Tesi Biotecnologie

MATERIALI E METODI

La strategia sperimentale ha previsto la collezione di campioni di sangue prelevati da gestanti dai quali è stato ottenuto il plasma. Successivamente, grazie all'utilizzo di kit di estrazione è stato isolato il DNA circolante totale comprendente sia il materno che il fetale. La determinazione del sesso è stata possibile grazie all'amplificazione di porzioni del cromosoma Y, grazie all'impiego di due tecniche: la RTqPCR e la ddPCR. A tale scopo sono stati analizzati 139 campioni di sangue prelevati da gestanti, stratificati in base alle settimane di gestazione in 4 range.

RISULTATI

RACCOLTA DEI CAMPIONI ANALIZZATI E RELATIVA STRATIFICAZIONE IN BASE ALLE SETTIMANE DI GESTAZIONE Al fine di sviluppare una metodica di diagnosi prenatale non invasiva in grado di determinare il sesso del feto, sono stati ottenuti 139 campioni di sangue interoprelevati da donne incinta a diverse settimane di gestazione. I campioni in esame risultano

essere molto eterogenei per quanto riguarda l'età gestazionale; la popolazione campionaria presenta una distribuzione, in termini di settimane digestazione, al momento del prelievo, compresa tra le 4 e le 39 settimane. I campioni sono stati stratificati in 4 range gestazionali in base alle settimane digestazione:

• 34 campioni tra le 30 e le 39 settimane (in verde)
• 26 campioni tra le 20 e le 29 settimane (in azzurro)
• 40 campioni tra le 10 e le 19 settimane (in arancione)
• 39 campioni tra le 4 e le 9 settimane (in rosso)

DETERMINAZIONE DEL DNA FETALE MASCHILE CIRCOLANTE IN PLASMA MATERNO MEDIANTE REAL-TIME PCR QUANTITATIVA

La metodica comunemente e maggiormente utilizzata, al fine di determinare il sesso fetale, è la Real Time PCR quantitativa grazie alla sua sensibilità, specificità e facilità di applicazione. Sono stati impiegati due saggi di amplificazione, entrambi costituiti da due primer (forward e reverse) e da una sonda Taqman coniugata al fluoroforo FAM.

Il primo saggio, specifico per il gene SRY, è stato utilizzato per amplificare unicamente il DNA maschile, poiché il gene SRY è localizzato solo sul cromosoma Y. Il secondo saggio, invece, specifico per il gene della β-globina umana, presente quindi in modo costitutivo in ogni DNA genomico, è stato utilizzato per amplificare sia il DNA fetale che quello materno, allo scopo di ricavare la totalità del DNA circolante estratto. Ogni reazione è stata allestita in un volume finale di 15 microlitri contenenti il templato, il rispettivo saggio di amplificazione e la TaqMan Universal RCR Mastermix. Questa mix contiene la DNA polimerasi, i dNTPs e il MgCl2, tutti componenti necessari per far avvenire la reazione. Dopo un primo step di 2 minuti a 50°C e un secondo di 10 minuti a 95°C, la fase di denaturazione ha previsto 15 secondi a 95°C, seguita da un minuto a 60°C per l'appaiamento dei primer e delle sonde e l'allungamento.

Questi ultimi due step sono stati ripetuti per 50 cicli così da incrementare il prodotto da analizzare a causa dell'esigua concentrazione del DNA fetale circolante nel plasma materno. Ogni campione è stato amplificato in duplicato per ogni saggio.

Il sesso fetale è considerato maschile o femminile a seconda che la curva di amplificazione del gene SRY venga generata o meno, rispettivamente. In figura sono riportati quattro esempi di curve di amplificazione ottenute tramite RT-qPCR. In alto sono mostrati due grafici relativi all'amplificazione del gene SRY, dove l'intensità di fluorescenza emessa (ΔRn) è in funzione dei cicli di amplificazione. Il grafico a sinistra, relativo a un feto maschio, mostra come entrambe le curve del doppietto siano visibili. Il grafico a destra è relativo a un feto femmina e mostra l'assenza di curve di amplificazione del gene SRY.

In basso sono riportati i due grafici relativi...

le 19, la percentuale di determinazione del sesso è stata del 90%, mentre per le settimane di gestazione inferiori a 10 la percentuale è stata del 70%. Questi risultati confermano l'efficacia del metodo di amplificazione del gene SRY per la determinazione del sesso fetale tramite RTq-PCR. La maggiore concentrazione di DNA materno rispetto a quello fetale può influire sulla sensibilità del test nelle prime settimane di gestazione, ma a partire dalla 20a settimana la determinazione del sesso è affidabile al 100%. Questo tipo di analisi è di fondamentale importanza per la diagnosi precoce di malattie genetiche legate al sesso, come la sindrome di Turner o la sindrome di Klinefelter. Inoltre, può essere utilizzato per scopi diagnostici durante la gravidanza, ad esempio per la diagnosi precoce di malattie genetiche ereditarie. In conclusione, la RTq-PCR è un metodo affidabile e sensibile per la determinazione del sesso fetale, con una percentuale di successo elevata a partire dalla 20a settimana di gestazione.nel fatto che la determinazione del sesso fetale tramite qRT-PCR non è affidabile prima della 14esima settimana di gestazione. Questo è dovuto a diverse problematiche riscontrate durante l'impiego di questa tecnica. Una delle principali problematiche è la presenza di una quantità insufficiente di materiale genetico fetale nelle prime settimane di gestazione. Questo rende difficile ottenere un campione di DNA di qualità sufficiente per l'analisi. Inoltre, durante le prime settimane di gestazione, il sesso fetale non è ancora completamente differenziato e quindi i marcatori genetici utilizzati per la determinazione del sesso potrebbero non essere ancora presenti o non essere sufficientemente espressi. Un'altra problematica riguarda la presenza di interferenze nella reazione di amplificazione del DNA durante la qRT-PCR. Queste interferenze possono essere causate da inibitori presenti nel campione o da errori nella procedura di estrazione del DNA. Infine, è importante considerare che la determinazione del sesso fetale tramite qRT-PCR richiede una corretta interpretazione dei risultati da parte di personale specializzato. Errori di interpretazione possono portare a falsi positivi o falsi negativi nella determinazione del sesso. In conclusione, nonostante la qRT-PCR sia una tecnica affidabile per la determinazione del sesso fetale, è necessario considerare le problematiche sopra descritte e attendere almeno la 14esima settimana di gestazione per ottenere risultati accurati.

Nella difficoltà a riconoscere feti di genere maschile a causa dell'assenza di curve di amplificazione per il gene SRY. Se, in seguito all'amplificazione di un DNA fetale circolante maschile, non si ha la generazione di entrambe le curve relative al doppietto, si è indotti a fare una diagnosi errata poiché il risultato dell'analisi indicherebbe che il feto è di genere femminile. Considerazioni simili valgono nel caso in cui, in seguito all'amplificazione di un DNA fetale circolante maschile, viene generata una sola curva relativa al doppietto: in questo caso specifico la diagnosi non è errata, ma non si può eseguire in quanto non è possibile capire se l'unica curva generata sia realmente l'amplificazione del gene SRY o frutto di una contaminazione (considerando il numero elevato dei cicli di amplificazione). Infine, un'ulteriore problematica è data dal fatto che entrambe le curve del doppietto sono presenti,

ma salgono a cicli molto diversi l'una dall'altra, cioè possiedono un ΔCt>0,5. Dal momento che le curve di amplificazione relative al doppietto devono essere sovrapponibili, con una differenza di Ct massimo di 0.5, l'analisi in tal caso risulta non attendibile e di conseguenza anche la quantificazione. Le problematiche, finora descritte, sono riconducibili, in tutti i casi, all'esigua quantità di DNA fetale circolante presente nel plasma materno a settimane gestazionali precoci (pari o inferiori a 14 settimane). Pertanto si può concludere che, nonostante la sensibilità e specificità della metodica di qRT-PCR, per basse settimane di gestazione, partendo da una quantità di templato esigua, questa tecnica presenta delle limitazioni per la diagnosi attendibile del sesso del nascituro. Per tali motivi, risulta necessario l'utilizzo, per settimane di gestazione molto precoci, di una tecnica maggiormente sensibile ed

efficiente al fine di determinare il sesso fetale come la Droplet Digital PCR.

SET-UP DELL'ANALISI QUANTITATIVA DEL DNA MASCHILE TRAMITE LA DROPLET DIGITAL PCR

La ddPCR è una tecnologia recente nota per la sua elevata sensibilità. La grande sensibilità della tecnica è dovuta all'estrema diluizione, e quindi suddivisione, del campione in gocce costituite da un'emulsione acqua in olio generate grazie allo strumento QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System. Se la diluizione è avvenuta correttamente all'interno di ciascuna delle aliquote avverrà una singolare azione di amplificazione, aumentando in questo modo la sensibilità della metodica in esame. Per tale motivo la ddPCR è stata utilizzata in questa tesi come approccio alternativo alla qRT-PCR per l'identificazione del sesso fetale a settimane di gestazione molto precoci. Allo scopo di identificare il DNA fetale e totale circolante, sono stati

utilizzo del DNA circolante estratto da plasma. Il primo saggio utilizza il fluoroforo FAM ed è specifico per il gene SRY. Questo saggio è stato traslato dalla qRT-PCR alla ddPCR al fine di identificare e quantificare il gene SRY a partire dal DNA circolante estratto da plasma. Il sesso fetale sarà considerato maschile o femminile in base al numero di eventi positivi per la fluorescenza FAM, che corrispondono al gene SRY. Il secondo saggio utilizza il fluorocromo HEX ed è specifico per il gene ElF2C1. Questo gene, presente sul cromosoma 1 e codificante per una proteina argonauta, è considerato un gene di riferimento in quanto è presente in modo costitutivo nel DNA. Pertanto, questo saggio viene utilizzato per identificare il DNA totale circolante estratto, al fine di confermare l'effettivo utilizzo del DNA circolante estratto da plasma.

Presenza di DNA nel caso in cui non si abbia la presenza di eventi positivi per l'SRY, come per il DNA circolante estratto da plasma corrispondente a feti femmina. Essendo i saggi marcati con due fluorofori differenti, aventi spettri di emissione non sovrapposti, sarà possibile far avvenire entrambe le amplificazioni nella stessa reazione, con il vantaggio di aumentare la precisione dell'analisi e utilizzare la metà del materiale di partenza.

Ogni reazione è stata allestita in singolo, come da manuale, in un volume finale di 22 µl contenenti il templato, entrambi i saggi di amplificazione, e la ddPCR™ Supermix for Probes. Questa Mix contiene la DNA polimerasi, i dNTPs e il MgCl2: tutti componenti necessari per far avvenire la reazione. In seguito alla generazione dell'emulsione ogni templato è stato amplificato: dopo un primo step di 10 minuti a 95°C, sono stati effettuati 45 cicli termici ciascuno caratterizzato da 30 secondi a 94°C.

(fase di denaturazione)