Tesi Effetto di antagonisti muscarinici M1 e M4 selettivi nell espressione delle discinesie indotte da L DOPA

LORO CORRELATI NEUROCHIMICI

Nella FIGURA 9 è possibile osservare l’espressione dei movimenti anomali involontari assiali,

degli arti e orolinguali (ALO AIMs) dopo perfusione intrastriatale di telenzepina 100 nM. E’ stata

scelta una concentrazione di telenzepina circa 50 volte superiore al valore di affinità per i recettori

M1 (1.8 nM), in quanto è atteso che, nelle nostre condizioni sperimentali, considerato un recupero

della fibra di circa il 10%, i livelli di telenzepina negli spazi extracellulari siano 5-10 volte superiori

alla affinità per i recettori M1. Questi livelli permettono di preservare un buon grado di selettività

del composto verso i recettori M1. È possibile osservare come telenzepina attenui la severità degli

AIMs senza peraltro alternate il time-course. In particolare, l’effetto di telenzepina risultava

significativo a 80 e 100 minuti.

FIGURA 9. Valutazione delle discinesie in ratti emilesionati con 6-OHDA, cronicamente trattati con L-

DOPA (6mg/Kg) e benserazide (12 mg/Kg) e sottoposti a microdialisi. La L-DOPA è stata somministrata,

i.p., 40 min dopo la perfusione intrastriatale di telenzepina 100 nM e soluzione ringer. I movimenti anomali

involontari (AIMs) assiali (axial), degli arti (limb) e orolinguali (orolingual), collettivamente ALO sono stati

osservati per 1 minuto ogni 20 minuti per un totale di 120 minuti dopo la somministrazione di L-DOPA. I

dati sono espressi in valore assoluto, come somma cumulativa degli score attribuiti agli ALO AIMs e

corrispondono alla media ± SEM di n=8 (Telenzepina) e n=5 (L-DOPA) ratti. L’analisi statistica è stata

eseguita mediante ANOVA a due vie seguita dal test di Bonferroni.

43

In FIGURA 10 sono mostrate le variazioni dei livelli di GABA e GLU nei campioni di dializzato

prelevati della SNpr durante la perfusione intrastriatale di telenzepina 100 nM. I livelli basali di

GABA e GLU nella SNpr erano 26,2 ± 7,2 nM e 56,0 ± 8,3 nM, rispettivamente.

Contemporaneamente alla comparsa degli AIMs, la somministrazione di L-DOPA induceva un

incremento prolungato dei livelli di GABA (Fig. 10A) e GLU (Fig. 10B) nella SNpr. Telenzepina,

inefficace da sola, attenuava il rilascio di GABA, ma non alterava quello di GLU indotta da L-DOPA.

FIGURA 10. Effetti della somministrazione acuta di L-DOPA (6 mg/Kg) e benserazide (12 mg/Kg) sul

rilascio di GABA (A) e GLU (B) nigrale a seguito di perfusione intrastriatale con telenzepina (100 nM) o

soluzione ringer. I livelli dei due neurotrasmettitori sono stati monitorati ogni 20 minuti per 120 minuti dopo

la somministrazione di L-DOPA. I dati sono espressi come percentuale rispetto ai livelli basali (calcolati

come media di due campioni precedenti il trattamento) e corrispondono alla media ± SEM di n=5 (L-DOPA

+ ringer), n=8 (L-DOPA + telenzepina 100 nM) e n=5 (telenzepina 100nM + salina) ratti. L’analisi statistica

è stata eseguita mediante ANOVA a due vie seguita dal test di Bonferroni.

44

Nello striato, i livelli basali di GABA e GLU erano 25,29 ± 7,1 nM e 39,0 ± 8,7 nM,

rispettivamente. L-DOPA non alterava i livelli di GABA (Fig. 11A), ma elevava quelli di GLU (Fig.

11B). La telenzepina ha mostrato una significativa riduzione di quelli di GLU nello striato in

seguito alla somministrazione di L-DOPA.

FIGURA 11. Effetti della somministrazione acuta di L-DOPA (6 mg/Kg) e benserazide (12 mg/Kg) sul

rilascio di GABA (A) e GLU (B) striatale a seguito di perfusione intrastriatale con telenzepina (100 nM) o

soluzione ringer. I livelli dei due neurotrasmettitori sono stati monitorati ogni 20 minuti per 120 minuti dopo

la somministrazione di L-DOPA. I dati sono espressi come percentuale rispetto ai livelli basali (calcolati

come media di due campioni precedenti il trattamento) e corrispondono alla media ± SEM di n=5 (L-DOPA

+ ringer), n=8 (L-DOPA + telenzepina 100 nM) e n=5 (telenzepina 100nM + salina) ratti. *p<0.05 **p<0.01

significativamente differente rispetto al controllo (L-DOPA + ringer). L’analisi statistica è stata eseguita

mediante ANOVA a due vie seguita dal test di Bonferroni.

45

4.2 EFFETTO DI PD-102807 SULLE’ESPRESSIONE DELLE LID ED I

LORO CORRELATI NEUROCHIMICI

Lo stesso protocollo utilizzato per la telenzepina è stato riprodotto con il composto PD-102807.

Al fine di preservare la selettività di PD-102807 verso i recettori M4, abbiamo scelto una

concentrazione (3 µM) che è attesa generare livelli extracellulari di composto circa 30 volte

superiori ai valori di affinità per i recettori M4 (91 nM). I dati prodotti sono parziali in quanto

mancano i valori del gruppo trattato con PD-102807 da solo. La perfusione intrastriatale con

PD-102807 3 µM preveniva lo sviluppo degli AIMs negli animali discinetici sottoposti a microdialisi.

Questo effetto antidiscinetico era correlato a significative variazioni del profilo neurochimico della

L-DOPA (FIGURA 12).

FIGURA 12 . Valutazione delle discinesie in ratti emilesionati con 6-OHDA, cronicamente trattati con

L-DOPA (6mg/Kg) e benserazide (12 mg/Kg) e sottoposti a microdialisi. La L-DOPA è stata somministrata,

i.p., 40 min dopo la perfusione intrastriatale di PD-102807 3µM e soluzione ringer. I movimenti anomali

involontari (AIMs) assiali (axial), degli arti (limb) e orolinguali (orolingual), collettivamente ALO sono stati

osservati per 1 minuto ogni 20 minuti per un totale di 120 minuti dopo la somministrazione di L-DOPA. I

dati sono espressi in valore assoluto, come somma cumulativa degli score attribuiti agli ALO AIMs e

corrispondono alla media n=3 (PD-102807) e n=5 (L-DOPA) ratti. L’analisi statistica è stata eseguita

mediante ANOVA a due vie seguita dal test di Bonferroni.

46

In FIGURA 13 sono mostrate i livelli nigrali di GLU e GABA in seguito a perfusione intrastriatale

dell’antagonista M4. E’ stata osservata una significativa riduzione dell’incremento dei livelli di

GABA dopo somministrazione di L-DOPA (Fig. 13A) mentre i livelli di GLU non variavano in

maniera significativa tra il gruppo degli animali perfusi con PD-102807 o Ringer (Fig. 13B).

FIGURA 13. Effetti della somministrazione acuta di L-DOPA (6 mg/Kg) e benserazide (12 mg/Kg) sul

rilascio di GABA (A) e GLU (B) nigrale a seguito di perfusione intrastriatale con PD-102807 (3µM) o

soluzione ringer. I livelli dei due neurotrasmettitori sono stati monitorati ogni 20 minuti per 120 minuti dopo

la somministrazione di L-DOPA. I dati sono espressi come percentuale rispetto ai livelli basali (calcolati

come media di due campioni precedenti il trattamento) e corrispondono alla media +- SEM di n=5 (L-DOPA

+ ringer) e n=3 (L-DOPA + PD-102807 3µM) ratti. L’analisi statistica è stata eseguita mediante ANOVA a

due vie seguita dal test di Bonferroni. 47

Per quanto riguarda lo striato, come per telenzepina, è stata osservata una significativa riduzione

dell’aumento dei livelli di GLU dopo somministrazione acuta di L-DOPA negli animali perfusi con

PD-102807 (FIG. 14A) mentre non si osservava alcuna differenza nel rilascio di GLU tra il gruppo

degli animali perfusi con PD-102807 o con Ringer (FIG 14b).

FIGURA 14. Effetti della somministrazione acuta di L-DOPA (6 mg/Kg) e benserazide (12 mg/Kg) sul

rilascio di GABA (A) e GLU (B) striatale a seguito di perfusione intrastriatale con PD-102807 (3µM) o

soluzione ringer. I livelli dei due neurotrasmettitori sono stati monitorati ogni 20 minuti per 120 minuti dopo

la somministrazione di L-DOPA. I dati sono espressi come percentuale rispetto ai livelli basali (calcolati

come media di due campioni precedenti il trattamento) e corrispondono alla media +- SEM di n=5 (L-DOPA

+ ringer) e n=3 (L-DOPA + PD-102807 3µM) ratti. **p<0.01 significativamente differente rispetto al

controllo (L-DOPA + ringer). L’analisi statistica è stata eseguita mediante ANOVA a due vie seguita dal test

di Bonferroni. 48

5

DISCUSSIONE

Recenti studi hanno dimostrato che l’iperattività degli interneuroni colinergici striatali può essere

correlata con l’espressione delle LID (Ding et al., 2011). Dato che l’interneurone colinergico è in

grado di modulare entrambe le vie striatofugali, cioè la via diretta ed indiretta, in questo studio

abbiamo voluto testare l’efficacia di antagonisti preferenziali per i recettori muscarinici M1 e M4,

rispettivamente telenzepina e PD-102807, nel modificare le LID e i loro correlati neurochimici.

Infatti, sono questi i due sottotipi recettoriali maggiormente espressi dai MSN che danno origine

alla via striato-nigrale diretta ed indiretta.

Innanzitutto una considerazione di tipo metodologico. Nel nostro protocollo sperimentale i due

antagonisti muscarinici sono stati perfusi localmente attraverso un probe da microdialisi

impiantato nello striato. Questo approccio non solo ha permesso di colpire in maniera selettiva i

recettori muscarinici striatali, ma anche di controllare esattamente la concentrazione di

antagonista aggiunta al ringer di perfusione, in modo da raggiungere nei liquidi extracellulari

livelli di antagonista selettivi per il sottotipo di recettore desiderato. Un problema legato alla

farmacologia degli antagonisti muscarinici, infatti, è la loro scarsa selettività. E’ pertanto molto

importante non raggiungere concentrazioni che potrebbero andare ad interagire con altri recettori

muscarinici, confondendo l’interpretazione del dato. Questo obiettivo sembra essere stato

raggiunto dal momento che sia telenzepina che PD-102807 esercitano chiari effetti farmacologici

a concentrazioni extracellulari stimate essere (con un recupero della sonda in vitro del 10%) di

poche volte (3-5) superiori ai valori di affinità per i recettori M1 e M4, rispettivamente, quindi

selettive per questi sottotipi.

Diversi studi hanno mostrato che i recettori muscarinici hanno una diversa distribuzione sui neuroni

striatali. Così, i MSN striato-pallidali esprimono prevalentemente M1 mentre i MSN striato-nigrali

sia M1 che M4. Per ciò che riguarda i recettori M2 sono quasi esclusivamente espressi dagli

interneuroni colinergici, assieme agli M4. La diversa distribuzione dei recettori M1 e M4 sui MSN

permette alla ACh di modulare in maniera diversa le due vie striatofugali. Tuttavia, i risultati dello

studio appaiono alquanto sorprendenti visto che sia il blocco M1 che, più profondamente, il blocco

M4, prevengono l’espressione delle LID. Ancora piuttosto sorprendentemente, in entrambi i casi

l’attenuazione delle discinesie si accompagna ad una riduzione della stimolazione indotta da L-

DOPA del rilascio di GABA in SNpr e del rilascio di GLU in striato. Ciò suggerisce che entrambi

gli antagonisti agiscano su un meccanismo comune.

L’attivazione dei recettori M1 è stata correlata all’aumento della eccitabilità neuronale della via

diretta e di quella indiretta. Ciò non sorprende visto che gli M1 si accoppiano a Gq. Al contrario, i

recettori M4 sono accoppiati a Gi, il che è