Tesi di laurea triennale in chimica

L'a-tocoferolo, uno dei più potenti antiossidanti interruttori di catena

Facoltà e dipartimento

Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Dipartimento di Chimica
Corso di laurea triennale in Chimica
Francesca Fedeli
Matricola 1897842
Relatore: Osvaldo Lanzalunga
A.A. 2021-2022

Indice

• Introduzione 4
• 1. Interruzione del processo perossidativo mediante l'intervento di antiossidanti fenolici 8
  • 1.1 Meccanismo d'azione delle specie radicaliche 8
  • 1.2 Modulazione della capacità antiossidante dei fenoli mediante formazione di legami a idrogeno 11
  • 1.3 Antiossidanti per trasferimento di elettroni 17
• 2. Capacità antiossidante dell’α-tocoferolo 21
  • 2.1 Reattività dei tocoferoli a confronto 21
  • 2.2 Effetti stereoelettronici nell’α-tocoferolo 24
  • 2.3 Rigenerazione della vitamina E da parte dell’anione ascorbato 28
• 3. Bioattività dell’α-tocoferolo 33
  • 3.1 L’α-tocoferolo all’interno delle membrane cellulari 33
  • 3.2 Il ruolo e la stereochimica della catena fitilica dell’α-tocoferolo 35
  • 3.3 La funzione degli antiossidanti nei tessuti tumorali 38
  • 3.4 Vitamina E – tra i migliori antiossidanti interruttori di catena presenti nel sangue umano 39
• Conclusioni 42
• Bibliografia 44
• Ringraziamenti 46

Introduzione

Nelle ultime decadi le ricerche effettuate nel campo degli antiossidanti sono aumentate in modo considerevole. Tra i vari motivi di interesse di tali ricerche è inclusa la conoscenza delle capacità antiossidanti dei costituenti dei cibi che vengono consumati ogni giorno. Diversi studi clinici hanno stabilito un’inversa proporzionalità tra l’assunzione di frutta e verdura e l’insorgenza di patologie cardiovascolari, tumori, e disfunzioni legate all’invecchiamento. Gli antiossidanti assunti con la dieta, tra cui composti polifenolici e carotenoidi, giocano un ruolo fondamentale nella prevenzione contro lo stress ossidativo.

Tuttavia, l’accezione di antiossidante varia leggermente in base alla disciplina scientifica. In biochimica e in medicina gli antiossidanti sono degli enzimi o altre sostanze organiche che contrastano gli effetti dannosi dell’ossidazione nei tessuti animali. Nella chimica industriale il termine antiossidante si riferisce invece a quei composti in grado di ritardare l’autossidazione di prodotti chimici; laddove l’autossidazione è causata da reazioni radicaliche a catena tra ossigeno e substrati. Nella scienza degli alimenti, infine, essi prevengono l’irrancidimento dei grassi nei cibi, ad opera delle specie reattive all’ossigeno (ROS); impedendone talvolta la formazione.

L’obiettivo di questo elaborato è di descrivere la straordinaria capacità antiossidante di quello che viene da molti considerato uno dei migliori antiossidanti che operano con meccanismo di interruzione di catena (chain-breaking antioxidant): l’α-tocoferolo. Verrà in primis analizzato il meccanismo di azione degli antiossidanti fenolici, i quali intervengono nella inibizione del processo di perossidazione lipidica. Tale processo comprende tre fasi: iniziazione, propagazione e terminazione.

La fase di iniziazione prevede la produzione di specie reattive di natura radicalica, causata da calore, luce o trasferimento di elettroni da parte di agenti riducenti. Si tratta principalmente di specie reattive all’ossigeno, o all’azoto (ROS o RNS) che si generano all’interno dell’organismo, le quali avviano un sistema di reazioni a catena che conducono all’invecchiamento cellulare. In particolare, verranno analizzati due degli ossidanti più rilevanti dal punto di vista biologico: l’ossigeno singoletto e il radicale ossidrilico.

Il primo, generato a partire dalla dismutazione spontanea dell’anione superossido o dalla decomposizione non fotochimica del perossido di idrogeno, può essere disattivato da uno spegnitore (quencher) fisico quale il β-carotene. Il secondo invece, prodotto della reazione tra perossido di idrogeno e Fe²⁺, è estremamente reattivo nei confronti di DNA, proteine e lipidi.

L’attività antiossidante dei fenoli può essere modulata mediante interazioni non covalenti, specialmente legami idrogeno. Si mostrerà pertanto come i legami idrogeno intramolecolari e intermolecolari siano in grado di reprimere o aumentare la reattività degli antiossidanti. La reattività di questi ultimi dipende dalla costante di velocità della reazione di donazione di un atomo di idrogeno al perossil radicale, e la conseguente formazione di fenossil radicali, stabilizzati per risonanza (figura 1).

Figura 1. Reazione HAT (hydrogen atom transfer) del fenolo, come azione antiossidante. Si vedrà appunto quali sono i fattori in grado di modificare tali costanti, tra questi l’energia di dissociazione del legame O-H (BDE - Bond Dissociation Energy), l’effetto dei sostituenti e l’effetto del solvente.

In particolare, il mezzo di reazione può determinare una diminuzione del potere antiossidante instaurando legami idrogeno tra il gruppo fenolico dell’antiossidante e il solvente stesso, attraverso un effetto classico del solvente (KSE) o remoto (RKSE). In aggiunta agli antiossidanti donatori di idrogeno verranno analizzati anche quelli che agiscono tramite trasferimento di elettroni. Gli antiossidanti di questo tipo bloccano il processo perossidativo trasferendo un elettrone all’ossidante, dunque riducendolo.

Per quanto riguarda l’α-tocoferolo verranno messi in luce i fattori che lo rendono un antiossidante molto efficiente nel confronto con gli altri tocoferoli. Tra questi fattori vi è la sua elevata velocità nel reagire con i perossil radicali. Tale velocità può essere determinata a seguito di un saggio sull’ossidazione dello stirene, promossa dall’azo-bis-isobutirronitrile (AIBN).

Di notevole importanza sono anche gli effetti stereoelettronici legati alla stabilizzazione del fenossil radicale prodotto per effetto della delocalizzazione elettronica per via coniugativa. Verrà descritta anche la rigenerazione della vitamina E da parte dell’anione ascorbato, il quale, riducendo l’α-tocoferossil radicale ad α-tocoferolo, garantisce che quest’ultimo protegga le biomembrane dalla degradazione lipidica.

Verrà anche esaminata la bioattività di questa importante vitamina. Grazie alla sua struttura essa si localizza nel doppio strato fosfolipidico delle biomembrane, dove appunto avvengono i processi di autossidazione. Tra gli otto stereoisomeri il più attivo è l’RRR-α-tocoferolo, riconosciuto preferenzialmente dalle membrane dei globuli rossi.

Si mostrerà inoltre come l’elevata velocità della divisione cellulare nei tessuti tumorali sia dovuta alla scarsa attività della perossidazione lipidica, in quanto i prodotti del processo perossidativo inibiscono la divisione cellulare. Infine, a seguito dell’analisi dei lipidi estratti dal plasma, analizzati con i vari tocoferoli tramite HPLC, si giungerà alla conclusione che l’α-tocoferolo è il miglior chain-breaking antioxidant del sangue umano. Si dimostrerà per ultimo come l’uomo sia stato in grado di sintetizzare ex novo un composto con una bioattività addirittura maggiore di questo eccezionale antiossidante.

1. Interruzione del processo perossidativo mediante l'intervento di antiossidanti fenolici

1.1 Meccanismo d'azione delle specie radicaliche

La perossidazione lipidica è una reazione di ossidazione causata dai radicali liberi presenti nell’organismo, che conduce alla degradazione degli acidi grassi. L’intero processo può essere schematizzato in tre fasi principali: iniziazione, propagazione e terminazione.

Iniziazione: Il primo step del processo perossidativo consiste nella scissione omolitica di un precursore molecolare che porta alla formazione del radicale (1). La rottura del legame omolitico può essere promossa dal calore, dalla luce, oppure dal trasferimento di un elettrone da una specie riducente, quale il Fe²⁺, all’idroperossido ROOH. La reazione generale è la seguente: In-In → 2 In^• (1).

Il radicale In^• a questo punto reagisce con una molecola lipidica RH, tramite la reazione (2), generando il radicale R^•. Quest’ultimo è un radicale centrato sul carbonio, che si forma a seguito dell’estrazione di un atomo di idrogeno dalla specie lipidica. In^• + RH → In-H + R^• (2).

La maggior parte degli iniziatori sono perossidi o azocomposti. Quest’ultimi sono composti azotati che generano radicali R^• con perdita di azoto gassoso N₂ (3). In particolare, si tratta di azocomposti alchilici che subiscono rottura dei legami carbonio-azoto, se sottoposti ad elevate temperature o se sottoposti a irradiazione. R₂N₂ → 2 R^• + N₂ (3).

L’azo-bis-isobutirronitrile (AIBN) è senza dubbio tra i più noti iniziatori all’azoto. Esso si decompone eliminando una molecola di azoto (figura 2), generando due 2-ciano-2-propil radicali, i quali reagiranno con una molecola lipidica RH, formando il radicale R^•.

N₂C(CH₃)₂ + 2 N₂N₂C(CH₃)₂ → 2 C(CH₃)₂CN^• + 2 N₂ (Figura 2. Decomposizione dell’AIBN con formazione di azoto gassoso e due 2-ciano-2-propil radicali.)

Propagazione: Il radicale formato nella fase iniziale reagisce rapidamente con l’ossigeno, formando il perossil radicale ROO^• (4). In uno step successivo più lento avviene poi l’eliminazione di un atomo di idrogeno dalla specie lipidica RH (5). Si ha così la rigenerazione dell’idroperossido e la formazione del radicale R^•, il quale a sua volta reagirà propagando ulteriormente la reazione a catena. R^• + O₂ → ROO^• (4). ROO^• + RH → ROOH + R^• (5).

Terminazione: La fase di propagazione termina nel momento in cui due perossil radicali reagiscono tra loro per formare prodotti non radicalici (6). ROO^• + ROO^• → Prodotti (6).

Negli organismi viventi la degradazione degli acidi grassi è innescata da specie contenenti atomi di ossigeno o azoto con caratteristiche radicaliche. Esse sono dette ROS o RNS (reactive oxygen\nitrogen species) e si contraddistinguono per la loro marcata reattività e pericolosità. Per contrastare il danno ossidativo vi è pertanto un sistema di difesa biologico costituito dagli antiossidanti che le convertono in specie innocue. Tra i ROS più reattivi si possono annoverare l’ossigeno singoletto O₂¹ e il radicale ossidrilico OH^•, ma sono di notevole importanza anche l’anione superossido O₂^•-, il perossido di idrogeno H₂O₂ e il perossinitrito ONOO^-.

L’ossigeno singoletto O₂¹ è uno stato eccitato dell’ossigeno molecolare in cui i due elettroni spaiati si accoppiano con spin antiparallelo (figura 3), e viene per lo più generato in presenza di luce o di fotosensibilizzatori. Figura 3. Configurazione elettronica dell’ossigeno singoletto. L’ossigeno singoletto può essere disattivato per via fisica, tramite il trasferimento della sua energia di eccitazione ad altre molecole. Il β-carotene è un eccellente quencher per questo radicale, poiché è in grado di disattivare il trasferimento dell’energia di eccitazione. Difatti, l’ossigeno singoletto emette una caratteristica fosforescenza a 1270 nm e la presenza di composti disattivanti quali il β-carotene o il SOSDF (tetra-tert-butilftalocianina) spegne tale emissione. Il meccanismo di azione del β-carotene prevede lo spegnimento dell’ossigeno singoletto in ossigeno molecolare O₂, secondo la reazione: O₂¹ + β-carotene → O₂ + β-carotene^*.

Il radicale ossidrilico OH^• biologicamente deriva principalmente dalla reazione tra perossido di idrogeno e Fe²⁺, in quella che viene definita la reazione di Fenton (7). H₂O₂ + Fe²⁺ → HO^• + HO^- + Fe³⁺ (7).

Tuttavia, il complesso H₂O₂/Fe²⁺ rende complicata l’interpretazione delle proprietà antiossidanti. Questo perché diversi antiossidanti agiscono come chelanti, pertanto diventa impossibile distinguere se l’antiossidante abbia chelato il Fe²⁺ oppure abbia disattivato il radicale ossidrilico. Vi sono addirittura alcuni antiossidanti quali la vitamina C che agiscono come pro-ossidanti, riducendo il Fe³⁺ a Fe²⁺, catalizzando dunque la produzione di OH^•. Infatti l’acido ascorbico, in combinazione con il ferro (II) ed un eccesso di perossido di idrogeno, genera un aumento di radicali ossidrilici.

Il radicale ossidrilico risulta notevolmente dannoso al livello dei sistemi biologici poiché reagisce rapidamente con specie quali i lipidi, le proteine e il DNA. Gli antiossidanti spesso non sono in grado di proteggere queste biomolecole, poiché la loro capacità antiossidante è trascurabile rispetto alla reattività del radicale in analisi. Un’alternativa valida è quella di prevenirne la formazione deattivando il radicale ossidrilico mediante chelazione dello ione ferroso, oppure convertendo il perossido di idrogeno in specie innocue quali acqua o ossigeno molecolare. Infatti, le sostanze chelanti, contenute in molti alimenti, possono essere considerate degli antiossidanti preventivi.

1.2 Modulazione della capacità antiossidante dei fenoli mediante formazione di legami a idrogeno

La maggior parte degli antiossidanti che agiscono con un meccanismo di interruzione di catena sono specie fenoliche. Le interazioni non covalenti, in particolare i legami idrogeno, hanno una notevole influenza sull’attività degli antiossidanti fenolici, poiché modulano la loro reattività nei confronti delle specie radicaliche. L’efficacia di questi antiossidanti risiede nella velocità con cui essi donano un atomo di idrogeno al perossil radicale (8).

Tale velocità deve essere necessariamente maggiore della velocità con cui viene trasferito l’idrogeno dalla specie lipidica al perossil radicale (9). LOO^• + ArOH → LOOH + ArO^• (8) k_inh = k. LOO^• + LH → LOOH + L^• (9).

La costante di velocità della reazione (8) è pertanto determinante per lo studio della capacità antiossidante degli antiossidanti fenolici. Quest’ultima dipende principalmente dalla BDE del legame O-H del fenolo e dall’effetto del solvente (KSE) o (RKSE). In generale si può affermare che gruppi elettron donatori diminuiscono la BDE, mentre gruppi elettron attrattori la aumentano. Ciò dipende fondamentalmente dal loro diverso effetto di stabilizzazione del fenossil radicale (ArO^•) formatosi a seguito della reazione con il perossil radicale.

Il solvente ha invece una notevole influenza sulla reattività dei fenoli in quanto può instaurare dei legami idrogeno intermolecolari con l’ossidrile del fenolo.

Legami idrogeno intramolecolari: Il gruppo ossidrilico del fenolo è spesso prossimo a gruppi funzionali quali carbossili, metossili o altri ossidrili. Questa vicinanza favorisce l’instaurazione di legami idrogeno intramolecolari, che modulano la reattività dell’antiossidante. Come già accennato, i sostituenti elettrondonatori sull’anello fenolico sono particolarmente importanti.