Tesi Biotecnologie

Università degli studi di Ferrara

Dipartimento di scienze della vita e biotecnologie

Corso di laurea triennale in biotecnologie per la salute

Determinazione del sesso fetale da plasma materno: due tecniche a confronto

Relatore: Prof.ssa Monica Borgatti

Laureanda: Melissa Bergantin

Correlatore: Dott.ssa Elisabetta D’Aversa

Anno Accademico 2019-2020

Indice

• Introduzione ...................................................................................................... 3
• Diagnosi prenatale ............................................................................................ 5
• Diagnosi prenatale invasiva ............................................................................. 5
  • Tecniche di prelievo ................................................................................... 6
  • Villocentesi .................................................................................................. 6
  • Cordocentesi .............................................................................................. 7
  • Embriofetoscopia ....................................................................................... 7
• Diagnosi prenatale non invasiva ....................................................................... 7
  • Cellule fetali .............................................................................................. 8
  • DNA circolante fetale ................................................................................. 9
    • Origine .................................................................................................. 9
    • Stabilità ............................................................................................... 10
    • Quantità e dimensioni ......................................................................... 10
    • Metodi di arricchimento e isolamento .................................................. 11
  • Applicazioni diagnostiche del cffDNA ......................................................... 12
    • Determinazione del sesso .................................................................... 12
    • Determinazione del fattore Rh ............................................................ 13
    • Malattie monogeniche ......................................................................... 14
    • Aneuploidie .......................................................................................... 15
    • Disturbi connessi alla gravidanza ......................................................... 15
• Tecniche di diagnosi non invasiva ................................................................... 16
  • Kit commerciali per la NIPD (Non Invasive Prenatal Diagnosis) .................... 16
  • Real Time PCR quantitativa ....................................................................... 17
  • Tecnologia Droplet Digital PCR (ddPCR) ..................................................... 19
    • Generazione delle gocce ..................................................................... 19
    • Amplificazione ..................................................................................... 20
    • Rilevazione .......................................................................................... 20
    • Analisi .................................................................................................. 20
    • Vantaggi e applicazioni ........................................................................ 21
• Materiali e metodi ............................................................................................ 23
• Risultati ........................................................................................................... 24
  • Raccolta dei campioni analizzati e relativa stratificazione in base alle settimane di gestazione .................................................. 24
  • Determinazione del DNA fetale maschile circolante in plasma materno mediante Real-Time PCR quantitativa .......................... 24
  • Problematiche riscontrate nell’impiego della Real-Time PCR quantitativa per la determinazione del sesso fetale ................... 26
  • Set-up dell’analisi quantitativa del DNA maschile tramite la Droplet Digital PCR ...................................................................... 27
• Conclusioni e prospettive future ...................................................................... 30

Introduzione

Per diagnosi prenatale si intende l’insieme delle indagini, strumentali e di laboratorio, mediante le quali è possibile monitorare lo stato di salute e di benessere del feto durante il corso della gravidanza. Negli ultimi anni, grazie allo sviluppo di metodi innovativi è stato possibile mettere a punto strategie sperimentali in grado di poter effettuare un’indagine dettagliata su diverse patologie di origine genetica, quali malattie monogeniche, disordini legati al sesso ed aneuploidie.

Ad oggi le tecniche di diagnosi prenatale prevedono il prelievo di materiale di origine fetale tramite approcci invasivi, come la villo centesi o l’amniocentesi. Tali approcci, sebbene siano efficienti, possono essere effettuati solo a settimane di gestazione piuttosto elevate, sono invasivi e possono comportare piccoli rischi di aborto spontaneo. I dati riportano per villo centesi e amniocentesi un rischio di aborto pari a 0,5-1% mentre per la fetoscopia e per la cordocentesi pari al 2-3%.

Negli ultimi anni, grazie alla biologia molecolare si sono sviluppate tecniche non invasive mediante lo studio del DNA fetale nel circolo materno al fine di ottenere una diagnosi attendibile a settimane di gestazione precoci salvaguardando la salute del feto e della gestante.

In questo ambito, si colloca il mio lavoro di ricerca, che ha come obiettivo lo sviluppo di una tecnica di diagnosi prenatale non invasiva basata sull’analisi quantitativa del DNA fetale circolante estratto da plasma materno in grado di determinare il sesso del feto in modo sensibile e accurato anche a settimane di gestazione molto precoci.

A tale scopo sono stati analizzati 139 campioni di sangue prelevati da gestanti che sono stati stratificati in base alle settimane di gestazione in 4 range: tra le 30 e le 39 settimane, tra le 20 e le 29 settimane, tra le 10 e le 19 e tra le 4 e le 9 settimane.

La tecnica maggiormente utilizzata per determinare il sesso del feto è la Real Time PCR quantitativa, una metodica specifica e facile da applicare. Si tratta di una tecnica basata sull’amplificazione di specifiche sequenze di DNA, alle quali si legano sonde fluorescenti che permettono di monitorare in tempo reale la reazione di amplificazione. A questo proposito sono stati utilizzati due saggi: il primo è stato impiegato per amplificare solo il DNA maschile in quanto specifico per il gene SRY; il secondo, invece, specifico per il gene della β-globina umana.

I risultati ottenuti mostrano che la tecnica di Real Time PCR quantitativa sia molto efficiente nel determinare il sesso in campioni fino alla 15 settimana. Mentre, a causa della ridotta quantità di DNA fetale circolante nel plasma materno a settimane precoci di gestazione, a partire dalla 14 settimana, tale tecnica ha mostrato diverse difficoltà nell’identificazione del sesso, rendendo perciò necessario l’utilizzo di una tecnica più accurata e sensibile.

È stata quindi impiegata una tecnologia più recente e innovativa: la Digital Droplet PCR; questa tecnica si basa sull’estrema diluizione del campione in numerose aliquote, all’interno delle quali, se presente, sarà amplificato il DNA di interesse. È stato utilizzato un saggio di amplificazione specifico per il gene EIF2C1, e uno specifico per il gene SRY al fine di ricavare, rispettivamente, il DNA totale circolante e il DNA fetale maschile nel caso di gestanti con feto maschio.

Diagnosi prenatale

Per diagnosi prenatale si intende l’insieme delle indagini grazie alle quali è possibile monitorare lo stato di salute del feto durante la gravidanza. L’impiego delle tecniche di diagnosi prenatale ha come obiettivo l’identificazione di patologie che interessano il feto su base genetica, infettiva, ambientale o iatrogena.

Come riportato da Rennert et al. in uno studio del 1975, inizialmente l’indagine diagnostica consisteva soltanto in un consulto medico di tipo genetico determinato dallo studio della storia famigliare sulle malattie genetiche conosciute fino a quel momento. Successivamente sono state sviluppate delle metodiche più precise per valutare lo stato di salute del feto come amniocentesi, villo centesi e cordocentesi. Queste tecniche sono abbastanza efficienti ma possono essere attuate a settimane di gestazione piuttosto elevate e possono provocare un rischio di aborto del 0,5%-1%. Dati questi presupposti, la scienza sta cercando di ampliare le prospettive di diagnosi al fine di trovare tecniche non invasive capaci di ottenere un’elevata accuratezza diagnostica preservando la salute del nascituro. Inoltre, le nuove tecniche non invasive dovrebbero essere in grado di diagnosticare eventuali patologie in tempi sempre più precoci, in modo tale che i genitori possano essere informati il prima possibile dello stato di salute del feto così da decidere per un eventuale intervento terapeutico o per l’interruzione della gravidanza.

Generalmente, la diagnosi prenatale è svolta in caso di gravidanze a rischio, classificate così in base a diversi fattori, tra cui:

• Storia famigliare di malattie genetiche
• Età della gestante superiore ai 35 anni
• Anomalie fetali rilevate tramite ecografia
• Esposizione a sostanze teratogene
• Malattie infettive riscontrate durante la gravidanza
• Aborti precedenti

La diagnosi prenatale si classifica in:

• Diagnosi prenatale invasiva
• Diagnosi prenatale non invasiva

Diagnosi prenatale invasiva

La diagnostica prenatale invasiva comprende l’insieme delle procedure idonee a prelevare tessuti embrio-fetali od annessi al fine di indagare sospette cromosomopatie correlate a quadri malformativi, per la ricerca di agenti infettivi, per la valutazione di parametri ematologici fetali. Le tecniche attualmente utilizzate sono:

• Il prelievo dei villi coriali (villo centesi)
• Il prelievo del liquido amniotico (amniocentesi)
• Il prelievo di sangue fetale dal cordone ombelicale (cordocentesi o funicolocentesi)
• Embriofetoscopia

La scelta della tecnica da impiegare viene dettata dall’indicazione, dall’epoca di esecuzione del prelievo, dalla specifica esperienza dell’operatore e del laboratorio di riferimento, oltre che dalla preferenza della donna dettagliatamente informata.

Tecniche di prelievo

Villocentesi

Il prelievo dei villi coriali (Chronic Villous Sampling, CVS) è utilizzato per la diagnosi prenatale nel 1° trimestre. I villi coriali sono prolungamenti della placenta generati dalle cellule embrionali del corion che permettono di assorbire ossigeno e nutrienti dal sangue materno. Esistono due metodi di prelievo dei villi coriali: nel caso della villo centesi trans addominale un ago viene inserito nell’addome materno sotto guida ecografia, mentre nel caso della villo centesi trans cervicale si introduce un catetere flessibile nel collo dell’utero. Il tessuto prelevato è composto da tre tipi di cellule fetali: citotrofoblasti, sincizio trofoblasti e cellule mesenchimali. L’analisi dei cromosomi viene effettuata o sui citotrofloblasti, i quali si dividono rapidamente e permettono di ottenere i risultati in 5 giorni; oppure l’analisi viene eseguita sulle cellule mesenchimali, le quali proliferano più lentamente e quindi il referto è ottenuto in circa 20 giorni. Il vantaggio principale di questa metodica è la precocità con la quale viene eseguita (15° settimana), ma lo svantaggio è rappresentato dal rischio di aborto attorno all’1%, il quale può arrivare anche al 2-3% se la procedura viene fatta per via trans viscerale.

Amniocentesi

L’amniocentesi è una delle tecniche invasive più comunemente utilizzate; essa consiste nel prelievo del liquido amniotico per via trans addominale dalla cavità uterina, tutto ciò sotto stretto controllo ecografico. All’interno dell’amnios ci sono cellule di origine fetale, chiamate amniociti, prodotte dallo sfaldamento dei tessuti epiteliali, che sono poi sottoposti ad analisi di laboratorio. Gli amniociti vengono, infatti, concentrati e messi in coltura per 5-7 giorni prima di essere analizzati. I risultati finali sono disponibili in 14 giorni circa. Questa tecnica può essere eseguita a settimane di gestazione basse (dalla 16° alla 18°), nel caso dell’amniocentesi precoce oppure dopo la 25° settimana di gestazione per l’amniocentesi tardiva. Inoltre, anche questa metodica presenta una serie di rischi tra cui: rottura delle membrane interne, sanguinamenti vaginali, infezioni intrauterine, rischio di aborto pari a 0,5-1%. Il rischio reale è variabile a seconda dell’operatore che svolge la procedura.

Cordocentesi

La cordocentesi o funicolocentesi è una metodica che si basa sul prelievo di sangue fetale effettuando una puntura sull’arteria del cordone ombelicale sotto controllo ecografico. In seguito, il materiale fetale prelevato viene messo in coltura e si ottiene il referto entro 48-72 ore. La cordocentesi presenta numerosi svantaggi tra i quali: l’esecuzione è prevista in fasi tardive della gravidanza (tra la 18° e la 20°), possibilità di sviluppare infezioni, rischio di emorragie, perdita di liquido amniotico e ovviamente il pericolo di un aborto spontaneo stimato intorno al 3%.

Embriofetoscopia

L’embriofetoscopia permette di esaminare direttamente il feto fin dalla 5° settimana di gestazione. L’esame è condotto tramite l’utilizzo di uno strumento a fibre ottiche inserito per via transaddominale o trans vaginale e permette di visualizzare l’embrione in trasparenza senza entrare nella cavità ovarica. Tale metodica è utilizzata per confermare diagnosi effettuate tramite ecografie precoci nel primo trimestre di gravidanza e consente di diagnosticare alcune importanti anomalie come la schisi labro leporina o malformazioni degli arti. Questa tecnica presenta, comunque, un rischio di aborto compreso tra il 2 e 3%.

Diagnosi prenatale non invasiva

La diagnosi prenatale non invasiva (NIPD, Non Invasive Prenatal Diagnosis) comprende tutte le procedure in grado di eseguire una diagnosi preservando la salute del feto, evitando così il rischio di aborto tipico dei test invasivi. Le classiche tecniche non invasive sono basate su metodi ecografici e possono essere svolte anche nel primo trimestre di gravidanza; tuttavia, tali metodiche consentono di ottenere solo diagnosi probabilistiche e poco accurate.

Un innovativo screening ecografico è rappresentato dalla translucenza nucale (NT). La translucenza nucale è una fessura translucida a livello della cute nucale del feto visibile in ecografia. La fessura di liquido è una raccolta di linfa che si osserva in tutti i feti nel primo trimestre di gravidanza e può essere appunto misurata con in esame ecografico tra le settimane 11+0 e 13+6 di gestazione. Lo spessore della translucenza nucale è proporzionale al rischio di una malattia cromosomica del feto. Uno spessore che supera una certa soglia, indicativamente 2,5-3mm, correla anche con un rischio più alto per il feto di essere affetto non solo da malattie cromosomiche (Sindrome di Down o trisomia 21, trisomia 18 o trisomia 13) ma anche da malformazioni cardiache e di altri organi come per esempio la spina bifida, l’onfalocele o l’ernia diaframmatica. In genere questa tecnica fornisce un risultato poco accurato, pertanto spesso è associata ad altri tipi di test per aumentarne la sensibilità.

Esistono, inoltre, altri tipi di test, non invasivi, basati sulla possibilità di ricercare nel sangue materno dei marker biochimici come le β gonadotropine corioniche e la proteina plasmatica A che consistono nel loro insieme il Bi-test. Il dosaggio di questi marcatori viene misurato nel primo trimestre di gravidanza, e un loro aumento indica la presenza di aneuploidie, come la Trisomia 21.

Cellule fetali

La scoperta di cellule di origine fetale nel circolo sanguigno materno risale al 1893, ma solo recentemente sono state considerate come fonte di DNA fetale per effettuare la diagnosi prenatale non invasiva di malattie genetiche. Il rapporto tra le cellule fetali e cellule di origine materna oscilla tra 1/10⁹ e 1/10⁵, aumentando all’aumentare delle settimane di gestazione.

Le cellule fetali sono:

• Trofoblasti: i trofoblasti costituiscono un tessuto embrionale che ha lo scopo di nutrire l’embrione e dà origine alla placenta e altri annessi embrionali. Nei primi tre mesi di gravidanza, le cellule del trofoblasto si sfaldano ed entrano nella circolazione materna grazie al sangue che irrora gli spazi tra i villi; successivamente vengono intrappolati nei polmoni della gestante, determinando così la loro diminuzione nel circolo sanguigno. Queste cellule però non vengono utilizzate per la diagnosi prenatale in quanto sono presenti in numero limitato e la mancanza di anticorpi specifici ne rende difficile l’isolamento e l’arricchimento.
• Linfociti: i linfociti fetali sono in grado di attraversare la barriera placentare e di riversarsi nella circolazione materna. Herzenberg et al. nel 1979 furono i primi ad isolare e arricchire i linfociti fetali grazie alla tecnologia FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter), dimostrando che esistono differenze tra linfociti fetali e materni in termini di HLA (Human Leukocyte Antigen). Gli HLA sono antigeni umani di superficie, propri delle cellule linfocitarie, che determinano l’innesco della risposta immunitaria verso sostratti estranei.