35

1.5.2 Impieghi di B. nigra 35

1.5.3 Compatibilità sessuale tra B. napus e B. nigra

2

2 OBIETTIVI 37

3 MATERIALI E METODI 38

38

3.1 ALLEVAMENTO, GERMINAZIONE E DETERMINAZIONI

MORFOLOGICHE 38

3.1.1 Materiale vegetale 38

3.1.2 Allevamento dei parentali 39

3.1.3 Schema di incrocio ed allevamento della progenie di B. nigra 40

3.1.4 Analisi morfologiche 41

3.2 ANALISI MOLECOLARI 41

3.2.1 Estrazione del DNA 42

3.2.2 Quantificazione del DNA 42

3.2.3 Reazione a catena della polimerasi (PCR) 43

3.2.4 Elettroforesi e analisi dei prodotti di amplificazione 43

3.2.5 Specificità dei primer 44

3.2.6 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Elisa)

4 RISULTATI 45

45

4.1 Germinazione degli ibridi F1 47

4.2 Caratteristiche morfologiche dei parentali e degli ibridi 51

Flusso del transgene (gene per la tossina Cry1Ac) negli ibridi F1

4.3 53

4.4 Espressione della tossina Bt Cry1Ac degli ibridi F1

5 CONCLUSIONI 56

6 BIBLIOGRAFIA 60

3

1. INTRODUZIONE

1.1 IL COLZA COME COLTURA

1.1.1 Inquadramento sistematico

Il colza (Figura 1) appartiene alla famiglia delle Brassicacee o Crucifere, che si

compone di circa 375 generi. Tra questi il genere annovera al suo

Brassica

interno 100 specie, di cui alcune di

notevole importanza economica, tra cui

appunto var. oleifera, nota

Brassica napus

con il nome comune di colza. Si ritiene

che tale coltura sia originaria del

Mediterraneo occidentale in seguito ad

ibridazione tra due specie diploidi,

e

Brassica oleracea Brassica rapa.

Attualmente sono note diverse specie

affini al colza, sia appartenenti al genere

che a generi ad esso correlati.

Brassica, Figura 1. Tavola botanica di B.

Alcune di esse sono coltivate, mentre altre napus.

sono considerate delle infestanti nei

sistemi agrari o piante spontanee al di fuori delle zone coltivate. E’ noto che esse

siano parzialmente o completamente isolate da barriere di incompatibilità di varia

misura. All’interno del genere il grado di ibridazione interspecifica

Brassica,

deve essere considerato alla luce delle relazioni genetiche fra tre specie diploidi

di base (B. e e tre allotetraploidi (B.

nigra, B. oleracea B. rapa) carinata, B.

e derivate da esse attraverso incrocio nel corso dell’evoluzione

juncea B. napus),

(DoE, 1994). Queste relazioni sono state illustrate da U (1935) e rappresentate dal

triangolo di U (Gill e Vear, 1966). Inoltre sono state confermate anche di recente

tramite analisi molecolare (Erickson 1983; Warwick e Black, 1991). Tra le

et. al.,

specie compatibili con si annoverano anche quelle appartenenti a generi

B. napus

correlati, con i quali è risultata possibile l’ibridazione (ad es. Raphanus

raphanistrum, Hirschfeldia incana, Sinapis arvensis).

1.1.2. Origine del colza

Il colza allo stato spontaneo era presente in Europa, nel bacino del Mediterraneo e

4

in India. La sua domesticazione insieme al ravizzone ebbe inizio quando il suo

seme, rinvenuto come malerba nei seminativi dei cereali, cominciò ad essere

apprezzato per il suo elevato contenuto in oli, in particolare nelle zone dove non

era ancora diffuso l’olivo.

A causa della difficoltà a distinguere i semi di ravizzone e colza poco si sa circa

la distribuzione geografica distinta per ciascuna coltivazione. Le prime notizie

certe relative all’utilizzo del colza come coltura sono contenute in alcuni scritti

sanscriti indiani, risalenti ad un periodo di tempo compreso tra il 1500 e il 200

a.C. E’ provato che l’Olanda alla fine del ‘700 era l’unico Paese europeo che

coltivava colza da granella. La coltura si diffuse quindi in Germania e poi nel

resto dell’Europa. In Canada, uno degli attuali maggiori esportatori mondiali, la

coltura fu introdotta negli ultimi 40 anni, poiché il suo olio era utilizzato come

lubrificante per i motori marini. Successivamente la seconda guerra mondiale

cambiò in maniera drastica la situazione colturale in diverse parti del mondo: in

Europa, ad esempio, la coltivazione si espanse ulteriormente in seguito alla

generale carenza di olio avutasi in quegli anni.

Figura 2. Aree di origine (in rosso) e di attuale coltivazione del colza (in verde).

1.1.3. Prodotti ottenuti dal colza

Il colza è prevalentemente coltivato per la produzione di olio. Tuttavia, sia il

contenuto in olio, sia la sua composizione variano molto a seconda delle

condizioni ambientali e delle varietà impiegate. Per le migliori varietà si aggira

intorno al 40-45% della sostanza secca del seme intero. Dopo l’estrazione

dell’olio rimane la farina, ricca in fibra e di elevato valore biologico poiché ricca

5

in lisina e in generale di composizione aminoacidica ben equilibrata. Ciò la rende

consigliabile per uso zootecnico. Nonostante ciò l’utilizzo dei prodotti ricavati dal

colza per l’alimentazione umana e animale è stato fortemente limitato nel corso

del tempo dalla presenza nel seme di due sostanze tossiche: l’acido erucico,

presente nella frazione lipidica, e i glucosinolati, contenuti nella farina.

Esperimenti condotti su animali di

laboratorio hanno provato che il

consumo di acido erucico è associato

al manifestarsi di malattie cardiache,

poiché tende ad accumularsi proprio

nel muscolo cardiaco. E’ stato anche

dimostrato che i glucosinolati possono

causare disfunzioni della tiroide. Figura 3. Olio di colza destinato al

Questi problemi sono stati risolti negli consumo umano.

ultimi decenni tramite il

miglioramento genetico. I breeder hanno selezionato diverse cultivar di colza,

ognuna delle quali è destinata ad un preciso utilizzo. Alcune varietà denominate a

“doppio zero” hanno infatti un bassissimo tenore in acido erucico e in

glucosinolati, per cui i prodotti da esse ricavati possono essere utilizzati

nell’alimentazione umana e animale. Recentemente si è verificato un

sorprendente cambiamento di tendenza, poiché in seguito alle nuove ricerche

svolte nel campo della “nutraceutica” è stato scoperto il ruolo benefico di alcune

classi di glucosinolati sulla salute umana. Per tale ragione, non è escluso che tra i

nuovi obiettivi del miglioramento genetico per questa coltura ci sia proprio la

reintroduzione di tali composti nelle varietà destinate al consumo umano. L’olio

di colza, opportunamente depurato e raffinato, risulta privo di odore e di gusto,

simile a quello di soia; generalmente è venduto come miscela insieme a oli

estratti da semi di diverse specie (arachide, girasole, ecc..) (Figura. 3). I problemi

relativi alla composizione dell’olio non sono però del tutto risolti. Vi è ancora

quello rappresentato dall’acido linolenico. Tale acido grasso si decompone

facilmente a temperature elevate e limita l’utilizzazione alimentare dell’olio alle

insalate e ai condimenti crudi. Questo componente, presente anche in altri oli

vegetali non è stato riconosciuto come dannoso, ma rende l’olio poco adatto alla

frittura poiché dalla sua decomposizione si sviluppano composti aromatici che

con il loro odore caratteristico alterano il gusto degli alimenti. Come già

6

ricordato, la farina disoleata priva di glucosinolati può essere impiegata per

l’alimentazione animale. Non è però escluso che in futuro possa essere destinata

in più larga misura all’alimentazione umana. Un altro impiego dell’olio di colza

si ha nell’industria non alimentare, ad esempio nella produzione di cosmetici,

detergenti, lubrificanti, coloranti e materie plastiche (Figura. 4).

In questo settore sono preferibili varietà

ad alto tenore di acido erucico, grazie

alle specifiche proprietà chimico-

fisiche di questo composto. Infatti molti

materiali plastici biodegradabili sono a

base di erucamide (amide dell’acido

erucico). Degna di nota è l’applicazione

Figura 4. Lubrificanti e detergenti a fini energetici dell’olio di colza come

ottenuti dall’olio di colza. carburante. Le migliori performance si

ottengono in seguito alla sua trasformazione in estere metilico, perché l’utilizzo

tal quale nei motori diesel comporta degli inconvenienti come deposito, usura

eccessiva, viscosità.

1.1.4. Aree di produzione del colza a livello mondiale, europeo ed italiano

Le superfici coltivate di colza a livello mondiale sono aumentate in maniera

piuttosto continua nel corso degli anni ’90, raggiungendo il massimo nel 1999 per

poi diminuire nel triennio successivo fino ai 22 milioni di ettari del 2002. I primi

produttori mondiali sono Cina e UE che, con quote quasi uguali, concentrano il

60% dei volumi complessivi. Gli scambi internazionali rappresentano circa il

28% della produzione globale; il commercio dei semi di colza è in mano al

Canada che esporta oltre la metà della semente scambiata a livello mondiale,

mentre una quota rilevante della domanda internazionale proviene da due paesi

asiatici: Giappone e Cina.

Il colza in Europa

In ambito europeo, il colza occupa un posto di rilievo rispetto alle altre colture da

olio. E’ infatti dal ’95 che risulta essere la coltura oleaginosa più diffusa, poiché

occupa ben il 60% delle superfici e quasi i 3/4 delle produzioni comunitarie di

semi oleosi. Questa coltura è presente prevalentemente in Germania e in Francia,

mentre la restante produzione è affidata ad altre nazioni comunitarie nord-

7

orientali, in cui la coltura è ben adattata, come Polonia, Gran Bretagna,

Repubblica Ceca, Danimarca e Svezia. L’andamento delle superfici ricalca

quanto detto a livello mondiale. Nella Figura 5 si può osservare come le semine

siano aumentate fortemente fino al 1999. Questo fenomeno è stato causato

dall’introduzione sul mercato di nuove varietà, che hanno favorito la sostituzione

del girasole con il colza.

6 18

16 tonnellate

5 14

ettari 4 12

10

di 3 8 di

Milioni 2 6 Milioni

4

1 2

0 0

1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

Superfici Produzioni

Figura 5. Superfici, produzioni e rese di colza nell’Unione Europea dal 1991 al

2006 (fonte: Elaborazioni DEPAA su dati Eurostat).

Il colza in Italia

La situazione italiana si discosta nettamente da quella europea, poiché nel nostro

paese il colza è coltivato solo su 5200 ettari. Tale superficie rappresenta lo 0,2%

delle superfici comunitarie e solo l’1% delle colture oleaginose del nostro paese.

In Italia la coltivazione del colza ha avuto un forte incremento dopo la riforma

Mac Sharry, per poi diminuire dal 1998, con perdite medie annue di circa 11.000

ettari (Figura 6). Questo calo è stato, almeno in parte, causato dalle modifiche

della Politica Agricola Comunitaria introdotte con Agenda 2000. L’aiuto per le

colture oleaginose, quindi anche per il colza, è stato infatti ridotto da 81,74 a

63,00 euro per tonnellata (-23%), mentre quello per i cereali è stato aumentato da

54,34 a 63,00 per tonnellata (+16%). Queste modifiche, unitamente alla minor

produttività del colza rispetto ai cereali hanno inevitabilmente scoraggiato la

coltivazione di questa Brassicacea (A.A.V.V., 2004).

8

140

120 tonnellate

100

ettari 80

di di

Migliaia 60 Migliaia

40

20

0 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

Migliaia di ettari Migliaia di tonnellate

Figura 6. Superfici, produzioni e rese di colza in Italia dal 1991 al 2006 (fonte:

Elaborazioni DEPAA su dati Eurostat)

Nella nostra penisola, la diffusione della coltura è ineguale nelle diverse aree

geografiche. Infatti nel 2003 le semine del colza sono state effettuate per un terzo

nelle regioni nord occidentali, caratterizzate da una discreta resa media, e per un

terzo nelle regioni del centro Italia, le cui rese risultano essere invece le più basse

a livello nazionale. Nella Figura 7 si può osservare come il calo delle semine di

colza nella nostra penisola negli anni 2001, 2002 e 2003 abbia riguardato

prevalentemente le regioni del centro e del sud, le cui produzioni più basse

rispetto al nord, rendono questa coltura poco redditizia.

Figura 7. Superficie totale (migliaia di ha) coltivate a colza nelle diverse

zone d’Italia negli anni 2001, 2002 e 2003. 9

A partire da gennaio 2007 è stato sottoscritto il primo contratto quadro nazionale

per la produzione di biodisel da semi oleosi prodotti da terreni eleggibili a uso

energetico, l’obiettivo per il 2007 era quello di estendere la coltivazione di

oleaginose a fini energetici (colza, girasole, brassica e soia) su una superficie di

70.000 ettari (circa 70.000 tonnellate di biodiesel) per poi raggiungere i 240.000

ettari nel 2010.

1.1.5 Obiettivi del miglioramento genetico

Il miglioramento genetico del colza è molto recente se paragonato a quello di

altre colture. Infatti in Europa è stato dato un grosso impulso alla coltivazione del

colza solo nella seconda metà del secolo scorso, in seguito alla scarsità di olio

venutasi a creare durante la seconda guerra mondiale. In Europa il lavoro di

miglioramento è stato realizzato soprattutto in Francia e Germania, oltre che in

Polonia a Svezia su materiali tipo «winter» (ovvero varietà invernali) e in Canada

su tipi «spring» (ovvero varietà primaverili). Uno dei principali obiettivi ha

riguardato l’incremento della produzione di seme. Questo è stato ottenuto sia

tramite l’aumento del numero di semi per siliqua, sia tramite l’aumento del

numero di silique per pianta. Altri importanti obiettivi del miglioramento genetico

sono stati: l’aumento del contenuto in olio, la diminuzione della scalarità di

fioritura, l’abbassamento della taglia, la riduzione della deiscenza delle silique, la

resistenza all’allettamento e alle principali malattie. Negli ultimi due decenni il

miglioramento genetico ha permesso anche un aumento della qualità dell’olio,

riducendo il contenuto di acido erucico (Figura 8). La diminuzione di questo

acido grasso a lunga catena è stata accompagnata da un contemporaneo

incremento dell’acido linoleico (da 14 a 21%) e dell’acido oleico (da 14 a 60%) e

da un leggero aumento dell’acido linolenico e palmitico (1%). Per ottenere farine

adatte all’uso zootecnico sono state prodotte anche varietà prive di glucosinolati.

Le varietà di colza disponibili sul mercato sono numerose, suddivise in varietà

autunnali e primaverili, mentre sul piano della qualità dell’olio si distinguono

varietà ad alto tenore di acido erucico, per usi non alimentari, accanto a

numerosissime varietà a «doppio zero», ovvero a bassissimo contenuto di acido

runico e di glucosinolati. 10

acico oleico acido linoleico acido linolenico acico oleico acido linoleico acido linolenico

acido erucico altri acido erucico altri

Figura 8. Composizione acidica media dell’olio di colza in una cultivar ricca di

acido erucico e in una cultivar frutto di selezione che ne è quasi priva.

Dal punto di vista della gestione agronomica, una rilevante e recente innovazione

è stata l’introduzione nel mercato di ibridi e di varietà transgeniche. Gli ibridi

sono definiti dagli stessi costitutori “linee ibride composte” o “varietà associate”

(CHL, acronimo di Composite Hybrid Line). Essi nascono da una mescolanza di

due linee: una impollinante (20% delle piante) e una maschio sterile (80% delle

piante). Recentemente è stato costituito il CHH (Composite Hybrid Hybrid) con

fertilità maschile completamente ristorata. Le varietà ibride assicurano una

maggiore produzione rispetto alle normali varietà (+5/10%); lo svantaggio è

rappresentato dall’alto costo del seme, che ne limita la diffusione. Inoltre è stato

osservato che fattori ambientali possono ridurre o ostacolare l’impollinazione, per

cui l’effetto medio vigore dell’ibrido può essere modesto. Per questa ragione

alcuni breeder stanno lavorando alla costituzione di varietà associate composte da

più di un impollinatore (Toniolo e Mosca, 2001).

1.1.6. Colza geneticamente modificato (GM) e varietà ottenute

La recente

introduzio

ne di

tecniche

biotecnolo

giche nel

settore

agrario ha

avuto, Figura 9. Aree geografiche ed ettari di raccolto transgenico (1995-2006)

come già

in altri settori, un impatto consistente, soprattutto per quanto riguarda

11

l’ottenimento di nuove varietà vegetali. Tale tecnologia ha permesso infatti un

accorciamento notevole dei tempi previsti dal miglioramento genetico

tradizionale e ha consentito la creazione di genotipi con caratteristiche

difficilmente ottenibili tramite i consueti programmi di incrocio. I geni utilizzabili

non sono soltanto di origine vegetale, ma possono derivare anche da funghi,

insetti, virus o possono essere creati dall’uomo artificialmente. In particolare il

colza, così come molte Brassicacee, é una coltura che si presta molto bene alle

tecniche di ingegneria genetica. Per tale ragione in alcuni paesi, come Canada,

Stati Uniti, Australia e Giappone, le varietà vegetali transgeniche di colza sono

già una realtà commerciale. E’ solo recente invece l’apertura dell’UE alle colture

transgeniche, seppure con molti dubbi e incertezze (Figura 9).

Al di là delle decisioni prese a livello comunitario, molto diversi risultano gli

atteggiamenti dei

singoli stati

membri, che

mantengono la

possibilità di

legiferare in

maniera

autonoma al

Figura 10. Superficie investita (milioni di ha) con colture GM nel riguardo. Le

periodo 1996-2006, suddivisa per specie vegetale quattro colture

maggiormente interessate da esperimenti di ingegneria genetica sono la soia, il

mais, il cotone e il colza (Figura 10).

Le principali modificazioni introdotte in hanno riguardato le

B. napus

caratteristiche qualitative del seme (modificazione della frazione lipidica e

proteica, eliminazione dei glucosinolati), il conferimento di resistenza ad alcune

fitopatie (funghi, virus e insetti), e di caratteristiche per una semplificazione della

gestione agronomica (resistenza a erbicidi) (Poulsen, 1996).

1.1.7 Colza Bt

Nel caso di una modificazione importante riguarda l’inserimento dei

B. napus

geni che codificano per le tossine prodotte da batterio

Bacillus thuringiensis (Bt),

gram-positivo, aerobio, sporigeno, flagellato, molto comune nel suolo. Come le

altre specie del suo genere il è un microrganismo unicellulare a forma di

Bt 12

bastoncino che si moltiplica per scissione semplice. Quando le condizioni

dell’ambiente di crescita diventano sfavorevoli si ha la formazione di una

endospora e la cellula vegetativa assume la funzione di sporangio. La spora,

rilasciata per lisi della parete cellulare, può rimanere vitale per tempi lunghissimi

(anche anni) fino a che non si ripresentano condizioni favorevoli alla sua

germinazione e alla ripresa del suo sviluppo vegetativo. La caratteristica che

permette di distinguere il da altre specie del suo genere è la

B. thuringiensis

produzione, in concomitanza con la formazione dell’endospora, di uno o più

corpuscoli parasporali, di aspetto cristallino e natura proteica, con attività

insetticida (Claus e Berkley, 1986). Queste inclusioni sono composte da proteine

altamente tossiche per una grande varietà di insetti ed altri invertebrati, molti dei

quali di importanza agraria: le δ-endotossine. Le proteine del cristallo hanno una

dimensione che varia dai 27 ai 140 kDa ed hanno il significato funzionale di

protossine dal momento che è generalmente necessaria una loro parziale

degradazione enzimatica per liberare la frazione con attività insetticida. È dagli

anni ’60 che l’utilizzo dei formulati è aumentato e le δ-endotossine prodotte da

Bt

varie razze di (Berliner) sono state sfruttate più ampiamente, e

B. thuringiensis

con successo, come insetticidi biologici nella lotta contro diversi lepidotteri,

coleotteri e ditteri. Ma, come detto in precedenza, perché le tossine abbiano

effetto gli insetti devono ingerire i cristalli prodotti da che

target B. thuringiensis

si trovano sulla superficie dei vegetali trattati con formulati (azione per

Bt

ingestione). Questo metodo di lotta non può quindi essere utilizzato nei confronti

di un certo numero di specie dannose a causa delle loro abitudini alimentari (es.

pur essendo esse sensibili alle tossine. C’è da dire inoltre che

Ostrinia nubilalis),

l’efficacia dei trattamenti non può essere comparata a quella di altri insetticidi.Per

questi motivi i formulati hanno generalmente portato ad una riduzione

Bt

nell’utilizzo dei tradizionali insetticidi quasi esclusivamente in quelle aree in cui

si sono diffuse resistenze o dove determinati insetticidi sono stati banditi per

ragioni ambientali (Roush, 1996). Una nuova possibilità di impiego dell’attività

del si è aperta con gli sviluppi della tecnologia del DNA

B. thuringiensis

ricombinante. Nel genoma di numerose piante coltivate si è riusciti ad inserire

stabilmente e a fare esprimere geni di codificanti per una δ-endotossina. Le

Bt

varietà vegetali così trasformate producono la tossina nei loro tessuti durante tutto

il periodo di crescita e acquisiscono capacità di resistenza all’attacco dei fitofagi

suscettibili al batterio. Le principali colture in cui sono stati inseriti geni per il

Bt

13

controllo di insetti dannosi sono mais, riso, cotone, patata, pomodoro, tabacco,

soia e spp. (cavoli e colture oleaginose). Con le piante transgeniche si

Brassica

cercano di superare i maggiori limiti che le applicazioni fogliari di presentano:

Bt

persistenza ridotta, necessità di interventi tempestivi e, come già sottolineato in

precedenza, scarsa attività contro le specie a comportamento prevalentemente

endofago (Ely, 1993). Inoltre le colture non producono la protossina ma

Bt

direttamente la tossina, poiché all’interno del genoma della pianta è inserita solo

la porzione di gene che codifica per la tossina attiva. In questo modo si possono

superare problemi legati alla specificità dei diversi ceppi di B. thurinhiensis

causati dalla presenza o assenza di specifiche proteasi nell’intestino medio

dell’insetto.

Gli USA sono stati il primo Paese ad autorizzare nel 1996 la coltivazione di

specie vegetali che esprimono singole tossine: per il mais

Bt-transgeniche Cry1Ab

e per il cotone. Nel 1997 la superficie coltivata a mais trasformato ha

Cry1Ac

superato i tre milioni di ettari (soprattutto in USA e Argentina) e quella a cotone i

due milioni (USA e Australia).“Insect-resistant trangenic plants in a multi-trophic

context” (Astrid T. Groott and Marcel Dicke, 2002).Le colture anche se

Bt

possono essere considerate alla stregua di piante derivanti dal miglioramento

genetico tradizionale, in quanto presentano una specifica forma di resistenza

(“host resistance”), differiscono da esse per alcuni importanti particolari. A

prescindere dal fatto che nelle colture è inserito all’interno del genoma un gene

Bt

derivante da un altro organismo (il batterio), una prima differenza si può

riscontrare ad esempio nella difficoltà nel determinare in modo specifico

l’impatto derivante dall’immissione nell’ambiente di linee resistenti agli insetti

derivanti da miglioramento genetico tradizionale (vs. colture dal momento

Bt),

che attraverso l’incrocio è abbastanza difficile stabilire quali e quanti geni siano

coinvolti, o anche quali caratteristiche delle piante siano responsabili

dell’aumento di resistenza agli insetti. Invece nelle colture la resistenza è

Bt

determinata da un “gene maggiore” (es. resistenza verticale) e questo gene e i

suoi prodotti sono ampiamente conosciuti; di conseguenza è più semplice

determinare l’impatto ambientale. Un’altra differenza è data dal livello di

espressione delle caratteristiche della pianta insetto-resistente. Infatti, mentre

nelle piante derivanti dal miglioramento genetico tradizionale il livello di

espressione dei geni di resistenza (es. geni codificanti sostanze allelochimiche) è

inferiore a quello che si osserva normalmente in natura, nelle colture il livello

Bt

14

di espressione del gene codificante la δ-endotossina è determinato dal promotore

e dal numero di copie del gene inserite nel genoma della pianta. Per cui il livello

di tossine prodotte nelle piante transgeniche può divenire pari al 2-5% dell’intero

contenuto di proteine della pianta.

1.1.8 Tecniche di trasformazione genetiche

La trasformazione genetica consiste nell’inserimento di uno o più geni in un

organismo con lo scopo di modificarne le caratteristiche, questo è reso possibile

tramite la tecnica del dna ricombinante. Con il termine di DNA ricombinante si

intende una sequenza di DNA ottenuta artificialmente dalla combinazione di

materiale genetico di origini differenti, come può avvenire per un plasmide

contenente un gene d'interesse. Le principali tecniche di trasformazione sono tre:

bombardamento biolistico, ed elettroporazione.

Agrobacterium tumefaciens

Viene utilizzato spesso sulle piante monocotiledoni (mais, grano, ecc.)

Biolistico:

che non vengono efficientemente infettate dall’Agrobacterium Il

tumefaciens.

DNA da veicolare nella cellula viene legato sulla superficie di microparticelle

d’oro o tungsteno, di 1 micrometro di diametro, che vengono poi “sparate”

all’interno del tessuto da trasformare mediante strumenti a pressione in maniera

diffusa a una velocità intorno ai 500 m/sec sui campioni (meristemi o calli in

coltura) da trasformare (Figura 11). Le cellule situate nella traiettoria diretta di

tiro vengono uccise, ma nella zona concentrica vicina i proiettili penetrano nelle

cellule senza danneggiarle. Il vantaggio principale di questo metodo è la

possibilità di trasformare cellule vegetali integre: infatti i bersagli utilizzati per

questo tipo di trasformazione sono in genere colture di cellule embrionali, ma

anche foglie e semi.

Figura 11. Tecnica del bombardamento biolistico

15

questo metodo sfrutta la capacità intrinseca di

Agrobacterium tumefaciens: di infettare le

Agrobacterium tumefaciens

piante attraverso il trasferimento e la seguente

integrazione nel DNA cromosomico della

cellula vegetale di una regione del proprio

plasmide Ti. Grazie all'azione di fattori

rilasciati dalla pianta ferita, vengono attivati i

geni della virulenza che controllano il

vir

trasferimento e l'integrazione della regione T-

DNA del plasmide.Il T-DNA è delimitato da un

ed un costituiti da

border destro border sinistro

ripetizioni di 25 coppie di basi. Attraverso

un'incisione nel si forma un

border destro

innesco (primer) per la sintesi di un nuovo

filamento che scalzerà quello vecchio che potrà

così essere trasferito come singolo filamento.

Una volta dentro la cellula vegetale il T-DNA si

Figura 12. Tecnica di integra a caso nel DNA cromosomico (Figura

trasformazione genetica

mediante Agrobacterium 12). E' possibile modificare il plasmide Ti al

tumefaciens. fine di farlo diventare vettore del gene che

vogliamo inserire nella pianta.

E’ una tecnica per introdurre il DNA nelle cellule applicata a

Elettroporazione:

protoplasti. Consiste di una repentina scarica elettrica operata in un piccolissimo

contenitore che racchiude protoplasti vegetali e molecole di DNA in una

sospensione liquida. La scarica apre simultaneamente la membrana plasmatica

vegetale in numerosi punti, permettendo alle molecole di DNA di penetrare nella

cellula (Figura 13). Il passo successivo é quello di coltivare i protoplasti cercando

di rigenerare delle piante. Questo é il passaggio più difficile poiché numerose

specie vegetali non sono facilmente rigenerabili partendo da protoplasti singoli.

Dei ricercatori hanno recentemente applicato l’elettroporazione a un meristema

organizzato; in questo modo hanno evitato il problema di rigenerare piante

partendo da protoplasti singoli. Questo metodo rappresenta una grande promessa

per trasformare importanti specie colturali, come il frumento ed il mais, che

finora sono risultate difficili da trasformare.

16

Figura 13. Tecnica dell’elettroporazione.

1.2. PRODUZIONE DI VARIETÀ VEGETALI GM IN EUROPA E IN

ITALIA: ASPETTI LEGISLATIVI

1.2.1 Legislazione europea e colture GM

L’impiego di varietà di colza GM, così come di molte altre colture con

caratteristiche introdotte tramite ingegneria genetica, è sottoposta in ambito

europeo ad una normativa che ha preso corpo negli ultimi quindici anni, con la

finalità di regolare tramite leggi specifiche le più recenti applicazioni

biotecnologiche in campo agricolo. La possibilità di coesistenza dipende

strettamente dalle caratteristiche dell’ambiente agricolo, che determina la capacità

di isolare dalla contaminazione involontaria da OGM le colture convenzionali e

biologiche. Inoltre, se la specie di cui si intende utilizzare varietà GM è

sessualmente compatibile con piante presenti nell’ambiente naturale, deve anche

essere preso in considerazione il rischio di flusso genico verso l’ambiente stesso.

In merito al rapporto tra soglie di tolleranza e distanze di isolamento, la

Commissione Europea ritiene che le soglie cui fare riferimento nella definizione

delle misure di separazione tra le filiere GM e non GM devono essere le soglie

legali per l’etichettatura degli alimenti e mangimi, attualmente dello 0,9%,

applicabili indistintamente a prodotti agricoli convenzionali e biologici, almeno

fino a che il regolamento sull’agricoltura biologica non stabilirà diversamente

(Raccomandazione 2003/556CE). 17

La Danimarca, la Germania, il Portogallo, la Repubblica Ceca, la Lituania, la

Lettonia, l’Olanda, l’Ungheria, il Lussemburgo e 8 Regioni austriache hanno

adottato o hanno in corso di adozione una legislazione sulla coesistenza,

attualmente all’esame della Commissione Europea, che include la fissazione di

distanze di isolamento.

Nella “Relazione concernente l’applicazione delle misure nazionali sulla

coesistenza di colture geneticamente modificate e l’agricoltura convenzionale e

(COM (2006) 104 e SEC (2006) 313), la Commissione Europea

biologica”

commenta le legislazioni europee notificate e riporta, tra l’altro, le distanze di

isolamento tra le colture GM e le colture convenzionali e biologiche, sia per

quelle commerciali che per quelle da seme, presenti nelle regole di coesistenza

adottate o in corso di adozione da parte di Olanda, Danimarca, Polonia, Spagna,

Ungheria, Lussemburgo, Repubblica Ceca, Portogallo e di alcune regioni

austriache.

Le distanze di separazione riportate sono molto diversificate, in quanto variano in

funzione del tipo di produzione (convenzionale, biologica, sementiera,

convenzionale per alimenti, convenzionale da foraggio). Ad esempio, per il mais,

le distanze variano da 25 a 800 m; per il colza da 500 a 3.000 m; per la

barbabietola da 1,5 a 2.000 m; per la patata da 2 a 50 m.

La Commissione Europea, nel commentare le varie distanze di isolamento

notificate dalle Regioni e dagli Stati Membri, osserva che le misure di isolamento

che si pongono come obiettivo un livello di contaminazione del prodotto agricolo

inferiore alla soglia di etichettatura dello 0,9%, poiché richiedono da parte degli

agricoltori sforzi maggiori per essere applicate, fanno nascere la domanda se

rispondano o meno al criterio di proporzionalità, ovvero se non siano più rigide

del necessario. Inoltre, pur ammettendo che sia necessario lasciare un certo grado

di flessibilità nella scelta delle misure di segregazione, per tenere conto dei fattori

locali che differenziano una regione dall’altra, la Commissione nota che in alcuni

casi le distanze di separazione proposte dagli Stati Membri sono sostanzialmente

maggiori di quelle identificate sulla base degli studi condotti. Tuttavia,

riconoscendo la scarsa esperienza finora maturata in materia di coesistenza in

Europa, la Commissione non ha ancora proceduto alla valutazione finale delle

misure proposte.

1.2.2 La situazione italiana 18

La direttiva 2001/18/CEE è stata recepita in Italia dal decreto legislativo n. 224

dell’8 luglio 2003 (con pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale n. 194 del 22

agosto 2003, supplemento ordinario n.138); questa direttiva riguarda l’emissione

deliberata nell’ambiente e l’immissione in commercio di organismi

geneticamente modificati, conta 63 punti ed è articolata in 4 parti: disposizioni

generali, emissione deliberata di OGM per qualsiasi fine diverso dall’immissione

in commercio, immissione in commercio di OGM come tali o contenuti in

prodotti e disposizioni finali. Nei 63 punti del preambolo si afferma, innanzi tutto,

che l’immissione deliberata nell’ambiente e l’emissione in commercio di

organismi geneticamente modificati devono sottostare alla necessità di tutelare la

salute umana e l’ambiente, considerato che gli OGM immessi deliberatamente

nell’ambiente possono riprodursi e diffondersi oltre i parametri di coltivazione o

di sperimentazione, ed oltre le frontiere nazionali. Che le politiche riguardanti gli

organismi geneticamente modificati devono, cioè, ispirarsi a un principio di

precauzione, interpretato non tanto come norma assoluta che prescrive di

astenersi da qualsiasi azione possa rappresentare un rischio (anche in assenza di

prove scientifiche) quanto piuttosto come norma procedurale ovvero come norma

che prescrive di considerare, prima di ogni decisione, i possibili vantaggi e i

possibili svantaggi. Si precisa inoltre, che è necessario tener conto dell’esperienza

internazionale nel settore delle biotecnologie vegetali e degli impegni

commerciali internazionali, nel rispetto delle prescrizioni del Protocollo di

(1999) e della

Cartagena sulla biosicurezza Convenzione sulla biodiversità di Rio

(1992). Si aggiunge, poi, che si dovrà regolamentare la problematica

de Janeiro

delle responsabilità per danni ambientali derivati da altri organismi, dato che,

come viene sottolineato, l’emissione nell’ambiente e l’immissione in commercio

di OGM potrebbero avere effetti dannosi per l’ambiente. Che, prima di ogni

immissione, è indispensabile procedere alla valutazione del rischio ambientale, e

quindi alla sperimentazione in campo aperto degli organismi geneticamente

modificati, sulla base di una metodologia comune ( e con una specifica attenzione

alla questione dei geni resistenti agli antibiotici), e che quindi l’introduzione

nell’ambiente di organismi geneticamente modificati dovrebbe avvenire per gradi

e dopo idonee verifiche sul campo negli ecosistemi che potrebbero essere

interessati dal loro utilizzo. Si afferma, inoltre, che è necessario istituire una

nuova procedura comunitaria di autorizzazione, che preveda la consegna di una

notifica all’autorità nazionale competente; che ad ogni OGM deve essere

19

assegnato un identificatore numerico unico affinché il tipo di modificazione

apportata possa essere subito riconosciuta, se non dal consumatore, quanto meno

dalle autorità competenti; che la prima autorizzazione deve essere rilasciata a

tempo determinato, prevedendo una procedura semplificata per il rinnovo. Alle

autorità nazionali si chiede, invece, di attuare nuovi sistemi sanzionatori, per

rendere più efficace l’applicazione della direttiva, e si stabilisce infine l’obbligo

per la Commissione di pubblicare con cadenza triennale, una relazione

contenente, tra l’altro, anche i vantaggi e gli svantaggi socioeconomici delle

singole categorie di OGM autorizzate ad essere immesse in commercio, che tenga

in debito conto gli interessi degli agricoltori e dei consumatori .

1.2.3 Possibili rischi per l’ambiente

Nello sviluppo di piante GM destinate al consumo umano, oltre alle

preoccupazioni relative ai loro effetti diretti sulla salute umana (allergenicità,

presenza di geni che conferiscono resistenza ad antibiotici, diffusione di

promotori di origine virale), sono stati individuati rischi potenziali per l’ambiente,

tra i quali si ricordano:

• trasferimento del transgene tramite il polline a colture convenzionali o

biologiche compatibili e loro inquinamento, con conseguente impossibilità di

etichettatura “GM-free”;

• trasferimento del transgene dalla coltura GM a specie spontanee affini tramite

polline con effetti turbativi sugli habitat naturali (sviluppo di super-infestanti

nel caso di geni di resistenza ad erbicidi);

• alterazione degli equilibri tra le diverse popolazioni di organismi che occupano

un certo areale (batteri, insetti, funghi, fauna del suolo).

Per quanto riguarda il primo e il secondo punto, che si riferiscono al trasferimento

del transgene all’interno del regno vegetale, un campo di analisi è rappresentato

dagli studi sul flusso genico, cioè sulla potenzialità di una certa coltura di

diffondere il suo materiale genetico nell’ambiente.

1.3 COLZA E FLUSSO GENICO

1.3.1 Definizione di flusso genico 20

Il flusso genico è indubbiamente il problema più reale e, nello stesso tempo,

controverso legato all’introduzione delle piante transgeniche in agricoltura. Per

flusso genico si intende la possibilità di trasferimento di geni tra le piante

coltivate e altri organismi, siano essi varietà coltivate o parentali selvatiche in

grado di ibridarsi con esse (si parla in questo caso di od

flusso genico verticale)

organismi di gruppi biologici differenti, anche filogeneticamente lontani (flusso

È ovvio che il flusso genico è un aspetto che necessita di

genico orizzontale).

essere studiato in profondità, in quanto può giocare un grande ruolo dal punto di

vista dei cambiamenti evolutivi. Il principale meccanismo favorito

dall’evoluzione naturale in grado di creare nuove combinazioni geniche è la

riproduzione sessuata. Questa nelle piante si verifica quando il polline di una

pianta è in grado di fecondare efficacemente l’ovulo di un’altra pianta

appartenente alla stessa specie o a specie affini, producendo semi vitali

(alloincrocio). La progenie ottenuta dall’incrocio sarà quindi dotata di nuove

combinazioni geniche grazie sia alla fusione dei gameti maschili e femminili

provenienti da piante diverse, sia al crossing-over meiotico che avviene durante la

spermatogenesi e l’ovogenesi negli individui parentali. La possibilità di incrocio

tra due piante geneticamente diverse è però finemente regolata tramite

meccanismi molecolari e biochimici; infatti in natura essa è meno comune tra due

specie diverse e decresce all’aumentare della distanza evolutiva tra gli organismi.

Il processo precedentemente descritto è considerato un flusso genico verticale,

poiché consiste nel trasferimento dell’informazione genetica da un organismo alla

sua progenie tramite i meccanismi convenzionali dell’ereditarietà.

Per flusso genico orizzontale si intende la possibilità di trasferimento di parte del

genoma dalle piante coltivate (GM o convenzionali) a altri organismi non

sessualmente compatibili, essenzialmente tra procarioti (batteri) e eucarioti

(piante, animali, funghi e protozoi).

Gli scambi di materiale genetico sono ovviamente essenziali per l’evoluzione

della vita. Nei procarioti (batteri), come noto, non esiste possibilità di

riproduzione sessuata (con ricombinazione del genoma di entrambi i genitori), e il

trasferimento dell’informazione genetica avviene normalmente in maniera

«verticale», cioè da cellula madre a cellule figlie. Ciò implica che i batteri

possono adattarsi a cambiamenti delle condizioni ambientali solo attraverso

«mutazioni», ovvero cambiamenti casuali del genoma. Ma nel corso

dell’evoluzione tali organismi hanno messo a punto altri meccanismi che ne

21

esaltano la capacità evolutiva, permettendo scambi di materiale genetico anche

con bassi gradi di omologia arrivando anche allo scambio eterologo, cioè tra

specie differenti.

1.3.2 Metodi per misurare il flusso genico verticale

Il flusso genico che avviene tramite l’impollinazione può essere misurato in vari

modi, come ad esempio le distanze di isolamento che dovrebbero essere

specifiche in quanto funzione del potenziale di allogamia della coltura e

ovviamente commisurate alle scelte in materia di soglia di tolleranza. Per colture

di specie caratterizzate da evidenti livelli di allogamia, come ad esempio il colza,

sono necessarie distanze maggiori rispetto a quanto richiesto per colture di specie

fortemente autogame. Le distanze di isolamento sono in grado di minimizzare,

ma non necessariamente eliminare, il flusso genico dovuto al polline. L’obiettivo

è comunque quello di garantire un livello di contaminazione accidentale inferiore

alle soglie di tolleranza; altri metodi sono rappresentati dalle zone cuscinetto, in

alternativa o complementari alle distanze di isolamento; barriere/trappole per il

polline; sistema di rotazione adeguato; riduzione della banca del seme attraverso

un’adeguata lavorazione del terreno; attenzione nelle fasi di lavorazione della

semente (raccolta, stoccaggio, selezione, confezionamento) per evitare

contaminazioni; adeguata pulizia delle seminatrici e delle raccoglitrici;

monitoraggio dello sviluppo di piante prodotte da semi caduti da colture

precedenti (piante loro controllo ed eliminazione; per la produzione

volunteer),

delle sementi in azienda per autoconsumo, conservazione solo delle sementi

provenienti da campi e zone adatte; controlli accurati al fine di ridurre la perdita

della semente durante la raccolta e le fasi successive; garanzia della segregazione

fisica tra prodotti GM e non, dopo la raccolta, fino al punto vendita; impiego di

adeguate pratiche di stoccaggio; collaborazione tra aziende limitrofe, con

informazione riguardo ai piani di semina, coordinamento delle misure di gestione

e accordi volontari tra agricoltori.

1.3.3 Caratteristiche del colza che favoriscono il flusso genico verticale

Il colza possiede un elevato rischio di inquinamento involontario e un alto livello

di fecondazione incrociata e presenta, nel nostro ambiente, specie spontanee

sessualmente compatibili. La dispersione di polline è consistente; è stato rilevato

a distanze anche superiori ai 4.000 m per trasporto entomofilo e 3.000 m per

22

trasporto anemofilo. Gran parte del polline può essere però rimosso dall’aria da

barriere vegetali. Inoltre tale coltura è dotata di una alta vitalità del polline, che è

compresa tra 24 h e una settimana, nelle condizioni ambientali più favorevoli

(Mesquida & Renard, 1982). Le varietà di colza presentano inoltre una certa

percentuale di alloincrocio, la cui incidenza è stata stimata tra il 12 e il 47%

(Williams 1986; Becker 1992).

et al., et al.,

È tuttavia importante sottolineare che il problema legato al flusso genico verticale

dipende essenzialmente dalla reale esistenza di parentali selvatiche nell’area di

coltivazione delle piante geneticamente modificate. A questo riguardo, tra le

piante geneticamente modificate attualmente coltivate particolare attenzione

dovrebbe essere data alla colza, che ha in Europa il suo luogo di origine. Il colza

può infatti incrociarsi con numerose altre piante, coltivate e selvatiche (cavolo,

rapa, senape, ravanello selvatico, rucola selvatica, erucastro francese, senapino,

brassica cretese e senape canuta), ed è quindi possibile che i transgeni possano

diffondersi tra un numero elevato di piante selvatiche e non. Tuttavia, almeno in

questi casi, a tutt’oggi, non si è osservata negli ibridi con varietà silvestri una

tendenza all’aumento dell’infestazione. Meno problematica appare, al momento,

la situazione per le altre due piante GM coltivate: il mais e la soia.

Un particolare aspetto del flusso genico verticale riguarda le cosiddette piante

volontarie (volunteer), piante della coltura che rinascono nell’annata successiva a

quella in cui sono state seminate, quando è in atto un’altra coltura, o quando è in

atto la coltura convenzionale (non GM) della stessa specie. Alcune specie

coltivate hanno infatti un’elevata capacità di sopravvivenza nel terreno (la colza,

per esempio), e possono sopravvivere parecchi anni nel suolo, provocando

successivamente inaspettati casi di flusso genico verticale. Infine, il colza

produce molti semi, che possono entrare in dormienza e germinare dopo molti

anni.

1.3.4 Dispersione del polline di B.napus

Il colza presenta fiori ermafroditi, capaci sia di auto- che di alloimpollinazione.

Generalmente la fertilizzazione degli ovuli è dovuta all’autoimpollinazione,

poiché in un campo fiorito ogni fiore produce una grande quantità di polline e

quindi compete con il polline da fiori adiacenti. Il colza è una specie che presenta

due modalità di dispersione del polline: una attiva, entomofila, e un’altra passiva,

anemofila. Questo è dovuto alle caratteristiche del polline, che costituiscono una

23

eccezione rispetto a piante in cui predomina solo una delle due modalità di

impollinazione. Infatti, le piante impollinate

esclusivamente da insetti presentano granuli

pollinici di dimensioni relativamente grandi

(32-33 µm) e appiccicosi, difficilmente

trasportabili dal vento. Al contrario specie di

piante che utilizzano il vento come unico

mezzo di dispersione del polline hanno

generalmente un polline leggero e di piccole

dimensioni, asciutto e facilmente trasportabile

dalle correnti d’aria. Il polline del colza integra

Figura 14. Infiorescenza a queste due situazioni. Non è stato ancora

grappolo tipica di B. napus

possibile attribuire a queste due modalità di impollinazione la relativa

importanza. Prima infatti era ritenuto che il trasporto a grande distanza del polline

fosse dovuto esclusivamente agli insetti, mentre studi recenti hanno dimostrato

che ciò non è del tutto esatto.

Dispersione del polline tramite il vento

Per valutare la dispersione anemofila del polline di colza sono stati condotti degli

studi utilizzando vari metodi. La misurazione della concentrazione delle spore

nell’aria è stata effettuata tramite delle trappole volumetriche. Come già

accennato però tale metodo fornisce solo una stima del flusso genico potenziale,

poiché non tiene conto della perdita di vitalità del polline. Per stimare il flusso

genico reale, eliminando il contributo dell’impollinazione entomofila, sono state

utilizzate piante demasculate e prive di petali.

Nella maggior parte dei casi il polline si muove a meno di 10 m e la sua quantità

si riduce all’aumentare della distanza dalla sorgente (Scheffler 1993;

et al.,

Timmons 1995; Thompson 1999). Il range di dispersione è

et al., et al.,

comunque variabile, da pochi metri fino 360 m o in casi estremi anche fino a 1,5

chilometri (Timmons 1995) (Tabella 1). Osservazioni condotte su piante

et al.,

individuali hanno rivelato che il 50% del polline prodotto cade nel raggio di 3

metri dalla fonte, mentre il rimanente 50% si deposita più lontano con una

probabilità che decresce lentamente con la distanza (Lavigne 1998).

et al.,

Un ruolo importante nella dispersione tramite il vento è svolto da fattori

ambientali e topografici (direzione e velocità del vento, composizione della

24

vegetazione circostante) (Gliddon 1999; Thompson 1999). Il polline

et al., et al.,

può però essere trasportato a maggiore distanza quando è catturato da correnti

d’aria ascensionali e trasportato al di sopra della vegetazione. Per alcune specie

arboree è stato dimostrata la dispersione del polline a distanze superiori a oltre

300 Km dalla pianta donatrice (Tyldesley, 1973).

Tabella 1. Distanze di dispersione del polline e percentuali di alloincrocio

per B. napus rilevate in diversi esperimenti

Fonte Distanza alloincrocio

di dispersione (m)

Bateman, 1947 6,1-18,5 m 5-0%

Stringham & Downey, 1978 137-366 m 5,8-0%

Mesquida & Renard, 1982 24-32 m 7-10%

McCartney & Lacey, 1991 100 m 2,10%

Manasse & Kareiva, 1991 50-100 m 0,022-0,011%

Darmency & Renard, 1992 800 m <0%

Scheffler et al., 1993 3-47 m 0,4-0,003%

Paul et al., 1995 0 m (pop. mescolate) 3-12%

Scheffler et al., 1995 200 m; 400 m 0,0156-0,0038%

Timmons et al., 1995 360 m-2,5 Km* 10-0,8%*

Wilkinson et al., 1995 32-400 m 0,03-0,05%, contamin. rilevabile

Lavigne et al., 1996 54-160 m 6%, bassi livelli

Thompson et al., 1999 3-4 Km* Bassi livelli; 5%*

Rieger et al., 2002 3 km <0,01%

*valori ottenuti utilizzando piante demasculate

Dispersione del polline tramite insetti impollinatori

I fiori di colza producono molto nettare, contenente alte concentrazioni di

zuccheri e hanno un colore che li rende attraenti per gli insetti, in particolare per

le api (Apis Anche i bombi (Bombus spp.) giocano un ruolo

mellifera).

importante, soprattutto nel nostro emisfero (Cresswell, 1999).

Il comportamento degli insetti impollinatori è piuttosto complesso poiché dipende

da un gran numero di fattori come la

disposizione spaziale delle piante, le

condizioni ambientali, la densità delle

piante e la disponibilità del polline

(Rieger 2002). In seguito alla

et al.,

abbondante fioritura del colza, che si

Figura 15. Suzione del nettare di un verifica in pieno campo, solitamente gli

fiore di colza da parte di un insetto

impollinatore. insetti tendono a raccogliere il nettare e

il polline da fiori di piante adiacenti o della stessa pianta. Spesso nei campi di

colza vengono introdotti degli alveari per facilitare l’impollinazione e aumentare

il numero di semi per siliqua. Normalmente in queste condizioni la raccolta del

25

nettare e del polline avviene nelle immediate vicinanze dell’alveare e da piante

vicine tra loro, in aree di circa una decina di metri quadri (Nieuwhof, 1963). Vari

studi hanno dimostrato che i voli delle api sono per l’80% a meno di 1 m di

distanza dall’alveare, con la maggior parte del polline trasportato a meno di 5 m

di distanza (Cresswell, 1999; Ramsay 1999; Pierre, 2001).

et al.,

Occasionalmente però le api possono viaggiare molto più lontano, fino a 1-2 Km

(Eckert, 1993), mentre la distanza massima rilevata è stata di 4 Km (Ramsay et

1999).

al.,

1.3.5 Dispersione dei semi di B. napus

La contaminazione a partire da una determinata coltura è favorita anche da

un’altra modalità di diffusione dei geni nell’ambiente: i semi. Come già

accennato in precedenza, due

caratteristiche dei semi di colza ne

favoriscono la dispersione, ovvero

l’elevato numero di semi prodotti e

il fenomeno della dormienza.

I corpi fruttiferi prodotti dal colza

sono chiamati silique e contengono

da 15 a 25 semi tondeggianti di circa

Figura 16. Silique e semi di B.napus 1-2 mm di diametro, di colore bruno

(Figura 16). Ogni pianta ne produce qualche centinaio. I semi sono dispersi in

quantità minore rispetto al polline, ma i loro effetti possono essere più rilevanti.

La loro diffusione nell’ambiente può avvenire tramite dei vettori, come il vento,

gli animali l’uomo o le macchine (Thill e Mallory-Smith, 1997). Tuttavia, nella

maggior parte dei casi, i semi rimangono vicini alla pianta madre. In alcune

specie, a causa del fenomeno della dormienza, essi si accumulano negli strati

superficiali del terreno, venendo così a costituire una vera e propria “banca del

seme”. Solitamente i semi di colza non mostrano segni di dormienza a maturità

(Lutman, 1993; Pekrun 1998). Tuttavia semi di colza non dormienti

et al.,

possono entrare in dormienza se le condizioni ambientali non sono favorevoli alla

germinazione (dormienza secondaria). Solo in seguito a stress idrico e ad una

prolungata esposizione al buio i semi sviluppano una sesibilità alla luce, per cui

germinano. In suoli dove è praticata la non lavorazione la persistenza dei semi è

molto aumentata. E’ stato osservato in studi condotti nell’emisfero nord che i

26

semi vitali di colza possono sopravvivere per 5 anni nei terreni lavorati e fino a

10 anni nei terreni non lavorati (Masden, 1962; Pekrun 1997; Vaugham

et al., et

1976). La densità dei semi del colza nel terreno può raggiungere valori pari a

al., 2 , come osservato in Canada (Legere 2001), o pari a 10.000

2.000 semi/m et al.,

2

semi/m , come osservato in Gran Bretagna (Lutman, 1993). Alla formazione della

“banca del seme” contribuiscono fattori come la mancata germinazione dei semi

dopo la semina, la caduta dei semi maturi dalla pianta prima o durante la raccolta

(Price 1996), le precipitazioni, i venti forti e la grandine. La germinazione

et al.,

può avvenire nell’annata colturale successiva o addirittura dopo molti anni, perciò

in tal caso si parla di “ricacci”, ovvero piante la cui presenza non è programmata

dall’uomo. Ricacci di colza ad alto contenuto di acido erucico sono state rilevate

negli anni successivi al loro uso come coltura, con una media di una pianta ogni

2 , dopo 3, 4 e 5 anni (Ramans, 1995). E’ facile intuire come ciò crei una nuova

3m

fonte di polline contaminante, anche dopo molto tempo dalla raccolta della

coltura di origine. Dunque nel caso si voglia seminare una nuova cultivar di colza

nello stesso appezzamento di terreno, non sarà più possibile avere delle garanzie

di purezza tramite il semplice isolamento spaziale. Il numero accettabile di

“ricacci” e il periodo di tempo che deve passare tra colture della stessa specie

sono inclusi nel regolamento per la produzione dei semi certificati. Per la colza il

tempo minimo tra due colture è di 5 anni sia per i semi di base che per quelli

a

certificati di 1 generazione, mentre il livello accettabile di “fuoritipo” è 0,3-0,1%

a generazione. Il

per i semi di base e 0,3-2,0% per quelli certificati di 1

miglioramento genetico e le pratiche agronomiche possono aiutare a risolvere

questo problema: ad esempio selezionando varietà in cui è ridotto il carattere

della dormienza o della deiscenza oppure tramite appropriate rotazioni.

1.3.6 Flusso genico verticale dal colza e sue implicazioni

Come detto in precedenza, il flusso genico gioca un ruolo chiave in natura

nell’evoluzione di specie di piante strettamente correlate. Questo meccanismo è

stato di grande utilità nella storia dell’agricoltura, poiché proprio grazie ad esso

l’uomo ha avuto la possibilità di trasferire nelle specie coltivate caratteristiche

utili e più adatte alle sua esigenze. Tuttavia il rimescolamento dei geni in

condizioni naturali risulta incontrollabile, per cui esso ha anche delle implicazioni

sfavorevoli, sia quando la fonte del polline é una specie coltivata, sia quando si

tratta di una specie spontanea affine. La necessità di tenere sotto controllo i flussi

27

genici tra popolazioni di piante ha acquisito rilevanza soprattutto negli ultimi

anni, in seguito alla recente introduzione nel mercato di varietà coltivate GM. Le

principali preoccupazioni riguardano la possibilità di inquinamento delle

produzioni di sementi certificate e il trasferimento di transgeni a popolazioni di

piante spontanee.

Per quanto riguarda il primo di questi due aspetti, la necessità di minimizzare i

rischi dell’inquinamento genetico rappresenta una caratteristica peculiare per la

produzione di semi di alta qualità da fornire agli agricoltori. Le garanzie di

purezza varietale si basano perciò su schemi di produzione controllati, ovvero

sistemi che assicurano la qualità del prodotto tramite l’applicazione di una stretta

regolamentazione produttiva. L’esperienza acquisita in molti decenni ha

permesso di stabilire ad esempio quali siano le distanze di isolamento ottimali, le

rotazioni e le pratiche agronomiche in grado di proteggere le colture dalle

contaminazioni. Come è evidente, la coltivazione di varietà GM ha delle forti

implicazioni per l’intero comparto agricolo, poiché richiede controlli ancora più

stringenti. Infatti non è sufficiente stabilire l’innocuità di un particolare transgene

per la salute umana poiché, qualunque sia la sua natura, la contaminazione non

deve avvenire affinché un prodotto vegetale sia etichettato come “GM-free”.

Un secondo effetto del flusso genico da piante di colza GM consiste

nell’inquinamento genetico di popolazioni di piante spontanee. Molti ritengono

infatti che esso possa avere delle ripercussioni più consistenti sulle dinamiche

evolutive di specie spontanee affini, se confrontato con le colture tradizionali. Le

conseguenze del trasferimento di un transgene ad una popolazione di piante

spontanee variano fortemente in relazione alla natura del transgene stesso. Tra i

diversi tipi di varietà transgeniche, i principali dubbi riguardano l’utilizzo di

piante ingegnerizzate il cui transgene conferisce un vantaggio adattativo e quindi

aumenta la loro fitness, sia all’interno dell’ecosistema agrario, che di quello

naturale. L’eventuale flusso del transgene da tali piante a specie selvatiche affini

limiterebbe il loro controllo, rendendole più aggressive.

28

Impatto ecologico Impatto economico

Su colture non GM:

Problemi di etichettatura come “GM-free”

Ricacci negli anni successivi alla

coltura

Comunità vegetali Colza GM Colza non GM

Alterazione dell’equilibrio tra le

comunità vegetali

Riduzione della diversità genetica Sulle infestanti:

Effetti sugli insetti e sugli Aumento dei trattamenti a causa dello

organismi del suolo sviluppo di superinfestanti

Infestanti

Comunità animali

Figura 17. Principali effetti del flusso genico da una coltura GM, il cui transgene determina

un aumento del suo adattamento all’ambiente.

In ogni modo, una trattazione generale di questo tema è molto difficile, poiché i

possibili effetti della formazione di ibridi tra piante GM e loro parenti spontanei

sono molto diversi. Infatti essi dipendono dal tipo di prodotto proteico codificato

dal transgene e dalla sua interazione con l’ambiente.

Il colza è una delle specie di interesse agrario su cui si è focalizzata l’attenzione

dei ricercatori, per varie ragioni. In primo luogo, si presta con successo alle

tecniche di ingegnerizzazione. Proprio per questo gli ultimi anni hanno visto

l‘introduzione sul mercato di numerose varietà di colza GM, aventi diverse

caratteristiche. Inoltre si tratta di una specie che presenta un elevato numero di

specie selvatiche affini, con diverso grado di interfertilità. Da ultimo, si tratta di

una delle colture da olio più diffuse sia a livello europeo che a livello mondiale,

perciò le conseguenze dannose, nel caso fossero rilevate, sarebbero difficili da

limitare. Un caso molto discusso consiste nella possibile acquisizione della

resistenza agli erbicidi da parte di popolazioni di piante spontanee affini al colza.

Attualmente sono molte le varietà di colza transgeniche in grado di resistere ad

erbicidi quali glifosate, glufasinate, bromoxinil e sulfoniluree. Queste sono ormai

divenute una realtà commerciale in paesi come Stati Uniti, Canada, Australia e

Giappone. Numerosi studi condotti su varietà di colza GM resistenti ad erbicidi,

in diverse parti del mondo, hanno messo in evidenza come il rischio di

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