Tecniche di citogenetica post natale e anomalie cromosomiche negli aborti spontanei

MATERIALI

Gli strumenti utilizzati in laboratorio sono:

 cappe a flusso laminare che determinano la sterilità sul banco di

lavoro;

 strumenti di miscelazione come agitatori magnetici con piastra

riscaldante;

 strumenti per la separazione di miscugli quali centrifughe;

 strumenti di misurazione : bilancia digitale, cilindro graduato;

 vetreria: beute, becher, pipette Pasteur ,vetrini, vetrini copri oggetti,

vaschette per colorazione vetrini;

 micropipette, pipetus;

 plasticheria: portaprovette, tubi Falcon da 15 e 50 ml, Eppendorf,

pipette, capsule Petri; bisturi, siringhe,fiasche;

 microscopio invertito, microscopio ottico;

 incubatore per culture cellulari; 23

METODI

Un volta pervenuti i campioni in laboratorio sono allestite culture cellulari

che permetteranno dopo una crescita adeguata di esaminare il corredo

cromosomico.

Le culture cellulare di aborto sono effettuate all’interno della cappa a flusso

laminare, in modo da avere la sterilità necessaria per evitare l’inquinamento

del campione da parte di funghi, muffe e parassiti. (Barch et al,1997)

Semina

4.1 :

 Prelevare una piccola aliquota di tessuto, frammenti di cute o di

placenta e sciacquarlo con PBS, per eliminare i residui di sangue e gli

eccessi di antibiotico e antimicotico, ripetendo questo passaggio più

volte;

 Tagliare con il bisturi il tessuto formando tanti piccoli frammenti e

porli in due capsule di Petri (Figura 8);

 Aggiungere 2 ml di terreno completo, CHANG;

 Incubare a 37° C in incubatore a CO2 al 5% per 12 giorni;

 Trascorsi i 12 giorni controllare al microscopio invertito la crescita

cellulare; FIGURA 8

24

4.2 A crescita avvenuta:

 Si aggiunge tre ore prima il Colcemid, soluzione capace di arrestare il

processo mitotico in metafase agendo sulle fibre del fuso mitotico, i

cromosomi in questa fase si contraggono come in una normale mitosi,

scompare la membrana nucleare, ma mentre in una normale divisione

lo stadio successivo sarebbe l’attacco delle fibre del fuso ai centromeri

e la sistemazione dei cromosomi sulla piastra equatoriale, alla

presenza della colchicina questo processo non avviene e viene inoltre

ritardate per molte ore la divisione dei cromosomi nella regione

centroameriche.

 In seguito le cellule sono poste in sospensione utilizzando la Tripsina,

enzima appartenente alla classe delle idrolisi, in laboratorio è utilizzata

per staccare dalla piastra le cellule in coltura, che crescono per

adesione, in primo luogo bisogna rimuovere il terreno di coltura

residuo il quale contiene un inibitore della tripsina (alfa-1-antitripsina)

poi lavare le cellule con soluzione salina e aggiungere la tripsina che le

staccherà.

 Le cellule sono raccolte mediante centrifugazione (e scarto del

surnatante), trattate con una Soluzione Ipotonica di Sodio Citrato per

determinare il rigonfiamento e la rottura della membrana plasmatica

dove i cromosomi si spostano dal centro verso la membrana cellulare;

25

 Segue un trattamento con Fissativo che stabilizza la struttura dei

cromosomi, fissativo costituito da metanolo e acido acetico in

rapporto 3:1. L’acido acetico entra in contatto con l’acqua ambientale

e si ionizza data la sua igroscopicità liberando ioni H+ che rompono i

legami salini e idrogeni provocando l’allontanamento delle catene.

L’acqua penetra gli spazi inter catena e interagisce con i gruppi polari

delle catene polipeptidiche con ulteriore allontanamento. A livello

microscopico si ha un rigonfiamento delle cellule citoplasmatiche che

si disgregano trascinando con sé i cromosomi che si sparpagliano

finché il fissativo non è evaporato, I cromosomi aumentano sino a 10

volte causando la formazione di zone più o meno condensate che con

coloranti daranno zone più o meno intensamente colorate.

Lo scopo, quindi del fissativo è di ELIMINARE l’ACQUA DALLA CELLULA,

FISSARE IL DNA ed ESTRARRE PARZIALMENTE ISTONI E PROTEINE NON

ISTONICHE permettendo UNA LUNGA FISSAZIONE DELLE CELLULE A -

20°C. (Figura 9)

 Segue l’allestimento sul vetrino. FIGURA 9

26

4.3 PROCESSAMENTO:

1. Aggiungere due gocce di Colcemid e lasciare incubare per 3 ore;

2. Versare il contenuto delle fiasche in una provetta da 15 ml;

3. Sciacquare la fiasca con PBS per eliminare i residui del terreno;

4. Aggiungere 0,5 ml di tripsina e incubare per 5 ‘;

5. Al microscopio verificare la presenza di cellule rotondeggianti

staccate dalla parete della fiasca e versare parte del terreno per

bloccare l’azione della tripsina;

6. Trasferire le cellule nella provetta falcon e centrifugare per 10’ a 800

rpm;

7. Eliminare il sovra natante, sospendere su vortex e aggiungere goccia

a goccia 6ml di soluzione ipotonica, (citrato di sodio 1%, pre-

riscaldato), incubare per 30’;

8. Centrifugare per 10’ a 800 rpm;

9. Aspirare il sovra natante;

10.Sospendere nuovamente il campione;

11.Aggiungere goccia a goccia 6ml di fissativo fresco con un rapporto di

3:1 di metanolo: acido acetico;

12.Lasciare in frigorifero per 30’;

13.Centrifugare per 10’ a 800 rpm; 27

14.Aspirare il sovra natante e aggiungere nuovamente il fissativo,

effettuare questi ultimi passaggi per almeno due volte.

15.Preparazione dei vetrini. (Figura 10)

L’allestimento del vetrino avviene portando a temperatura ambiente le

provette, centrifugate per 10 minuti a 800 rmp, si elimina il sovra natante e

si diluisce con fissativo fresco; si lasciano cadere 2-3 gocce delle sospensione

delle cellule sui vetrini puliti e sgrassati. Si fa asciugare all’aria o con un

rapido passaggio sulla fiamma. OSSERVAZIONE DELLE

CELLULE AL MICROSCOPIO

FIGURA 10

28

PREPARAZIONE DEI CROMOSOMI METAFASICI

L’identificazione dei cromosomi è permessa grazie alle tecniche di bandeggio

che creano una serie di bande specifiche lungo l’intero cromosoma

consentendone l’analisi strutturale. Intorno al 1970, infatti, sono state

introdotte metodiche di colorazione dei cromosomi che utilizzano sostanze

in grado di colorare specifiche regioni (bande) in modo più evidente di altre.

Il bandeggio che ne deriva è specifico e costante per ogni coppia di

cromosomi omologhi e permette di ricostruire il cariotipo, evidenziando

anche eventuali anomalie cromosomiche sia di numero sia di struttura.

In genere, si usano 3-5 cellule per l'analisi dei cromosomi al microscopio

ottico e su fotografie: le bande riflettono il diverso grado di condensazione

della cromatina.

Per cui il bandeggio cromosomico avviene in due fasi:

 denaturazione e/o digestione enzimatica dei cromosomi.

 colorazione con coloranti specifici per il DNA che consente di

individuare il braccio p e q dei cromosomi, le regioni e subregioni, cioè

le bande e sottobande che riflettono il diverso grado di condensazione

dei cromosomi mitotici, con alternanza tra una serie di bande chiare e

scure formate da 1-10 Mb (Megabasi) distinte in bande G, Q, R, T e C,

usando coloranti specifici per le regioni ricche in AT e GC.

(Painter ,1923). 29

Esistono diversi tipi di bandeggi, di cui i principali sono:

 Bandeggio QFQ, (Q-fluorescence-quinacrine), (Figura 11):

Ottenuto mediante l’impiego di un colorante fluorescente, la

Quinacrina, che consiste in un’alternanza di regioni intensamente

fluorescenti e di regioni buie. Le bande più luminose corrispondono

alle zone ricche in Adenina e Timina. Tale bandeggio è utilizzato per

rilevare la presenza del cromosoma Y in quanto quest’ultimo apparirà

luminosissimo.

Procedura:

 immergere i vetrini in tampone a pH 7,2 per 10’;

 immergere i vetrini per 2’ in soluzione di quinacrina ;

 sciacquare in tampone per eliminare il fluorocromo in eccesso;

 montare con un vetrino copri-oggetto; FIGURA 11

30

 Bandeggio GTG,(G-trypsin-giemsa),(Figura 12)

Ottenuto col colorante Giemsa e con tripsina, è caratterizzato da

un’alternanza di bande chiare e scure. Le bande chiare corrispondono

a regioni caratterizzate da attività trascrizionale, replicazione precoce

,basso contenuto di DNA ripetuto e sensibilità alla Dnasi I.

Le bande più scure corrispondono alle zone ricche in Adenina e

Timina, relativamente povere di geni, e sono quindi corrispondenti e

sovrapponibili alle bande Q.

E' interessante notare che le bande G contengono DNA che replica

tardivamente nella fase S. Queste bande mostrano un tasso molto

basso di ricombinazione e una minore concentrazione di geni

strutturali.

Procedura:

 immergere i vetrini in Tripsina 0,05% per 5-20’’;

 sciacquare immediatamente in tampone (KH2PO4+Na2HPO4);

 immergere i vetrini in soluzione tampone a pH 6,8 più 4ml di Giemsa

per 15-20’;

 sciacquare in tampone a pH 6,8 e far asciugare all’aria; FIGURA 12

31

5.3 LINEE GUIDA:

Le linee guida sono utili per l’indagine citogenetica, e richiedono:

 La conta delle metafasi, circa 15;

 Le analisi delle metafasi, circa 4;

 Il montaggio di due metafasi;

Data la scarsa qualità delle metafasi nel materiale abortivo, le linee guida non

possono essere seguite in dettaglio perciò in generale si avrà:

 La conta di tutte le metafasi nel vetrino;

 Analisi di alcune metafasi tramite l’ausilio di un software automatico

per la ricostruzione del cariotipo. 32

RISULTATI

Il laboratorio di citogenetica, ove compiuto lo stage formativo ha eseguito dal

2001 al 2015, 783 campioni di aborto spontaneo. L’età media delle donne,

sulle quali è stato esaminato il materiale abortivo è di circa 35 anni e

complessivamente la media delle settimane di amenorrea è di circa 12.

Dei dati citogenetici presentati circa il 15 % sono inquinati, mentre solo del

75% (551 campioni) è stato possibile conoscere il cariotipo fetale.

Tra questi, il 51,5 % presenta un cariotipo normale, di cui il 34,5 % presenta un

genotipo femminile, 46XX, e il 17 %, un genotipo maschile, 46XY.

Il 23,5 % invece, presenta un cariotipo alterato, fra le principali alterazioni vi

sono :

 Il 96,33 % alterazioni numeriche;

 Il 3,67 % alterazioni strutturali;

Per quanto riguarda le anomalie numeriche (Figura 13):

 Il 50,46 % presenta alterazioni numeriche autosomiche, tra questi:

 Il 14,70 % è affetta da trisomia.

 Il 36,7 % presenta eterocromosomia, tra questi:

 Il 6,89 % è affetta da sindrome di Turner;

 Il 14,05 % presenta poliploidie, tra questi:

 Il 4,71 % affetta da triploidia;

 Lo 0,72 % da tetraploidia; 33

% anomalie numeriche

14% alterazioni

autosomiche

50% eterocromosomi

36% poliploidie

FIGURA 13

L’