Sviluppo di una metodica di digital PCR e confronto con FISH per la caratterizzazione molecolare di CDKN2A in gliomi dell'adulto

ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI

BOLOGNA

CORSO DI LAUREA IN BIOTECNOLOGIE

Sviluppo di una metodica di digital PCR e confronto con FISH per la

caratterizzazione molecolare di CDKN2A in gliomi dell’adulto

Presentata da: Relatore:

Luca Tosi Prof. Dario De Biase

N° Matricola: Correlatore:

0000997789 Dott.ssa Sara Coluccelli

A.A. 2022-2023

Sessione Unica

INDICE

1. INTRODUZIONE....................................................................................................................... 1

................................................................................................................... 1

1.1 La glia e le cellule gliali

.............................................................................................................................................. 3

1.2 I gliomi

1.2.1 Classificazione dei gliomi dell’adulto ..................................................................................... 4

1.2.2 Alterazioni dei gliomi finalizzate a scopo prognostico e predittivo ..................................... 7

.......................................................................................................... 9

1.3 Next-Generation Sequencing .................................................................................................... 11

1.4 Ibridazione fluorescente in situ

...................................................................................................................... 13

1.5 Digital PCR (dPCR)

.......................................................................................................................... 14

1.6 Scopo dello studio

2. MATERIALI E METODI 16

........................................................................................................

............................................................................................. 16

2.1 Analisi mutazionale mediante NGS ............................................. 18

2.2 Analisi della delezione in omozigosi di CDKN2A mediante FISH

....................................................................................................... 19

2.3 Analisi mediante Digital PCR

3. RISULTATI E DISCUSSIONE 21

...............................................................................................

4. CONCLUSIONI 28

........................................................................................................................

BIBLIOGRAFIA 29

..............................................................................................................................

1. INTRODUZIONE

1.1 La glia e le cellule gliali

Il sistema nervoso si può suddividere in sistema nervoso centrale, costituito dal cervello e dal midollo

spinale, e sistema nervoso periferico, formato da tutti i nervi che trasportano i segnali del cervello e

del midollo spinale e suddivisibile in sistema nervoso volontario e sistema nervoso involontario.

Il sistema nervoso è costituito da due ampie categorie di cellule, ossia i neuroni e le cellule gliali. La

glia o neuroglia comprende un insieme di diverse tipologie di cellule non neuronali. Nel sistema

nervoso centrale, la glia si può dividere in macroglia, che comprende astrociti, oligodendrociti e

cellule ependimali, e in microglia, ossia un insieme di cellule residenti simili a macrofagi che non

originano dall’ectoderma, ma dai monociti presenti nel sangue e hanno una funzione immunitaria e

di riparazione dei tessuti (Figura 1). Nel sistema nervoso periferico, invece, sono presenti le cellule

di Schwann, le cellule gliali enteriche e le cellule satelliti. Le cellule gliali sono più numerose dei

neuroni e occupano circa la metà del volume del cervello, svolgendo numerose funzioni a livello del

sistema nervoso (1). Figura 1. Tipi di cellule gliali

A livello del sistema nervoso centrale gli astrociti sono più numerosi rispetto agli oligodendrociti e

presentano numerose estroflessioni coinvolte nella formazione di complessi e di vie di propagazione

del segnale tra i neuroni e le fibre nervose, mettendo in contatto i neuroni con i capillari sanguigni e

componendo la barriera emato-encefalica. Secondo numerosi studi, gli astrociti originano da due

diverse vie di sviluppo: nella prima, derivano da cellule precursori che risiedono nella zona

ventricolare e subventricolare germinale, mentre nella seconda via di sviluppo gli astrociti

1

differenziano a partire dalla glia radiale (2). Le prime cellule specializzate ad apparire nel sistema

nervoso centrale sono le cellule gliali radiali, coinvolte nello sviluppo strutturale del sistema nervoso

centrale, poiché i loro prolungamenti radiali servono per orientare la migrazione delle cellule

neuronali progenitrici verso la zona ventricolare. Le cellule gliali radiali sono una popolazione

transiente di cellule che rimangono solo per assolvere a questo compito, per poi scomparire,

probabilmente per trans-differenziazione verso altri tipi di cellule gliali, come gli astrociti, ma è stato

suggerito che potrebbero differenziarsi anche in oligodendrociti (3).

Gli oligodendrociti, invece, sono i responsabili della formazione della guaina mielinica, struttura

altamente specializzata che permette l’isolamento dei fasci nervosi, rendendo possibile una

conduzione estremamente veloce dei segnali elettrici. Il lineage differenziativo degli oligodendrociti

parte dalle cellule neuronali progenitrici (NPC) che si differenziano in precursori degli

oligodendrociti (OPC), popolazioni cellulari entrambe caratterizzate dal marcatore A2B5. Tutta linea

differenziativa, invece, è caratterizzata dall’espressione di tre marcatori, ossia Olig1/2, SOX10 e

Nkx2.2. Gli OPC si differenziano, poi, in pre-oligodendrociti (pre-OL) per specializzarsi, infine, in

oligodendrociti mileinizzanti. I precursori degli oligodendrociti e i pre-oligodendrociti sono

caratterizzati dall’espressione di NG2 e PDGFR-α. Questi progenitori hanno un’attività migratoria e

proliferativa importante durante lo sviluppo embrionale e all’inizio dello sviluppo post-natale del

sistema nervoso centrale, originando dalla zona ventricolare del cervello e del midollo spinale.

Talvolta, questi precursori possono non completare lo sviluppo e rimanere oligodendrociti immaturi

nel cervello dell’adulto (4).

Le cellule ependimali o ependimociti rivestono le cavità del sistema nervoso centrale, formano una

specie di epitelio monostratificato costituito da cellule cubiche o cilindriche estremamente serrate.

Queste cellule sono dotate di ciglia che, con il loro movimento, favoriscono la circolazione del liquido

cerebrospinale.

Nel sistema nervoso periferico, invece, le cellule gliali più numerose sono le cellule di Schwann, che

si dividono in mielinizzanti e non mielinizzanti. Le prime hanno una funzione simile a quella degli

oligodendrociti nel sistema nervoso centrale, ossia formare guaine mieliniche intorno agli assoni dei

neuroni per aumentare la velocità di conduzione del segnale; quelle non mielinizzanti, invece, sono

più simili agli astrociti e hanno funzioni di supporto metabolico e meccanico (1).

Le cellule gliali sono fondamentali per lo sviluppo e il mantenimento del sistema nervoso centrale.

Oltre alla formazione della guaina mielinica intorno agli assoni dei neuroni e al supporto nella

migrazione dei progenitori neuronali, le cellule gliali svolgono numerose funzioni. Molti studi

supportano la tesi, ad esempio, che la glia è fondamentale per la sopravvivenza dei neuroni e che

2

mutazioni nelle cellule gliali possono portare alla morte dei neuroni. Una funzione degli astrociti,

inoltre, è quella di formazione e mantenimento delle sinapsi, ma è anche stato suggerito che queste

cellule possano modulare l’attività neuronale a lunga distanza tramite la propagazione di onde di ioni

calcio. Infine, gli astrociti sono anche coinvolti nella terminazione dell’attività postsinaptica,

attraverso la rimozione di neurotrasmettitori come glutammato e GABA, ma anche mediante

l’eliminazione di ioni potassio con proteine canale e carrier presenti sulla membrana delle cellule

gliali (1,5).

1.2 I gliomi

I tumori cerebrali sono una vasta categoria di lesioni del cervello. La maggior parte delle lesioni

cerebrali sono metastasi provenienti dall’esterno del sistema nervoso, anche chiamate tumori

metastatici del cervello. I tumori primari del cervello sono, invece, quelli che insorgono direttamente

nel cervello a partire da varie tipologie di cellule cerebrali. I tumori primari più comuni sono i gliomi

e i meningiomi. I gliomi rappresentano circa il 30% di tutti i tumori primari cerebrali e l’80% di tutti

i tumori cerebrali maligni. L’incidenza annuale dei gliomi è intorno a 6 casi ogni 100000 persone in

tutto il mondo ed è molto più bassa nelle popolazioni non caucasiche, specialmente per quanto

riguarda il glioblastoma (6). Il termine glioma indica un insieme di tumori neuroepiteliali derivanti

dalle cellule gliali presenti nel sistema nervoso centrale. I gliomi sono classificati istologicamente in

astrocitomi (compreso il glioblastoma), oligodendrogliomi, ependimomi e gliomi misti. La maggior

parte dei gliomi insorge nei quattro lobi del cervello: occipitale (2.8%), parietale (10.6%), temporale

(17.4%) e frontale (23.6%); più raramente, tuttavia, possono apparire nel tronco encefalico, nel

cervelletto e nel midollo spinale. I tumori maligni, generalmente, sono più frequenti negli uomini,

mentre meningiomi e alti tumori non maligni sono più frequenti nelle donne. L’età media alla

diagnosi, per tutti i tumori cerebrali e del sistema nervoso centrale, è 59 anni. Il tasso di incidenza

varia a seconda dell’istologia del glioma, con il picco degli oligodendrogliomi tra i 30 e 40 anni e

quello del glioblastoma tra i 60 e 70 anni. In generale, l’incidenza dei gliomi aumenta all’aumentare

dell’età del paziente, anche se non è ancora chiara la base biologica per cui questo accade.

Gli unici fattori di rischio che sono stati dimostrati sono le radiazioni ionizzanti. L’esposizione ad alte

o moderate dosi di radiazioni, sia in ambito medico che ambientale, è l’unico fattore di rischio stabilito

per tumori del cervello. Nonostante numerosi studi riguardo alle radiazioni non ionizzanti provenienti

dai telefoni cellulari, non si è riscontrato un aumento dell’incidenza di gliomi causato da esse (7). 3

Anche se la maggior parte dei gliomi insorge sporadicamente, sono stati identificati dei fattori di

rischio genetici, associati a rare sindromi ereditarie. La neurofibromatosi di tipo 1, ad esempio, è

associata con un aumento dell’incidenza degli astrocitomi pilocitici nei bambini; la sindrome di Li-

Fraumeni è correlata con un’aumentata incidenza dei gliomi, mentre quella di Turcot mostra un

aumento nell’incidenza di gliomi e medulloblastomi. Alcuni studi suggeriscono che certe allergie,

specialmente quelle che causano un aumento di immunoglobuline (IgE), siano correlate con una

diminuzione del rischio di glioma. Infine, sono poche le prove riguardo agli effetti della dieta o di un

certo stile di vita sul rischio di sviluppo di glioma. Si è a conoscenza del fatto, però, che nitriti e nitrati

sono precursori degli N-Nitroso composti (NOCs), presenti soprattutto nella carne rossa e che sono

potenziali cancerogeni per l’uomo; alcuni studi, infatti, hanno dimostrato come sia presente una

correlazione tra la consumazione di carne rossa o lavorata e i gliomi (7).

I gliomi causano diversi sintomi che sono spesso correlati con la sede e con il grado del tumore. I

sintomi che si presentano più comunemente sono mal di testa, convulsioni, disfunzioni cognitive e

deficit neurologico focale; il mal di testa è uno dei sintomi non specifici più comuni nei pazienti con

tumore al cervello e ha un valore predittivo abbastanza basso, ma può essere indicativo di tumore

quando si ha l’insorgenza acuta di un nuovo tipo di mal di testa. Si è anche visto che l’incidenza delle

disfunzioni cognitive aumenta con l’età del paziente e il grado del tumore e sembra che la disfunzione

sia peggiore quando coinvolge l’emisfero dominante del paziente. Infine, i sintomi possono non

essere localizzati solo nella sede del tumore, visto che viene danneggiato il network neurale (8).

Le modalità terapeutiche per il trattamento di pazienti con gliomi sono diverse, ma la rimozione del

tumore mediante chirurgia rimane la prima scelta. Storicamente, veniva effettuata la resezione

chirurgica solo per i tumori ad alto grado o per le lesioni sintomatiche, ma successivamente, diversi

studi hanno dimostrato che la resezione chirurgica precoce, anche in tumori a basso grado e

asintomatici, aumenta la sopravvivenza dei pazienti. Altre terapie utilizzate sono la radioterapia, la

chemioterapia con Temozolomide, gli inibitori di IDH, gli inibitori delle DNA metiltransferasi, gli

inibitori PARP e l’immunoterapia (9).

1.2.1 Classificazione dei gliomi dell’adulto

Inizialmente, i tumori del sistema nervoso centrale venivano classificati in astrocitomi,

oligodendrogliomi, ependimomi e gliomi misti, in base alle loro caratteristiche istopatologiche e alle

similarità morfologiche rispetto alle tipologie cellulari della neuroglia. Inoltre, veniva anche

assegnato un grado WHO (World Health Organization) da I a IV in base alla malignità del tumore,

considerando l’atipia cellulare e l’attività mitotica. Questi tumori variano molto dal punto di vista

4

istologico, da quelli benigni come l’ependimoma a quelli più aggressivi, di grado IV, come il

glioblastoma; si ha anche l’astrocitoma anaplastico, di grado III, e l’astrocitoma diffuso, di grado II;

gli oligodendrogliomi possono essere di grado II o di grado III.

Prima del 2016, i gliomi venivano classificati solo in questo modo; tuttavia, grazie all’avanzare delle

tecniche di biologia molecolare, i diversi profili molecolari iniziarono ad essere integrati nella

diagnosi di glioma, in modo che gli oncologi potessero diagnosticarlo più accurat e somministrare al

paziente trattamenti personalizzati e più efficaci. Nel 2016, infatti, l’organizzazione mondiale della

sanità (WHO) ha revisionato il sistema di classificazione dei gliomi sulla base delle caratteristiche

molecolari, oltre che di quelle istologiche. Nel 2021, poi, l’organizzazione mondiale della sanità ha

condiviso una nuova classificazione dei tumori del sistema nervoso centrale, in cui i gliomi vengono

divisi in diversi sottotipi, separando i gliomi dell’adulto dai gliomi pediatrici. I gliomi diffusi

dell’adulto, in base al profilo molecolare, vengono quindi suddivisi in astrocitomi IDH-mutati (grado

II, III e IV), oligodendrogliomi IDH-mutati e 1p/19q co-deleti (grado II e III), glioblastomi IDH-

wildtype (8,10). La prima distinzione, quindi, avviene sulla base dello stato di IDH (Figura 2).

Figura 2. Classificazione WHO 2021 dei gliomi diffusi dell’adulto

La mutazione di IDH1 e, più raramente, di IDH2, probabilmente, rappresenta l’alterazione nelle

cellule che inizia la patogenesi nella maggior parte dei gliomi diffusi. Il gene IDH codifica per la

famiglia delle isocitrato deidrogenasi, enzimi che normalmente catalizzano la decarbossilazione

+

ossidativa dell’isocitrato ad α-chetoglutarato, generando anche NADPH a partire da NADP .

L’isocitrato deidrogenasi mutata, invece, catalizza la riduzione dell’α-chetoglutarato a R(-)-2-

5

idrossiglutarato, con il consumo di NADPH. Per questo, i gliomi IDH-mutati mostrano alti livelli di

R(-)-2-idrossiglutarato e una diminuzione della produzione di NADPH, causando stress ossidativo

nelle cellule. L’aumento di R(-)-2-idrossiglutarato inibisce l’attività delle diossigenasi α-

chetoglutarato-dipendenti, comprese le demetilasi istoniche e le 5-metilcitosina idrossilasi. Questa

inibizione causa un aumento della metilazione degli istoni e dell’ipermetilazione di isole CpG nel

DNA, che sono marker epigenetici caratteristici dei gliomi IDH-mutati (6).

La mutazione più frequente di IDH1 è R132H, mentre altre mutazioni somatiche possono essere

R132C, R132S, R132L, R132G. Nel gene IDH2, invece, le mutazioni trovate sono R172G, R172M,

R172K ed è anche stato dimostrato che il residuo R172 è esattamente analogo al residuo R132 nel

gene IDH1 e che è implicato nella formazione di legami a idrogeno con il substrato nel sito attivo

dell’enzima (11).

Numerosi studi, inoltre, suggeriscono che i gliomi insorgano a partire da cellule staminali della

neuroglia o dalle cellule progenitrici nel sistema nervoso centrale che possono dare origine sia agli

astrocitomi che agli oligodendrogliomi. Tuttavia, probabilmente solo la mutazione di IDH non è

sufficiente per lo sviluppo e l’evoluzione del tumore, ma le cellule devono acquisire altre mutazioni

(12).

Negli astrocitomi IDH-mutati, ad esempio, insorgono anche mutazioni in TP53 e nel gene ATRX (α-

thalassemia/mental retardation syndrome X-linked gene), la cui perdita di funzione è correlata con

l’allungamento dei telomeri, che causa una maggiore proliferazione cellulare. Mutazioni di ATRX e

co-delezione 1p/19q si escludono a vicenda, poiché la seconda è presente solo negli

oligodendrogliomi. Mutazioni del gene oncosoppressore TP53, invece, portano a una proliferazione

cellulare incontrollata. Infine, la delezione in omozigosi del gene CDKN2A/B può diagnosticare un

astrocitoma IDH-mutato di grado IV, anche se le caratteristiche istopatologiche suggeriscono un

tumore di grado II o III (8).

Il gene CDKN2A/B è localizzato nel l