Che materia stai cercando?

Isolamento e caratterizzazione di batteriofagi, Tesi Appunti scolastici Premium

Tesi di Laurea Magistrale in Biotecnologie Industriali, riguardante l'isolamento di batteriofagi che infettano Pseudomonas syringae pv. actinidiae, causa del cancro batterico, in modo da utilizzarli come naturali agenti antimicrobici al posto dei normali composti chimici.

Materia di Microbiologia relatore Prof. M. Thaller

Anteprima

ESTRATTO DOCUMENTO

negative staining of the phages. The phages were tested on different strains of PSA and gave

different results. ΦPSA1 whereas ΦPSA2

infects only the new strains of Psa, is able to infect a

wide range of strains of Psa, even other strain of Pseudomonas such as P. s. theae and P.

avellanae. One step growth experiment let us know the latency period, the burst size of a phage.

The time needed to lyses an exponentially growing Psa colture is summarized in the TOD

experiment (Time Of Death). It is a new parameter that we introduced, in order to fully describe

phage’s ability to kill host bacteria. ΦPSA1

the in vitro has a latency period of 100 minutes and a

per bacterial cell; ΦPSA2

burst volume of about 178 virions latency period is 15 minutes and it

particles per bacterial cell. The TOD was assessed only for ΦPSA2

has a burst size of about 92

and it’s about 155

because of its lytic nature minutes. Sensitivity to pH and temperature was

assessed. The two bacteriophages have a quite similar resistance: both of them can survive at pH

values between 4 and 10. At pH 11 lytic activity remain, but in a lower level whereas at pH

values of 2,3,12 vitality is not present. The genomic analysis was performed by enzymatic

digestions using the restriction enzymes BamHI, BclI, EcoRI, HindIII, KpnI, NdeI, PstI, RsaI,

SalI, SmaI, XbaI e XhoI. Then the results were shown through electrophoretic run.

ΦPSA1 is a temperate phage isolated from the leaves of a kiwi tree infected by PSA. It belongs to

the Siphoviridae family because of its contractile tail 200 nm long and a polyhedric head of

60nm. The percentage of lisogeny is about 35%. The host range is quite narrow: it can infect

strain that caused the new epidemics and can’t infect the old ones. The one step

only the PSA

growth experiment shows a long latency phase that is balanced by the high burst volume of

about 178 virions per lysis. The genome is constituted by DNA and only HindIII, KpnI e BclI

can cut it. It can be used as a powerful tool for typing PSA strains but it is not fit for a phage

therapy application due to its temperate nature.

ΦPSA2 is a lytic phage isolated from Rome sewages and as deduced from the morphology seen

on the TEM it belongs to the Podoviridae family because of its polyhedric head of 60nm and the

short non contractile tail. The latency phase is short and lasts about 15 minutes and the burst

volume is about 92 virions every lytic cycle. ΦPSA2 easily infect a wide range of different PSA

closely related

strain isolated from every country the epidemic has spread out, even the Psa’s

strains. The genome is constituted by DNA and EcoRI, NdeI completely digest it.

Due to its in vitro features, the lytic nature and the wide host range above all, it is the best

candidate to test his efficacy in trials in planta and on the field. iv

Isolamento e caratterizzazione di batteriofagi che infettano Pseudomonas syringae pv.

actinidiae, agente causale del cancro del kiwi

L’Actinidia, comunemente noto come kiwi, è una pianta da frutto originaria della Cina molto

importante dal punto di vista economico. A partire dal XX secolo si è diffusa in Nuova Zelanda e

in seguito in tutto il mondo ed è ampiamente coltivata per il suo frutto, ricco di vitamina C. Dal

punto di vista commerciale esistono due tipi di piante di kiwi: quello dalla polpa verde (A.

deliciosa) e quello dalla polpa gialla (A. chinensis).

La produzione di kiwi è una grande fonte di reddito per l’agricoltura italiana poiché questa pianta

è coltivata in molte regioni, come Lazio, Piemonte, Veneto e Emilia Romagna, per un totale di

tonnellate prodotte nel 2012. L’Italia è infatti uno dei maggiori Paesi produttori di kiwi,

352.175

insieme a Nuova Zelanda, Cile, Corea e Stati Uniti (soprattutto California) e controlla il 24% del

dell’Emisfero

mercato Nord. all’inizio nell’Italia

Purtroppo, nel 2008 si è diffusa una malattia che colpisce questa pianta,

centrale e negli anni successivi in tutto il mondo. Questa è causata da Pseudomonas syringae pv.

actinidiae (Psa), un patogeno che è stato molto studiato ed è considerato riemergente, dal

momento che già in passato era stato isolato in Giappone nel 1989, in Italia e in Corea nel 1994.

I sintomi sono gli stessi in entrambe le epidemie: macchie di colore marrone circondate da un

alone giallo, cancrena dei rami e delle radici, caduta dei frutti e formazione di un essudato di

colore rossiccio o bianco. In Italia, la principale differenza tra le due epidemie sta nella virulenza

dei ceppi. Nel 1994, Psa ha causato solo pochi danni e macchie necrotiche sulle foglie, mentre la

malattia attuale causa la morte di intere coltivazioni, con un danno economico molto maggiore.

Molti alberi sono stati sradicati a causa della mancanza di cure efficaci e questo ha causato una

diminuzione della produzione di circa il 25%. È stato osservato che i composti chimici a base di

rame normalmente utilizzati non sono efficaci nel contrastare Psa ed è stato provato che questi

microbi sono capaci di trasferire geni di resistenza al rame attraverso il trasferimento genico

orizzontale (TGO), diminuendo così la loro sensibilità ai composti generalmente utilizzati nei

campi.

Poiché l’utilizzo degli antibiotici in agricoltura è proibito in Italia e in Europa, sono in corso di

di oli essenziali

studio nuovi approcci alternativi per risolvere questo problema. L’utilizzo

composti da terpenoidi, come il geraniolo e il citronellolo, ne è un esempio. In questo studio la

terapia fagica è proposta come sistema di controllo alternativo delle infezioni batteriche. Essa

v

sfrutta le caratteristiche dei batteriofagi, che infettano solo le cellule procariote senza provocare

Per un’efficiente terapia fagica bisogna

danni alle cellule eucariote. scegliere i fagi che saranno

più probabilmente efficaci. Pertanto la scelta ricadrà sui fagi di natura litica con attività ad ampio

spettro, evitando invece i fagi temperati, capaci di effettuare trasduzione. Un altro problema da

evitare è la selezione di ceppi batterici resistenti, che avverrà più probabilmente se ad essere

usato nella terapia è un solo batteriofago. Usando invece un cocktail in cui sono presenti diversi

fagi, si ritarda o addirittura si riduce la comparsa di cellule batteriche resistenti. Un cocktail di

fagi è una sospensione in cui sono presenti fagi differenti che siano specifici per lo stesso

patogeno e vengono generalmente selezionati in base alla capacità di uccidere gli eventuali

resistenti agli altri fagi. e poi d’Herelle

Prima Twort nel 1915 nel 1917 scoprirono in modo indipendente l'esistenza dei

fagi. Il primo ne descrisse in un articolo le caratteristiche biologiche, il secondo fu anche il primo

scienziato a utilizzarli come agenti battericidi. Nel 1919, infatti, d'Herelle trattò dei malati di

nell’istituto Pasteur

colera con preparazioni fagiche di Parigi e dopo pochi anni istituì un

Laboratorio dei Batteriofagi.

I batteriofagi furono l’unico mezzo per contrastare le infezioni batteriche fino alla scoperta degli

antibiotici dopo la Seconda Guerra Mondiale. Gli scienziati occidentali abbandonarono

mentre gli scienziati dell’Europa

completamente la terapia fagica a favore degli antibiotici

dell’Est continuarono a utilizzarla per trattare le infezioni.

Al giorno d’oggi la resistenza agli antibiotici è un grande problema. È ormai noto che i microbi

stanno diventando meno sensibili alla loro azione, dunque in questi anni la terapia fagica è stata

rivalutata come mezzo per combattere i batteri resistenti. Ci sono molti studi che trattano

l’attività litica dei fagi e ad oggi esistono molte aziende che hanno messo in commercio

preparazioni fagiche da usare contro i comuni patogeni. Questi prodotti trovano impiego

nell’industria alimentare e nell’agricoltura.

soprattutto Agriphage, ad esempio, è un prodotto

della Omnilytics che è usato per trattare le batteriosi dei pomodori e peperoni. ΦPSA1

In questo lavoro sono riportate le proprietà biologiche di due diversi fagi di Psa, e

ΦPSA2. Obiettivo di questo studio è quello di isolare, analizzare e descrivere le caratteristiche

biologiche e molecolari dei due batteriofagi in modo da fornire una base per studi successivi per

il possibile impiego di questi agenti biologici per il controllo e la prevenzione della batteriosi del

kiwi. vi

I due batteriofagi sono stati isolati dalle foglie di una pianta di kiwi malata e dalle acque reflue

della rete fognaria di Roma Sud. L’isolamento è stato eseguito tre volte per assicurare la purezza

del fago. I fagi vengono moltiplicati effettuando propagazione su piastra o in liquido e il titolo

del lisato fagico viene valutato mediante la tecnica del doppio strato d’agar.

ΦPSA1 ΦPSA2

si è dimostrato essere un fago dalla natura temperata mentre è un batteriofago

litico. La loro morfologia è stata osservata tramite il microscopio a trasmissione elettronica

(TEM), dopo colorazione negativa della preparazione fagica. È stata inoltre testata la capacità dei

ΦPSA1

fagi di lisare diversi ceppi di Psa e si sono ottenuti risultati diversi: lisa solo i ceppi di

nell’epidemia diffusa ΦPSA2 è in grado di lisare un’ampia gamma di

Psa isolati dal 2008 mentre

ceppi di Psa e altri pseudomonadi come P. s. theae and P. avellanae. Per determinare il periodo

one

di latenza e il volume di scoppio dei fagi è stato effettuato l’esperimento step growth.

ΦPSA1 ha un periodo di latenza di 100 minuti e un volume di scoppio di circa 178 virioni;

ΦPSA2 ha un periodo di latenza di 15 minuti e il volume di scoppio è circa 92 virioni. Il tempo

necessario per lisare una coltura in crescita esponenziale, invece, è evidente dal TOD (Time of

l’abilità di un fago

Death). Questo è un nuovo parametro da noi introdotto per descrivere in vitro

di uccidere una coltura di batteri ospiti, ed è il tempo impiegato da una coltura batterica in fase di

crescita esponenziale, infettata da un fago, per dimezzare la sua A da 0,2 a 0,1. Il TOD è stato

600

ΦPSA2

stabilito solo per per via della sua natura litica ed è di circa 135 minuti, mentre per

ΦPSA1 non è stato possibile determinarlo a causa della sua natura temperata. È stata testata

anche la sensibilità al pH e alla temperatura. I due batteriofagi hanno un comportamento simile:

entrambi mantengono l’attività l’attività litica è

litica in un range di pH tra 4 e 10, a pH 11

minore, mentre non sono vitali a pH 2, 3 e 12. Pure nella resistenza alla temperatura i due fagi

dopo incubazione a 50°C entrambi mantengono un’attività

mostrano un comportamento simile:

pari all’80% mentre a 60°C la vitalità scende a 0 dopo 40 minuti. Le analisi genomiche, infine,

sono state condotte mediante digestioni enzimatiche usando gli enzimi di restrizione BamHI,

BclI, EcoRI, HindIII, KpnI, NdeI, PstI, RsaI, SalI, SmaI, XbaI e XhoI.

possiamo affermare che ΦPSA1

In conclusione è un fago temperato isolato dalle foglie di una

dall’osservazione al

pianta di kiwi infettata da Psa. Appartiene alla famiglia Siphoviridae poiché

TEM si è visto che possiede una coda flessibile e non contrattile, lunga 200 nm, e una testa

ΦPSA1 ha uno spettro d’azione abbastanza ristretto. Il genoma

poliedrica dal diametro di 60 nm. ΦPSA1

è costituito da dsDNA e solo HindIII, KpnI e BclI sono in grado di digerirlo. potrebbe

essere utilizzato come mezzo per il riconoscimento fenotipico dei batteri ma non per la terapia

fagica a causa della sua natura temperata. vii

ΦPSA2 è un fago litico isolato dalle acque reflue della rete fognaria di Roma Sud. Osservando la

sua morfologia possiamo affermare che appartiene alla famiglia dei Podovirus, infatti è

caratterizzato da una testa icosaedrica dal diametro di 60 nm e da una coda tozza e non

ΦPSA2 è in grado di lisare un’ampia gamma di ceppi di

contrattile. Psa e anche ceppi di

Pseudomonas affini. Il genoma è costituito da dsDNA ed è stato digerito solo da EcoRI e NdeI.

la natura litica e l’ampia gamma di batteri

Grazie alle sue caratteristiche mostrate in vitro,

sensibili, questo è il miglior candidato per test in planta. viii

INDICE

1. Introduzione

1.1 Actinidia

1.1.1 Generalità e caratteri della pianta

1.1.2 Cultivar

1.1.3 Diffusione e valore economico

1.1.4 Situazione economica in Italia

1.1.5 Batteriosi del kiwi

Stima produzione nell’Emisfero Nord (2012/2013)

1.1.6

1.1.7 Produzione italiana, perdite causate dalla batteriosi

1.2 Il genere Pseudomonas

1.2.1 Pseudomonas ospiti di Actinidia

1.3 Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa)

1.3.1 Storia

1.3.2 Caratteristiche fenotipiche e genomiche

1.3.3 Struttura della popolazione

della virulenza e sopravvivenza nell’ospite

1.3.4 Evoluzione

1.3.5 Resistenza agli antibiotici e al rame

1.3.6 Nucleazione del ghiaccio

1.4 Strategie di controllo Psa

mediante l’utilizzo di antibatterici

1.4.1 Controllo

1.4.2 Fitotossicità di rame e streptomicina

1.5 Batteriofagi

1.5.1 Morfologia e classificazione batteriofagi

1.5.2 Ciclo vitale dei batteriofagi

1.5.3 La natura dei batteriofagi

L’impatto dei batteriofagi sulla biosfera

1.5.4

1.5.5 Utilizzi dei batteriofagi

1.6 Terapia fagica

Lo stato dell’arte della terapia fagica

1.6.1

1.6.2 Batteriofagi e antibiotici: pro e contro

1.6.3 Terapia fagica per il controllo di fitopatologie

1.6.4 Possibili problematiche nel trattamento delle fitopatologie

1.6.5 Cocktail di fagi

1.6.6 Le fonti e la scelta dei fagi

1.6.7 Il difficile cammino della terapia fagica

1.6.8 Prospettive future

2. Scopo della tesi ix

3. Materiali e metodi

3.1 Terreni

3.2 Isolamento e purificazione batteriofagi

3.3 Moltiplicazione dei batteriofagi e preparazione di un lisato fagico

3.4 Concentrazione dei batteriofagi

3.5 Titolazione dei batteriofagi del batteriofago ΦPSA1

3.6 Determinazione della frequenza di lisogenia

3.7 Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

3.8 Adsorbimento fagico

3.9 Esperimento one step growth

3.10 Resistenza alla temperatura

Effetto del pH sull’infettività del fago

3.11

3.12 Time of Death (TOD)

3.13 Caratterizzazione molecolare del batteriofago

3.14 Determinazione della gamma di organismi ospiti

4. Risultati

4.1 Isolamento fagi e propagazione

4.2 Ciclo vitale batteriofagi

4.3 Morfologia dei virus

4.4 Adsorbimento

4.5 One step growth

4.6 Time Of Death (TOD)

4.7 Resistenza alla temperatura

4.8 Resistenza al pH

4.9 Determinazione della gamma di organismi ospiti

4.10 Caratterizzazione molecolare

5. Discussione

6. Bibliografia x

1. INTRODUZIONE

Dal 2008 si è diffusa in tutto il mondo una grave malattia che colpisce le coltivazioni di kiwi

(Actinidia deliciosa e Actinidia chinensis) ed è causata dal batterio Pseudomonas syringae pv.

actinidiae (Psa). all’actinidiocoltura di tutto

Questa malattia ha causato e causa tuttora enormi perdite economiche

il mondo e attualmente non ci sono rimedi se non quello di sradicare le piante infette e piantarne

delle nuove.

Poiché i composti chimici normalmente utilizzati non sono in grado di arrestare la diffusione

della malattia, né è possibile utilizzare antibiotici in agricoltura, un metodo alternativo può essere

di virus

costituito dalla terapia fagica, ossia dall’utilizzo in grado di lisare selettivamente i batteri

patogeni, non influenzando né le cellule eucariote né le popolazioni batteriche ambientali.

1.1 Actinidia

1.1.1 Generalità e caratteri della pianta

L’Actinidia, comunemente nota come kiwi, è una pianta arborea della famiglia delle

originaria della Cina. Nell’ultimo secolo si è diffusa in Nuova Zelanda, poi negli

Actinidiaceae

USA e più recentemente in Europa. In Italia, in particolare nel Lazio, Piemonte, Emilia-

ha trovato un clima particolarmente adatto per la sua crescita. L’Italia è,

Romagna e Veneto,

infatti, il primo produttore di kiwi a livello mondiale, con una quota di mercato pari al 24% (dati

CSO 2013).

L’Actinidia è una pianta rampicante molto vigorosa di notevoli dimensioni, che vegeta

disordinatamente, richiedendo appositi sostegni. Le foglie caduche sono ampie, cuoriformi,

tomentose sulla pagina inferiore mentre le radici sono carnose e ramificate. Essendo una pianta

dioica, i fiori femminili sono portati da piante pistillifere e quelli maschili da piante staminifere;

intervallate per garantire l’impollinazione entomofila e la produzione dei

generalmente vengono

frutti. Molto raramente si sono rilevate piante ermafrodite. I fiori sono riuniti in infiorescenze e

sono di color bianco-panna, a cinque sei petali.

Il frutto è una bacca allungata con buccia robusta e coperta di peli, di colore marroncino, del

peso medio di 60-70 gr circa. La polpa è acquosa, gradevole, dal gusto acidulo e ricco di

1

vitamina C (200 mg circa su 100 gr di polpa). I frutti hanno dimensione molto variabile, ma

comunque da una larghezza di 2-3 a 5 cm, e lunghezza da 4 a 8 cm.

1.1.2 Cultivar

Dal punto di vista commerciale esistono due tipi di frutti: quello dalla polpa verde (A. deliciosa)

e quello dalla polpa gialla (A. chinensis) (Tab. 1).

A. deliciosa, dalla polpa verde (Fig. 1), trova nella cultivar Hayward la varietà economicamente

bell’aspetto

più importante e la più diffusa. È stata scelta per i suoi frutti grossi, per il e il buon

sapore, ritenuto superiore a quello delle altre varietà presenti prima di allora. Per questi motivi,

dal 1960 tutti i nuovi impianti di Actinidia nel mondo sono della cultivar Hayward.

A. chinensis è stata immessa sul mercato più recentemente ed è stata utilizzata sin dalla fine degli

anni ’70 per selezionare nuove varietà perché dotata di frutti dalle grandi dimensioni, dal buon

sapore e dalla tipica polpa gialla (fig. 1). Le cultivar più importanti sono la Jin Tao e la Hort16A,

TM

conosciute sul mercato rispettivamente con i nomi Kiwi Gold e Zespri Gold. Nel 2008 è stata

resa disponibile un’ulteriore varietà prodotta nell’Università degli Studi di Udine, sempre dalla

polpa gialla, con il nome di Soreli. Actinidia chinensis Actinidia deliciosa

Regno Plantae Plantae

Divisione Magnoliophyta Magnoliophyta

Classe Magnolopsida Magnolopsida

Ordine Ericales Ericales

Famiglia Actinidiaceae Actinidiaceae

Genere Actinidia Actinidia

Specie A. chinensis A. deliciosa

Tabella 1. Classificazione di A. chinensis e A. deliciosa

In Italia le cultivar più diffuse sono la Hayward, la Jin tao, la Hort 16A e la Soreli ma è la

cultivar Hayward quella maggiormente presente sul territorio italiano. Questa è caratterizzata da

fioritura tardiva per cui sfugge alle gelate primaverili, produce frutti anche molto grandi (fino a

100 gr) di forma ovale. Tale varietà presenta peraltro una caratteristica di enorme importanza

merceologica rispetto alle altre: ha la capacità di essere conservata in frigorifero per mesi senza

subire danni. L'acidità, dovuta alla presenza di acido ascorbico (vitamina C), è un fattore tipico

2

del frutto del kiwi, e determina con altri acidi organici l'attività antiossidante ed auto conservante

del frutto stesso. Una pianta adulta può produrre anche 40-50 kg di frutti.

Tuttavia sono le varietà di A. chinensis quelle di maggiore qualità. Nonostante la grandezza dei

la forma è allungata con l’epidermide coperta da

frutti sia simile a quelli della cultivar Hayward,

una peluria molto più corta, che si leva molto facilmente ed è quasi assente dopo la raccolta. La

maturazione avviene circa 20-25 giorni prima, il contenuto di vit. C è maggiore e il gusto viene

seppur di maggiore qualità, l’estensione

ritenuto migliore. Essendo una varietà comparsa dopo,

dei terreni coltivati con A. chinensis è ancora molto minore rispetto quella dei terreni coltivati

con A. deliciosa. TM

Fig. 1 A sinistra il frutto della cultivar Hayward e a destra il frutto della varietà Hort16A, Zespri Gold .

L’Actinidia resiste anche a temperature invernali molto basse (-15°C) ma si adatta meglio ai

climi miti. È molto sensibile alle gelate primaverili durante il germogliamento e la fioritura

l’eccesiva temperatura estiva provoca il disseccamento dei lembi fogliari

mentre e per questo

serve una ricca irrigazione. Anche i venti sono molto dannosi. I terreni più adatti sono quelli ben

drenati, caratterizzati da un pH neutro o poco acido. 3

1.1.3 Diffusione e valore economico

La coltivazione di Actinidia rappresenta una cospicua fonte di reddito per numerosi paesi ma è

molto concentrata poiché l’87% della produzione mondiale è detenuto da 5 paesi produttori.

Al primo posto (medie 2008-2011) troviamo la Cina, con oltre 490.000 tonnellate, pari al 27%

del totale mondiale e in seguito l’Italia con 430.000 tonnellate, pari al 24% del totale. Nonostante

l’Italia

questo è a essere considerata il primo produttore mondiale di kiwi giacché in Cina sono

coltivate una miriade di varietà che non rientrano nello standard commerciale internazionale.

In seguito ci sono Nuova Zelanda, 385.000 tonnellate e oltre il 20% del totale, Cile, con 187.000

tonnellate, il 10% del totale e Grecia con 80.000 tonnellate medie. A distanza seguono Francia,

Iran, Giappone, USA (soprattutto la California), Portogallo, Spagna e Corea. Il 96% circa della

superficie mondiale interessa la cultivar Hayward e il restante 4% le altre cultivar: Hort 16A, Jin

Tao e altre (CSO, 2013)

1.1.4 Situazione economica in Italia

l’actinidicoltura occupa un ruolo fondamentale nell’economia nazionale.

In Italia Il Lazio è la

regione che fa da traino con ben 8600 ha e una produzione di 172000 (nella sola provincia di

Latina: 7000 ha e 135.000 t). Un’altra fetta importante di questa produzione la detengono il

e 126.200 t di produzione annua, l’Emilia-Romagna

Piemonte con 4840 e il Veneto con più di

3000 di terre coltivate e rispettivamente una produzione di 84600 e 67200 t. Da sole queste

quattro regioni producono il 72,97% del totale nazionale.

Tuttavia, dal 2008 le coltivazioni di Actinidia sono state messe in serio pericolo da una batteriosi

a causa della quale l’actinidicoltura

provocata da Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa),

italiana ha perso 600 della varietà Hort16A rispetto agli 800 coltivati nel 2009 (Armentano e

Andreotti, 2010). 4

1.1.5 Batteriosi del kiwi

I sintomi della malattia sono stati descritti per la prima volta nel 1989. Le piante di kiwi infette

sono caratterizzate da un imbrunimento dei germogli, macchie di colore marrone scuro

circondate da un alone giallo sulle foglie (Fig. 2), cancrena dei ramoscelli e dei tronchi con un

essudato di colore rossastro (Fig. 3) e caduta dei frutti (Serizawa et al., 1989).

Fig. 2 Tipici sintomi di cancro batterico sul fiore (a destra) e sulla foglia (a sinistra) con macchie marrone

circondate da aloni gialli su A. chinensis.

Actinidia può essere infettata da Psa mediante un qualsiasi tipo di ferita di origine biotica o

abiotica, come pioggia, grandine, potatura ecc. e la diffusione sarà poi sistemica a prescindere

dal tipo di tessuto o organo che per primo viene a contatto col patogeno, che sia questo un seme,

un germoglio o un innesto.

Uno degli aspetti più rilevanti della malattia è probabilmente la facilità con cui il batterio riesce a

diffondere dentro e attraverso le diverse coltivazioni. Piante apparentemente sane possono

mostrare i primi segni d’infezione in primavera (macchie sulle foglie) e morire entro la fine

dell’anno. Allo stesso modo, un frutteto senza segni d’infezione e distante centinaia di metri da

uno malato può mostrare segni di infezione nella maggior parte delle piante nel giro di un anno.

Gli essudati che si formano durante le fasi finali della malattia, in genere in autunno/inverno,

sono cariche di batteri e sono dispersi dal vento. Questo è il modo principale con cui Psa riesce a

diffondersi tra i frutteti. Anche la pioggia è un fattore importante: durante la primavera, che è

caratterizzata appunto da piogge frequenti, l’umidità elevata e temperature comprese tra i 12 e i

18°C sono le condizioni con le maggiori possibilità di diffusione del patogeno (Serizawa et al.,

1989). 5

Fig. 3 Produzione di essudato del cancro batterico dai tronchi di A. chinensis cv. Hort 16A (a sinistra) e di

A. deliciosa cv. Hayward (a destra).

Le alte temperature dell’estate, dai 25°C in su, impediscono una massiccia diffusione del

batterio, che può comunque infettare gli alberi da frutto attraverso gli stomi e gli idatodi.

Oltre alle vie ormai note di diffusione e colonizzazione delle coltivazioni da parte di Psa,

esistono in letteratura delle prove della possibilità di diffusione di ceppi di P. syringae nei più

disparati ambienti grazie all’azione degli afidi (Stavrinides et al., 2009) e al polline contaminato

da Psa (Vanneste et al., 2011), anche se ancora non è stato del tutto chiarito come questo possa

contribuire alla diffusione del batterio.

È interessante notare come Psa abbia la capacità di sopravvivere sugli organi ormai staccati dalla

pianta, come foglie e ramoscelli, fino a 45 giorni dopo la loro caduta (Marcelletti et al., 2011).

In Italia, le coltivazioni di kiwi dalla polpa gialla (Hort 16A, Jin Tao, Soreli) sembrano essere

molto sensibili al contagio, anche se al momento ci sono epidemie di batteriosi che colpiscono

sia A. chinensis sia A. deliciosa, indipendentemente dalle aree geografiche di origine da cui è

isolato Psa. I ceppi che stanno causando le attuali infezioni sono diversi da quelle che avevano

provocato le batteriosi nel passato (Ferrante et al., 2010; Marcelletti et al., 2011).

La batteriosi del kiwi è al momento impossibile da eliminare e il suo controllo è basato su

di prevenzione e sull’utilizzo dei pochi prodotti che hanno dato qualche risultato

strategie

positivo in questi anni. A nulla servono le opere di capitozzatura delle coltivazioni. Questa

per curare le diverse malattie delle piante e consiste nell’asportare le

pratica è usata normalmente

parti malate per permettere la crescita di parti nuove e sane. Le piante colpite da batteriosi che

6

manifestano i sintomi d’infezione batterica, in seguito a capitozzatura ripresentano l’infezione

(Fig. 4). Questo accade perché quando Psa entra nella pianta, riesce a diffondersi in modo

sistemico, quindi tagliare solo una parte dell’albero non è sufficiente a bloccare l’infezione ma

serve l’estirpazione dell’intera pianta con disinfezione del terreno, che deve essere lasciato

incolto per qualche tempo (Renzi et al., 2012). La cura chimica delle piante infette e la

prevenzione di quelle sane, con vari prodotti a base di sali di rame ammessi per l’actinidiocoltura

in molti casi non ha dato risultati incoraggianti. È stato tuttavia costatato che il batterio che non è

penetrato all’interno della pianta, e quindi si trova sulle foglie e sui rami, viene ucciso dai

trattamenti chimici.

Fig. 4 Pianta di A. chinensis affetta da batteriosi del kiwi con sintomi evidenti e capitozzata (a sinistra) e

macchie scure sui rami dovuti all’infezione dei vasi da parte di Psa (a destra). 7

nell’Emisfero Nord (stime 2012/2013)

1.1.6 Stima produzione

Dati sulla produzione di kiwi nell’Emisfero Nord (in tonnellate).

Figura 5.

I dati della produzione nell'Emisfero Nord, indicano un incremento rispetto al 2011 solo per

Grecia (+5%, 100.000 tonnellate) e California (+15%, 30.950 tonnellate).

La produzione complessiva in Europa nella stagione 2012/13, a causa della batteriosi, risulta

inferiore del 18% rispetto a quella precedente e in flessione del 12% rispetto alla media 2007-

2011 (Fig. 5). 8

1.1.7 Produzione italiana, perdite a causa della batteriosi

180.000

160.000

140.000

120.000 LAZIO

100.000 PIEMONTE

80.000 EMILIA-ROMAGNA

60.000 VENETO

ALTRE REGIONI

40.000

20.000

0 2011 2012

Produzione totale Produzione totale

Figura 6. Dati sulla produzione annuale di kiwi in Italia (in tonnellate). Vengono riportati i dati

specifici delle quattro regioni maggiori produttrici.

Nel 2011, il raccolto italiano si collocava su un livello di 471.870 tonnellate, mentre nel 2012 è

stato stimato in 352.175 tonnellate (-25%). Sono molto diversi i dati delle diverse regioni (Fig.

6). - In Piemonte, i dati del 2012 mostrano una produzione di 31.700 ton contro le 129.200 del

2011 (-75%). La fortissima diminuzione è imputabile agli enormi e diffusi danni da gelo

e a Psa. Anche le superfici sono in calo rispetto all’anno precedente a causa degli espianti

dovuti alla diffusione della batteriosi.

- In Veneto le rese medie sono incrementate di circa 20 punti percentuali rispetto al 2011.

Questo è dovuto alla recente introduzione della coltivazione di kiwi in questa regione,

non ancora colpita dalla malattia

c’è stata una flessione del 21% rispetto alla precedente annata:

- In Emilia-Romagna

74.800 tonnellate contro le 94.100 del 2011.

- Nel Lazio la produzione è stata di 128.900 tonnellate contro le 159.500 del 2011

(flessione del 19%). In quest’area è segnalato un forte tasso di aziende con alberi colpiti

9

da batteriosi, variabile a seconda dei comuni. I più colpiti sono stati Aprilia, Cisterna,

Velletri e Latina, anche se altre aree minori non sono risultate esenti. Diversamente dalle

aree del Nord, nelle aziende che presentano batteriosi la diffusione della malattia può

anche arrivare a interessare il 100% delle piante dell’azienda. Inoltre, a differenza del

2011, quando gli effetti della batteriosi erano perlopiù sulle foglie, dal 2012 si

manifestavano anche su fiori e frutti.

La flessione delle superfici in piena produzione (-4%) deriva dalle capitozzature

effettuate in seguito alla diffusione della batteriosi che ha colpito in particolare le cultivar

a polpa gialla.

1.2 Il genere Pseudomonas

Il genere Pseudomonas appartiene alla famiglia delle Pseudomonaceae e comprende bacilli

Gram-negativi, mobili per la presenza di uno o più flagelli polari, aerobi, asporigeni, catalasi e

ossidasi-positivi. Sono batteri chemioeterotrofi che attuano un metabolismo respiratorio con O e

2,

a volte il nitrato, come accettore di elettroni.

sono in grado di degradare un’ampia gamma di composti

I batteri del genere Pseudomonas

difficilmente metabolizzabili da altri microrganismi e si sono quindi adattati ai più disparati

ambienti, dall’epidermide dell’uomo agli strumenti medici. Inoltre, sono in grado di formare dei

biofilm che aderiscono rapidamente a diversi substrati e questa è un’altra caratteristica che li

d’infezioni.

rende molto difficili da debellare in caso La loro temperatura ottimale di crescita è

tra i 20° e i 30°C, ma sono in grado di vivere e replicarsi, anche se più lentamente, tra 0 e 4°C.

Sono state distinte più di 140 specie, di cui più di 25 possono causare infezioni opportunistiche

nell’uomo. L’importanza di queste specie è dovuta all’ampia distribuzione di questi ceppi in

numero di fattori di patogenicità che

natura, alla loro resistenza a molti antibiotici e all’alto

possono produrre. I membri più numerosi e più studiati appartenenti a questo gruppo sono P.

aeruginosa, P. fluorescens, P. putida e P. syringae.

Le specie che fanno parte del genere Pseudomonas hanno diversi ruoli di notevole importanza

sono in grado di degradare un’ampia varietà di sostanze

pratica. Molti sono saprofiti, cioè

organiche e sono dunque importanti nel processo di mineralizzazione che si verifica sia in natura

che nel trattamento dei liquami. Altre specie sono, invece, importanti patogeni delle piante, degli

dell’uomo:

animali e P. aeruginosa è un patogeno opportunista e infetta i pazienti ospedalizzati e

in generale gli individui immunodepressi ed è spesso causa di infezioni nelle aree ustionate e nel

10

provoca l’avvizzimento di molte

tratto urinario; P. solanaceum piante per la produzione di

pectinasi e cellulasi; P. fluorescens è responsabile, insieme con altri, del deterioramento di generi

alimentari come latte, uova e frutti di mare conservati in frigorifero, poiché cresce a 4°C e

degrada lipidi e proteine. (Palleroni, 2010; Prescott, 2009)

1.2.1 Pseudomonas ospiti di Actinidia

Sono essenzialmente tre le specie di Pseudomonas che infettano le piante di Actinidia:

Pseudomonas viridiflava, Pseudomonas syringae pv. syringae e Pseudomonas syringae pv.

actinidiae. è stato segnalato in Italia per la prima volta negli anni ’90 (Varvaro

P. viridiflava et al., 1990) e

si manifesta con imbrunimento dei petali che marciscono e alterazioni dei fiori, sepali, stami e

pistilli. I fiori colpiti degenerano e cadono. Questo ceppo ha sempre causato infezioni di lieve

entità e non è questa la specie più temuta dagli agricoltori.

P. syringae pv. syringae è responsabile del cancro e degli avvizzimenti dei rami, fessurazioni dei

fine degli anni ’80 (Scortichini,

tronchi e maculature fogliari. In Italia è stato segnalato alla

1989) con la prima descrizione dei sintomi della malattia. Alcuni giorni prima del risveglio

vegetativo, sui rami colpiti dal patogeno da un anno, si notano lesioni della corteccia e, a volte,

imbrunimento e necrosi. In primavera poi, le gemme colpite dal batterio non si aprono e talvolta

si osserva, dai tessuti infettati, l’emissione di essudato rossiccio. I rami attaccati in seguito

avvizziscono e sulle foglie si osservano tacche necrotiche di dimensioni diverse.

Il periodo in cui si manifestano i sintomi di cancro sui rami, sul tronco e sulle branche è quello

autunno-invernale. La patogenesi diminuisce sensibilmente nella stagione estiva, nella quale i

sintomi sono scarsi. Con l’evolversi del cancro si accentuano le fessurazioni e in alcuni casi si

può avere la morte della pianta. è l’agente eziologico della batteriosi del kiwi ed è

Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa)

stato per la prima volta descritto in Giappone alla fine degli anni ’80 (Takikawa et al., 1989) e in

In Italia la prima segnalazione c’è stata nel 1994 (Scortichini, 1994) e

Corea (Koh et al., 1994).

attualmente ci sono evidenze della presenza di Psa anche in Cina (Liang et al., 2000), Francia

(EPPO 2010), Portogallo (Balestra et al., 2010), Nuova Zelanda (Chapman et al., 2011), Cile

(EPPO 2011) e Turchia (Bastas e Karakaya, 2012).

Questo patogeno manifesta la sua presenza negli alberi con sintomi simili a quelli di P. syringae

i quali appaiono all’inizio della ripresa vegetativa.

pv. syringae, 11

Psa, a partire dal 2008, oltre a essersi diffuso in tutto il mondo, sta causando la morte di migliaia

di piante con ingenti perdite economiche ed è al momento il patogeno più virulento che possa

attaccare una pianta di kiwi.

1.3 Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa)

I ceppi di Pseudomonas syringae sono divisi dal punto di vista tassonomico in varietà patogene

note come “pathovar”, per lo più in base all’ospite dal quale sono stati isolati. Sulla base dei

ospiti e di test biochimici, fisiologici e d’identificazione molecolare,

sintomi e del range di P.

syringae è stato diviso in 57 pathovar (Bull et al., 2010). Dal punto di vista genetico invece, i

ceppi di P. syringae sono suddivisi in 9 genomospecie (Gardan et al., 1999).

In particolare, Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) è un patogeno riemergente, infatti

risponde ai parametri per essere definito tale: i) ha aumentato la sua incidenza, si è diffuso sia

geograficamente che per spettro d’azione, ii) mostra una patogenesi nuova e diversa da quella

precedentemente osservata, iii) si è evoluto recentemente e iv) è stato ufficialmente riconosciuto

di recente (Anderson et al., 2004).

Psa attacca sia la varietà di kiwi dalla polpa gialla (Actinidia chinensis) e quella dalla polpa

verde (Actinidia deliciosa) e questo causa gravi perdite economiche in Italia (Scortichini, 2008).

1.3.1 Storia

Psa è stato isolato, identificato e descritto per la prima volta in Giappone nel 1984 (Takikawa et

al., 1989). In seguito è stato trovato anche in Italia (Scortichini, 1994) e in Corea del Sud (Koh et

al., 1994). In tutti questi casi, il patogeno è stato isolato da A. deliciosa cv. Hayward. È

particolare che in Giappone e Corea del Sud questa patologia sia stata molto dannosa mentre in

Italia, nonostante la prima segnalazione di P. syringae pv. actinidiae risalga al 1994, fino al 2008

non aveva creato che modesti danni, come formazione di macchie sulle foglie e avvizzimento dei

ramoscelli, sempre su A. deliciosa (Ferrante e Scortichini, 2010).

la primavera e l’autunno 2008 e nell’inverno tra il 2008/2009 c’è stata una grave

Durante

epidemia di batteriosi nelle coltivazioni di A. chinensis cvs Hort 16A e Jin Tao e Soreli nella

provincia di Latina (Lazio) e da qui si è diffusa in tutto il territorio nazionale. Questa epidemia

ha messo in serio rischio le pregiate coltivazioni di kiwi dalla polpa gialla (A. chinensis)

nell’Italia centrale, dove quasi tutti gli 800 ettari dedicati alla sua coltivazione sono stati

12

seguito, la maggior parte dei frutteti è stata estirpata a causa dell’alta

pesantemente infettati. In

suscettibilità del germoplasma di A. chinensis attualmente coltivato.

Durante il 2009 Psa è riuscito a infettare pure A. deliciosa cv. Hayward di tutte le maggiori

regioni italiane produttrici di kiwi. Nel 2010 è stata ufficialmente riportata la sua presenza in

Nuova Zelanda, dove nel 2011 ha causato gravi danni sia su A. deliciosa sia su A. chinensis

(Everett et al., 2011). Recentemente Psa è stato isolato anche in Portogallo (Balestra et al.,

2010), Francia (EPPO 2010), Spagna (Abelleira, 2011), Turchia (Bastas et al., 2012) e Cile

(EPPO 2011) e segnalato ancora una volta in Corea del Sud (Koh et al., 2010).

La quasi contemporanea presenza dello stesso patogeno in tutte le aree del mondo nel quale il

kiwi cresce ci consente di definire queste epidemie di batteriosi in A. deliciosa e A. chinensis

come una pandemia.

1.3.2 Caratteristiche fenotipiche e genomiche

Dal punto di vista morfologico le colonie di Pseudomonas hanno bordi rotondi, un colore bianco

crema. Dal punto di vista biochimico corrispondono al primo gruppo della classificazione

LOPAT: sono positivi al test del levano, all’ipersensibilità al tabacco e sono negativi al test

dell’ossidasi, al test della putrefazione della patata e a quello dell’arginina deidrolasi (Ferrante e

Scortichini, 2009).

Attraverso una comparazione tra i genomi dei ceppi di Psa che sono stati isolati nel 1994 in

e quelli che stanno causando l’attuale ondata di batteriosi

Giappone (Psa J) e in Italia (Psa I)

(Psa I2) si è capito che sono due popolazioni completamente diverse. Inoltre possiamo affermare

con certezza che i ceppi di Psa attuali non si sono originati da quelli trovati in Italia circa 20 anni

fa.

Da un’analisi genetica dei geni housekeeping gyrB, rpoB e rpoD, non si rilevano grosse

differenze tra questi nuovi ceppi, anche se possono essere chiaramente distinti rispetto i ceppi di

Psa isolati da A. deliciosa in Giappone (Takikawa et al., 1989) e in Italia (Scortichini, 1994),

così come da quelli di P. s. pv. syringae isolati dagli spot delle foglie che sono comparsi su A.

deliciosa (Ferrante e Scortichini, 2010).

Gardan (1999) aveva definito 9 genomospecie per Pseudomonas syringae e tutti i pathovar ma

non aveva incluso Psa. In base alle analisi genetiche si può affermare che Psa appartiene alla

genomospecie 8, come P. avellanae e P.s. pv. theae, confermando così quanto già affermato da

Scortichini (2002). 13

È interessante notare come alcuni ceppi di Psa ottenuti in diversi anni da diverse aree coltivate

con A. chinensis o isolati da diverse specie di Actinidia erano identici in tutta la lunghezza dei

scoppiata nel 2008-2009

quattro frammenti di geni analizzati. È quindi chiaro che: i) l’epidemia

nell’Italia centrale sulle coltivazioni di A. chinensis e A. deliciosa è stata causata da una diversa

popolazione di Psa rispetto quelle trovate in Italia (Scortichini, 1994) e Giappone (Takikawa et

al., 1989); ii) i ceppi di questa nuova popolazione possono cross-infettare sia A. chinensis cvs

Hort16A e Jin Tao sia A. deliciosa cv. Hayward.

La diversità della popolazione di Psa che sta in questo periodo causando seri danni ad A.

è stata confermata dall’identificazione di geni codificanti per la

chinensis e A. deliciosa

faseolotossina, coronatina, ossia di proteine utili al batterio per infettare la pianta (Marcelletti et

al., 2011).

Infatti, nessuno dei ceppi isolati in Italia tra il 2008 e il 2009 possedeva frammenti del cluster di

geni argK-tox codificante per la faseolotossina. Al contrario, questi frammenti genici erano stati

in precedenza rilevati nei ceppi isolati negli anni ’90. Inoltre i ceppi isolati recentemente non

mostravano la presenza di geni per la coronatina, al contrario dei ceppi isolati in Corea del Sud

(Psa K) da A. deliciosa (Han, 2003). Quindi questo indicherebbe che le epidemie recentemente

rilevate sono state causate da popolazioni batteriche differenti anche da quelle isolate in Corea

del Sud (Koh et al., 1994). Infine è stata evidenziata la presenza di un gene effettore, chiamato

hopA1, che è presente in tutti i ceppi di Psa di recente isolamento e che è invece assente nelle

popolazioni precedentemente analizzate.

Non è possibile stabilire con certezza da quale sorgente di inoculo le epidemie più recenti siano

state causate.

1.3.3 Struttura della popolazione

Attraverso un’approfondita analisi genomica è ormai evidente che esistono diverse popolazioni

di Psa in grado di infettare diverse specie di Actinidia con differente intensità. Infatti ci sono

almeno quattro popolazioni geneticamente distinte di Psa diffuse in tutto il mondo. Questo caso

rappresenta un evento di evoluzione convergente di popolazioni geneticamente diverse verso uno

stesso genere di pianta.

1) Psa isolato nel periodo tra il 1984 e il 1989 in Giappone (Psa J) e nel 1992 in Italia (Psa

I). In entrambe le nazioni è stato isolato da A. deliciosa cv. Hayward. Dal punto di vista

genetico i ceppi di queste due popolazioni sono pressoché identici. La sostanziale

14

differenza consiste nell’entità del danno causato: in Giappone le perdite economiche sono

state ingenti, in Italia molto modeste. Questo dato porta a pensare che i parametri

climatici e/o le tecniche di coltivazione possano giocare un ruolo fondamentale nel

determinare la virulenza di uno stesso patogeno. Tutti i ceppi di queste popolazioni

possiedono il cluster genico della faseolotossina, presente nel genoma e acquisito per

trasferimento genetico orizzontale (TGO) (Sawada et al., 1999).

2) Psa isolato nel 1994 in Corea del Sud (Psa K), ha un caratteristico plasmide che produce

coronatina e invece manca il cluster genico della faseolotossina (Han, 2003). Analisi

MLST hanno dimostrato che questa popolazione è diversa dalla prima (Chapman et al.,

2011). Psa ha causato danni economici sia ad A. deliciosa cv. Hayward, nel 1994 che in

questi anni, sia ad A. chinensis Hort 16A nella recente epidemia (Koh et al., 1994 e

2010). Dopo pochi anni di trattamenti con sostanze chimiche, questa popolazione ha

sviluppato resistenza sia a composti a base di rame che alla streptomicina (Goto et al.,

1994; Han, 2003).

3) Psa attuale (Psa I-2), che causa gravi perdite economiche in tutto il mondo ed è diverso

dai primi due (Chapman et al., 2011; Ferrante e Scortichini 2010 e 2011; Gallelli et al.

2011; Marcelletti et al., 2011). I ceppi appartenenti a questa popolazione non hanno geni

per coronatina e faseolotossina. Dopo la prima apparizione nel Lazio nel 2008, si è

diffuso nel giro di due/tre anni in tutta Italia, andando a sostituire quella presente

precedentemente (Marcelletti e Scortichini, 2011). È attualmente presente anche in

Nuova Zelanda, Francia, Spagna, Portogallo.

4) Una forma meno virulenta (Psa NZ LV), presente solo in Nuova Zelanda e che causa

solamente macchie sulle foglie. È diversa dalle tre precedenti ed è stata trovata solo

nell’isola meridionale della nazione.

e sopravvivenza nell’ospite

1.3.4 Evoluzione della virulenza

Psa è un chiaro esempio di come i batteri fitopatogeni siano in grado di evolversi rapidamente e

modulare la loro patogenicità e virulenza per adattarsi a nuove situazioni. Studi recenti hanno

dimostrato come Psa possa adattarsi rapidamente a un nuovo ospite e a nuovi ambienti attraverso

l’acquisizione o la perdita di tratti mobili del genoma e fattori di virulenza, risultando quindi un

fitopatogeno molto versatile. 15

Le quattro popolazioni precedentemente descritte sono tutte in grado di indurre chiari sintomi di

malattia nelle specie di Actinidia, anche se alcuni ceppi non dispongono di tutti i cluster di geni

che codificano per le tossine. In presenza di stress come carenza di nutrienti, presenza di agenti

antimicrobici e temperature estreme, è noto che il batterio ha la capacità di assumere DNA

esogeno per acquisire materiale genetico in grado di aiutarlo a superare questo stress (Arnold,

2007). Il genoma di Psa contiene dei set di geni che sono importanti per la sopravvivenza del

batterio o per la competizione con altri microrganismi in planta. Infatti, Psa può inibire il

metabolismo dell’ossido nitrico (NO) dell’ospite. L’NO possiede un ruolo fondamentale nella

resistenza all’attacco di patogeni giacché è un importante messaggero che induce la sintesi di

l’inibizione di questa via metabolica permette la

composti di difesa da parte della pianta. Dunque

crescita batterica nella pianta (Delledonne et al., 1998).

1.3.5 Resistenza agli antibiotici e al rame

Sono presenti numerosi geni ortologhi che sono coinvolti nella resistenza agli antibiotici. Tra le

cinque superfamiglie dei sistemi di efflusso, Psa ha geni che appartengono alla resistenza alla

divisione nodulare (RND), multi-resistenza antimicrobica (MAR), trasportatore endosomale

multi-drug (MET) e della superfamiglia di facilitatori maggiori (MFS). Tutti questi sistemi di

efflusso sono pompe che utilizzano il gradiente protonico o del sodio come fonte di energia

(Marcelletti et al., 2011).

Infine i genomi dei diversi ceppi includono geni coinvolti nell’inattivazione enzimatica delle

beta-lattamasi, del tellurio e dei macrolidi (Marcelletti et al., 2011), e possono facilmente

tollerare la streptomicina attraverso meccanismi di resistenza come già osservato da Han (2003)

e Nakajima (1995).

Ceppi diversi di Psa sono stati analizzati alla ricerca di geni che codificassero sistemi di

resistenza al rame e agli antibiotici. Tutti questi ceppi contengono geni omologhi per copA e

copB, che sono essenziali per la resistenza al rame. Gli ioni di rame sono importanti nelle vie

metaboliche dei batteri, tuttavia, se la concentrazione di ioni liberi non è controllata, possono

causare effetti tossici per la cellula batterica (Cooksey, 1993).

Durante la prima epidemia in Giappone (1984-1987), tutti i ceppi di Psa possedevano solo i geni

copA e copB, ma dopo ripetuti trattamenti a base di battericidi spray a base di rame, ben presto è

stata osservata la presenza di geni addizionali capaci di conferire una ancor maggiore resistenza

al rame, chiamati copR e copS (Nakajima et al., 2002). 16

È stato dimostrato che in vitro i ceppi di Psa isolati più recentemente non possiedono una

resistenza ai prodotti chimici a base di rame o antibiotici (Marcelletti e Scortichini, 2011). È

tuttavia noto che questo patogeno può facilmente acquisire resistenza sia ai composti a base di

rame che alla streptomicina (Goto et al., 1994; Han, 2003), come è appunto successo in questi

anni.

1.3.6 Nucleazione del ghiaccio

Pseudomonas syringae, insieme a specie correlate di Pseudomonas, oltre a Xantomonas ed

Erwinia, è capace di danneggiare le piante formando ghiaccio. Questi batteri causano danni

meccanici provocando la formazione di cristalli di ghiaccio che rompono le cellule della pianta,

uccidendole.

In presenza di condizioni favorevoli queste specie sono in grado di produrre una proteina (InaX)

che stimola la formazione di cristalli di ghiaccio, fungendo da punto focale che consente alle

molecole d’acqua di organizzarsi con una disposizione regolare.

In genere i cristalli di ghiaccio si formano soltanto al punto di congelamento (0° C o meno), ma

l’acqua rimane liquida se non è presente

la bassa temperatura da sola non è sufficiente in quanto

un agente di nucleazione, indispensabile per iniziare la formazione del ghiaccio. In presenza di

tale agente la formazione di ghiaccio inizia immediatamente (Prescott, 2009). 17

1.4 Strategie di controllo di Psa

Tutti i produttori di kiwi sono coinvolti nel tentativo di contenere la malattia con strategie che

limitino la diffusione della pandemia e le perdite economiche. Queste riguardano inevitabilmente

pratiche di pulizia e igiene dei frutteti, creazione di varietà resistenti, somministrazione

programmata di composti antimicrobici e l’uso di elicitori che attivino il sistema di difesa delle

piante. mediante l’utilizzo di antibatterici

1.4.1 Controllo

In generale, i trattamenti per combattere Psa sono preventivi e più efficaci se effettuati durante i

2011). L’attuale mezzo di controllo di

primi stadi di sviluppo della malattia (Vanneste et al., Psa

si basa molto sui composti spray di agenti antimicrobici come streptomicina e formulazioni a

2011). L’uso della streptomicina è legale solo in

base di rame (Koh et al., 1994 e Vanneste et al.,

Nuova Zelanda e nei paesi asiatici, mentre in Europa non sono ammessi antibiotici nelle pratiche

agricole e quindi i composti basati sul rame sono l’unico mezzo per contrastare le batteriosi.

Sfortunatamente, entrambi questi tipi di composti chimici creano dei problemi di fitotossicità,

resistenza dei batteri e residui nei frutti.

1.4.2 Fitotossicità di rame e streptomicina

Sia la streptomicina sia i composti a base di rame hanno mostrato fitotossicità quando sono stati

usati come spray antibatterico (Serizawa et al., 1989). I trattamenti con la streptomicina formano,

“cupping”

infatti, un delle foglie, impedendo la traspirazione (Serizawa et al., 1989). Invece gli

antibatterici a base di rame danneggiano sia i tronchi che le foglie. I tronchi si scoloriscono e

formano delle spaccature, mentre le foglie formano degli spot nella pagina inferiore e a volte

diventano di un colore marrone argenteo.

Poiché né strategie di prevenzione né i tradizionali metodi di cura degli alberi sono stati in grado

di arginare l’estendersi della batteriosi, sono in sperimentazione nuovi metodi di biocontrollo.

questa pandemia, come l’uso di

Sono infatti in fase di studio mezzi alternativi per affrontare

terpeni quali il geraniolo e il citronellolo, presenti in diversi oli essenziali o polisaccaridi come il

Questi hanno mostrato un’attività battericida

chitosano. in vitro (Ferrante e Scortichini, 2010) e

sono stati precedentemente utilizzati contro un altro fitopatogeno Gram-negativo, Erwinia

18

amylovora, che causa batteriosi nelle piante appartenenti alle specie rosacee. Tuttavia il loro uso

di studi che ne accerti l’innocuità nelle

è ancora limitato a causa della mancanza piante di kiwi.

Un’altra possibile soluzione è rappresentata dagli elicitori. Questi sono dei composti che

stimolano la produzione di sostanze di difesa da parte della pianta. Tra quelli proposti in

nanoparticelle d’argento

letteratura troviamo ad esempio (Scortichini, 2003). Tuttavia al

momento mostrano problemi di durata degli effetti, che dipendono dal tipo di elicitore e dal tipo

di coltivazione su cui viene usato.

In attesa di risultati incoraggianti, in questo lavoro si propone la terapia fagica, ovvero un

metodo basato sulla capacità dei fagi di lisare specifici batteri, come metodo alternativo

all’utilizzo di antibiotici e composti chimici a base di rame. 19

1.5 I batteriofagi

Un batteriofago (fago) è un virus in grado di infettare esclusivamente cellule batteriche senza

provocare effetti negativi su animali o piante. Il termine batteriofago deriva appunto da

“batterio” e dal greco “φαγειν”, che vuol dire mangiare, descrivendo così la capacità dei fagi di

infettare la cellula batterica e lisarla liberando numerose particelle virali che continueranno

l’infezione. I batteriofagi sono virus a DNA o RNA (sia a doppia che a singola elica) e, in quanto

tali, sono privi di un’organizzazione cellulare e di un metabolismo proprio e dipendono dalla

cellula ospite per la loro replicazione.

I primi microbiologi hanno visto e hanno descritto i segni dell’azione dei fagi sulle colture

batteriche, ma non è stato eseguito nessuno studio esaustivo prima del lavoro dell’inglese

Frederick W. Twort, che nel 1915 pubblicò un articolo al riguardo. Egli definì un agente

di 0,2 μm e capace di provocare ampie modificazioni

infettivo capace di passare attraverso filtri

della morfologia delle colonie batteriche. Lo scienziato aveva anche intuito che nonostante la

natura simile ai virus di piante e animali, questi non erano in grado di infettare altro che cellule

batteriche. Purtroppo Twort non fu in grado di continuare i suoi studi a causa dei suoi impegni

militari durante la Prima Guerra Mondiale.

il canadese Felix d’Herelle, mentre lavorava all’Istituto Louis Pasteur a Parigi,

Nel 1917

pubblicò la sua scoperta avvenuta in modo indipendente da Twort, descrivendo i batteriofagi in

un libro intitolato “Le

numerosi articoli. Nel 1921 pubblicò bactériophage: son rôle dans

l’immunité” molti aspetti dell’attività biologica dei fagi. Subito

in cui riportava aveva intuito il

grande potenziale di questi virus come agenti antimicrobici, tuttavia tutti questi studi furono in

seguito abbandonati a causa dell’introduzione degli antibiotici a largo spettro che erano

un’alternativa più economica e di più facile somministrazione (Adams, 1959).

Lo studio dei batteriofagi è comunque andato avanti poiché il genoma semplice e la loro capacità

di trasferire materiale genetico tra batteri ha portato al loro utilizzo come vettori, contribuendo

così allo sviluppo della genetica e della biologia molecolare. Gli esperimenti che hanno

determinato che gli acidi nucleici sono i portatori dell’informazione genetica, e non le proteine,

sono stati condotti utilizzando i batteriofagi T2 e T4 (Hershey e Chase, 1952); la prima

mappatura genetica è stata effettuata sul genoma di T4 (Benzer, 1955) il quale è stato anche

adoperato per dimostrare la replicazione discontinua del DNA (Okazaki et al., 1968). Anche i

sistemi di modificazione mediante endonucleasi (enzimi di restrizione) sono stati scoperti grazie

all’utilizzo dei batteriofagi, tra cui λ In particolare, λ è stato utilizzato per

(Bertani, 1954). molti

20

scopi diversi, tra i quali la comprensione della regolazione genica (Ptashne et al., 1982) e

l’analisi di genomi di diversi organismi attraverso il suo utilizzo come vettore (Lewin, 2006).

1.5.1 Morfologia e classificazione dei batteriofagi

I batteriofagi possono essere definiti come parassiti intracellulari obbligati dei batteri poiché non

possiedono un metabolismo indipendente. Lo studio dei fagi ha rivelato che questi virus sono

estremamente diversificati, presenti in tutta la biosfera e attaccano praticamente tutte le specie

batteriche esistenti. Di conseguenza, la grandezza del genoma varia enormemente, da poche

migliaia di basi alle 498 mila del fago G, ad oggi quello con il genoma più grande mai

sequenziato (Kutter e Sulakvelidze, 2005). Una particella fagica o virione è composto da una

molecola di DNA o RNA, a singolo o a doppio filamento (ds o ss), incapsulato dentro un

rivestimento di proteine o lipoproteine. La loro dimensione varia tra i 10 e i 400 nm e, di

conseguenza, sono visibili esclusivamente al microscopio elettronico.

iniziale dei batteriofagi è stato ideato negli anni ’30 e si basa sulle

Il sistema di classificazione

caratteristiche dei differenti ospiti dei batteriofagi (Nelson, 2004). Con l’avvento del microscopio

elettronico a trasmissione (TEM) negli anni ’40 i batteriofagi sono stati classificati in base alla

morfologia (Luria et al., 1943). Da allora la Commissione Internazionale sulla Tassonomia dei

la morfologia dei virioni e la composizione dell’acido nucleico come basi

Virus (ICTV) ha usato

per la classificazione dei fagi in 10 famiglie (tab. 4). Più del 95% di tutti i fagi descritti nella

letteratura appartengono all’ordine dei Caudovirales o fagi a dsDNA. Le tre maggiori famiglie

che comprendono i Caudovirales sono distinte dalla morfologia della coda: il 60% di questi sono

Siphoviridae, con una coda lunga e flessibile, il 25% sono Myoviridae, con una coda contrattile e

infine il 15% sono Podoviridae con una coda corta e tozza.

Gli altri fagi dalla morfologia poliedrica, filamentosa o pleiomorfica rappresentano solo il 3-4%

dei fagi studiati e appartengono a 7 famiglie (tab. 3) e alcune di queste sono molto piccole

(Ackermann, 2007). 21

Forma Famiglia Genoma, Membri Numero*

Particolarità,

Dimensione

Ordine Myoviridae Coda contrattile T4 1312

Caudovirales Lunga coda, non λ

Siphoviridae 3262

contrattile

dsDNA, senza Podoviridae Coda corta T7 771

envelope ssDNA (C), 27 nm, ΦX174

Microviridae 38

capsomeri con

sporgenze

dsDNA (C), capside

Corticoviridae PM2 3

complesso, lipidi,

63 nm

dsDNA (L), vesicola

Tectiviridae PRD1 19

lipidica interna,

pseudo-coda, 60 nm

ssRNA (L), 23 nm,

Leviviridae MS2 38

come polio virus

dsRNA (L), Φ6

Cystoviridae 3

segmentato, envelope

lipidico, 70–80 nm

ssDNA (C), filamenti

Inoviridae fd 66

o bastoncelli, 85–

1950 x 7 nm

dsDNA (C),envelope

Plasmaviridae MVL2 5

lipidico, no capside,

80 nm

Tabella 3. Classificazione dei batteriofagi. Non sono inclusi i fagi che infettano solo gli Archea.

( )

* da Ackermann, 2007. (C): circolare e (L): lineare 22

I virioni con la coda sono tipicamente composti da proteine e DNA in un rapporto di 1:1. In tutti

i fagi a dsDNA, il cromosoma è altamente condensato dentro la testa del virione e rappresenta il

20-25% della sua massa (Earnshaw, 1977). La struttura del capside maturo deve essere

abbastanza robusta da poter mantenere questo cromosoma nella sua forma condensata. Infatti al

contrario di molti virus animali, questi fagi rilasciano il loro materiale genetico attraverso un

meccanismo di iniezione invece di usare un metodo di disassemblamento del capside.

Tutti i Caudovirales hanno un capside dalla simmetria icosaedrica (20 facce e 12 vertici) o dei

derivati di questa. La grandezza dell’icosaedro della testa è correlata alla grandezza del genoma

che deve contenere e il suo diametro varia tra i 45 e i 100 nm. Gli angoli dell’icosaedro sono

generalmente fatti di pentameri delle proteine del capside mentre il resto della superficie è fatto

da esameri della stessa proteina (o una simile) (Kutter e Sulakvelidze, 2005).

La proteina che unisce la testa alla coda (proteina portale) è una struttura virale molto importante

l’entrata del

perché è coinvolta in diversi passaggi del ciclo infettivo. Questa controlla, infatti,

e l’attacco della coda alla testa durante la formazione del virione, durante l’infezione

DNA

cambia la sua conformazione e permette al DNA di uscire dal capside e dirigersi verso la cellula

batterica.

La coda fa aderire il fago all’ospite serve come condotto per l’iniezione del genoma e la sua

lunghezza può variare da 3 a circa 800 nm di lunghezza. Di solito è dotata di una piastra basale o

all’estremità distale (fig. 7).

di fibre

Ultimamente questo metodo di classificazione è in stato di rivalutazione poiché ignora la grande

quantità di genomi sequenziati. Una classificazione su base molecolare sarebbe sicuramente più

precisa, anche se al momento è alquanto difficile perché non esiste un gene universale analogo

all’rRNA 16S usato per i batteri (Paul et al., 2002). 23

Figura 7. Morfologia di tre virus della famiglia dei Caudovirales. Da sinistra a destra, disegni

schematici di un Siphovirus (coda lunga e non contrattile), un Myovirus (coda lunga e contrattile)

e un Podovirus (coda corta).

1.5.2 Ciclo vitale dei batteriofagi

Lo studio dei fagi è stato possibile con la messa a punto da parte di Delbruck e Ellis di un

metodo per sincronizzare l’infezione di un fago virulento con un ospite suscettibile (one step

growth experiment). La curva di crescita di un batteriofago è contraddistinta da due fasi distinte:

il periodo di latenza e il periodo di crescita. Durante il periodo di latenza non vi è alcuna

liberazione di virioni e successivamente, durante il periodo di crescita, le cellule ospiti vanno

rapidamente incontro a lisi liberando i fagi infettanti. Viene raggiunto, infine, un plateau senza

che vi sia un’ulteriore liberazione di virioni (fig. 8). Il numero totale dei fagi liberati può essere

utilizzato per calcolare il volume di scoppio, cioè il numero di virioni prodotti per cellula

infettata.

Il periodo di latenza rappresenta il tempo necessario per la riproduzione e la liberazione del

virus. Nella prima parte di questa fase, all’interno delle cellule batteriche ospiti non sono presenti

virioni completi infettanti, come si può facilmente dimostrare lisando le cellule con cloroformio.

A questa prima parte del periodo di latenza è stato dato il nome di periodo di eclisse, dal

momento che i virioni presenti prima dell’infezione sono ora scomparsi. Terminato il periodo di

eclisse, il numero dei virioni maturi infettanti aumenta all’interno della cellula ospite fino alla lisi

di quest’ultima. 24

“one-step”, determinata dal rilascio di particelle fagiche in funzione del tempo,

Figura 8. Curva

presenta tre fasi distinte: un periodo di latenza, un periodo di crescita o di scoppio e infine il

plateau. In blu sono rappresentati i virioni maturi e la linea rossa rappresenta i virus liberi

Fasi dell’infezione la prima fase di un’infezione fagica inizia con il riconoscimento da parte

- Adsorbimento:

del virus di recettori specifici sulla superficie dei batteri, che possono essere di natura

diversa: proteine, LPS, acidi teicoici, pili e flagelli. Il fago riconosce i recettori grazie alle

fibre della coda; questa interazione è controllata dal pH e dalla concentrazione di ioni

2+ 2+

come Mg o Ca ed è stabilizzata da interazioni elettrostatiche.

il DNA del fago transita dalla testa all’interno della

- Penetrazione: dopo la stabilizzazione,

cellula batterica. Nel caso in cui il fago sia dotato di coda contrattile, questa si contrae e

viene spinta all’interno della parete cellulare, perforandola. In questa fase giocano un

ruolo importante gli enzimi litici, simili al lisozima, che perforano la parete del batterio.

Quando un fago infetta un batterio, sfrutta l’apparato trascrizionale e

- Replicazione: l’infezione,

replicativo della cellula per creare nuove particelle virali con cui perpetuare

che in genere termina con la lisi del batterio e il rilascio della progenie virale. 25

1.5.3 La natura dei batteriofagi

La natura dei batteriofagi è però di due tipi: virulenta o temperata. Molti fagi, come T2, T4 e T7,

subito dopo l’ingresso

sono virulenti obbligati e iniziano la loro fase replicativa nel batterio

ospite, causandone la lisi. Altri fagi, ad esempio λ, sono definiti temperati in quanto dopo che

infettano un batterio possono instaurare un altro tipo di relazione con l’ospite. In tal caso il

genoma virale non prende controllo della cellula ospite al fine di distruggerla per liberare nuovi

fagi ma per rimanere al suo interno e replicarsi insieme al genoma batterico. Il clone di cellule

infette generatosi potrà crescere e dividersi per lunghi periodi mantenendo un aspetto

perfettamente normale. Successivamente ogni cellula infettata può produrre fagi e andare

incontro a lisi quando si trova nelle appropriate condizioni ambientali. Tali batteri non possono

essere nuovamente infettati dallo stesso virus perché acquisiscono immunità nei confronti di una

superinfezione. Questo tipo di relazione che si stabilisce tra fago e cellula ospite è detta lisogenia

e sono detti lisogeni in batteri infettati che, in particolari condizioni, possono produrre particelle

fagiche. Sono invece detti temperati, i fagi in grado di stabilire una relazione di lisogenia con la

cellula ospite. La forma latente del genoma virale che rimane all’interno dell’ospite senza

distruggerlo è chiamata profago. Il profago si trova generalmente integrato nel genoma batterico,

ma può esistere anche in forma indipendente. L’induzione è quel processo che porta alla

formazione massiva di particelle virali da una coltura lisogena e poi alla distruzione della cellula

ospite e alla liberazione di nuovi fagi, inducendo quindi il ciclo litico.

L’impatto dei batteriofagi sulla biosfera

1.5.4

I batteriofagi si trovano in molti ambienti terrestri e infatti possono essere isolati sia dagli oceani

dalle fonti termali, dal suolo e dall’acqua, dal corpo umano e degli animali.

sia (Dabrowska et

al., 2005). La massiccia presenza dei batteriofagi nella biosfera rende fondamentale il loro ruolo

nell’evoluzione biologica e la loro importanza nei cicli biochimici globali. È ormai noto che sono

i vettori per il trasferimento orizzontale tra i batteri e effettuano un enorme pressione selettiva

sulle loro popolazioni ospiti, regolando la diversità microbica. Questo fatto è la base della teoria

“kill the winner”, secondo la quale i fagi esercitano un controllo delle popolazioni batteriche,

non permettendo a nessuna specie di raggiungere densità molto maggiore rispetto alle altre. È

stato dimostrato che i batteriofagi sono presenti ad alte concentrazioni negli oceani (Bergh et al.,

1989), nei sedimenti marini (Paul et al., 2002) e anche nel suolo (Ashelford et al., 2003). Negli

ambienti marini, i fagi possono limitare il numero di batteri di diversi ordini di grandezza e la lisi

dei nutrienti inorganici come di quelli organici e

di questi batteri ha come risultato l’aumento 26

Questo fenomeno prende il nome di “viral shunt”

può alterare gli equilibri ecologici dei batteri.

(Wommack e Colwell, 2000). 31

Il numero di fagi presenti nella biosfera è stato stimato essere circa >10 , superando di almeno

10 volte il numero dei batteri (Rohwer, 2003). Il grado della trasduzione di geni mediante i

batteriofagi è stato determinato misurando il trasferimento orizzontale di un gene che codifica

per la resistenza alla kanamicina tra i batteri marini isolati e comunità di batteri naturali

-9 -7

concentrate. È stato trovato che le frequenze di trasduzione variano tra 5,13x10 e 1,33x10

14

l’avvenimento di circa

trasduttanti/PFU (Unità Formanti Placche), da cui si può estrapolare 10

ogni anno solo nell’estuario della Baia di Tampa (Jiang, 1998).

eventi trasduttivi

In molti casi è stato dimostrato che i fagi possono portare dei geni che danno ai batteri dei

vantaggi di sopravvivenza migliorando la resistenza agli antibiotici (Pruzzo et al., 1980) o

aumentando la virulenza (Boyd e Brussow, 2002). In determinate situazioni infatti i batteri

possono esprimere tossine codificate nel DNA virale integratosi precedentemente nel

cromosoma batterico. Questo meccanismo è chiamato conversione lisogenica. Esempi sono

costituiti dalla tossina botulinica, codificata dal fago c-st del Clostridium botulinum (Sakaguchi,

2005), dalla tossina del colera, codificata dal fago CTX di Vibrio cholerae (Waldor, 1996), dalla

tossina shiga, codificata da numerosi fagi di diversi ceppi di Escherichia coli e dalla tossina

fago β

difterica codificata dal del Corynebcterium diphteriae (Freeman, 1951). La difterite è

fattore diretto di virulenza osservato è l’esotossina

appunto causata da C. diphteriae e l’unico

a livello del sito d'infezione e liberata dai ceppi lisogeni per il batteriofago β, il quale

prodotta

introduce nelle cellule batteriche il gene tox.

1.5.5 Utilizzi dei batteriofagi

Ad oggi sono numerose le applicazioni che i batteriofagi trovano in diversi campi della ricerca e

dello sviluppo. I batteriofagi possono essere utilizzati per esempio per diagnosticare la presenza

d’interesse

di batteri patogeni, in diversi modi. Il fago capace di infettare il batterio viene

introdotto nell’organismo e la presenza del patogeno viene confermata dall’amplificazione del

fago, che può essere osservata in due possibili sistemi. Il primo è quello classico, mediante la

formazione di placche su uno strato uniforme di batteri. Il secondo, invece, richiede un

d’ingegneria

intervento genetica, per esempio inserendo nel fago il gene per la luciferasi.

Nella biologia molecolare, come accennato prima, sono stati molto utilizzati per lo studio della

usati anche nella tecnica definita “phage

genetica e della biologia molecolare dei batteri; sono 27

display”: sono usati per la produzione di proteine utili per la composizione di anticorpi

(Hoogenboom et al., 1991), fattori di crescita (Dubaquie e Lowman, 1999) e proteine con motivi

a dita di zinco (Rebar e Pabo, 1994). Un ultimo tipo di utilizzo che sta sempre più prendendo

piede negli ultimi anni è la terapia fagica.

C’è da dire che in generale le caratteristiche dei batteriofagi non sempre portano dei vantaggi:

nell’industria casearia i fagi rappresentano un serio problema in quanto possono naturalmente

entrare in contatto con i batteri acido lattici necessari per la fermentazione e riescono a

sopravvivere ai processi di pastorizzazione (Madera et al., 2004). La lisi di queste colture starter

può danneggiare seriamente i processi di produzione, poiché interferiscono con la produzione di

yogurt, formaggi e crauti. 28

1.6 Terapia fagica per più di sessant’anni la maggiore

Lo sviluppo e la grande produzione di antibiotici è stato

difesa della medicina occidentale contro le malattie causate da batteri. Sebbene gli antibiotici

abbiano salvato la vita a milioni di persone, la loro efficacia è destinata con il passare degli anni

a diminuire: nella primavera del 2012, la World Health Organization (WHO) ha dichiarato

l’inizio della fine dell’era degli antibiotici e ha prospettato un futuro dove le infezioni batteriche

saranno immuni all’azione degli antibiotici (Liljeqvist et al., 2012).

ultimi trent’anni il numero dei nuovi antibiotici approvati negli USA è diminuito,

Infatti negli

l’attuale ricerca non trova nuovi sbocchi (Hughes, 2011) e quando anche si trovano nuove

molecole attive, queste causano notevoli effetti collaterali e colpiscono anche i batteri non

2011), utili sia per la nutrizione dell’uomo (Yan

patogeni (Buffie et al., e Polk, 2004) e per il suo

sistema immunitario (O’Hara e Shanahan, 2006). Il problema della resistenza dei batteri agli

antibiotici è dunque un dato di fatto, ormai non si riescono a trovare nuovi composti in grado di

essere efficaci per più di qualche anno ai numerosi patogeni.

Negli ospedali di tutto il mondo, la maggior parte delle epidemie nosocomiali sono causate da un

piccolo gruppo di patogeni: Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas

aeruginosa, Staphylococcus aureus e diverse specie di Enterobacter.

La vancomicina è spesso l’ultima risorsa contro molti patogeni che non sono sensibili ad altri

antibiotici. Questo è un antibiotico che fa parte della classe dei glicopeptidi. È una molecola ad

alto peso molecolare che agisce inibendo la polimerizzazione della parete del peptidoglicano dei

quest’antibiotico

batteri gram-positivi. Sfortunatamente molto presto non basterà più: sono già

resistenti. Un esempio è l’Enterococcus

comparsi diversi ceppi faecium vancomicina resistente

(VRE), un batterio gram-positivo che popola abitualmente il tratto gastrointestinale di molti

uomini ed altri mammiferi come microrganismo commensale. Tuttavia, in particolari condizioni

E. faecium subisce una trasformazione da simbionte a patogeno opportunista: in simili

circostanze, il batterio, divenuto virulento, causa frequenti batteriemie a causa della sua completa

resistenza. Un altro esempio è lo S. aureus parzialmente resistente alla vancomicina (VISA) che

è stato riscontrato soprattutto in Giappone, Usa e Scozia. È stata dimostrata anche la presenza di

ceppi di S. aureus meticillina resistenti (MRSA) che, una volta diffusi, sono diventati

quest’antibiotico.

vancomicina resistenti in alcuni pazienti trattati con 29


PAGINE

81

PESO

1.22 MB

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Esame: Microbiologia
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biotecnologie industriali
SSD:
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher mancusiello di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Microbiologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Tor Vergata - Uniroma2 o del prof Thaller Maria Cristina.

Acquista con carta o conto PayPal

Scarica il file tutte le volte che vuoi

Paga con un conto PayPal per usufruire della garanzia Soddisfatto o rimborsato

Recensioni
Ti è piaciuto questo appunto? Valutalo!