Sviluppo di una metodica di digital PCR e confronto con FISH per la caratterizzazione molecolare di CDKN2A in gliomi dell'adulto

Figura 10. Segnali di fluorescenza di FAM e VIC in ogni microcamera

Per migliorare l'analisidei risultati è possibile "pulire" i grafici, eliminando il segnale di fluorescenza del background, ossia le popolazioni blu e verdi vicino allo zero nei rispettivi grafici.

In figura 11, invece, i grafici mostrano la positività alla fluorescenza di FAM e VIC in ogni microcamera. La popolazione rappresentata dai punti viola è positiva per FAM, quella rappresentata dai punti arancioni è positiva per VIC, mentre la popolazione verde è quella doppio-positiva. Il grafico in figura 11A corrisponde al gene CDKN2A wildtype, mentre quello in figura 11B mostra la delezione del gene. L'aumento della delezione del gene, infatti, coincide con una diminuzione della popolazione doppio-positiva (punti verdi).

Anche in questi grafici, è possibile osservare che in alcune microcamere la fluorescenza sia meno intensa dell'atteso, mostrando anche

in questo caso il fenomeno della "pioggia".

A Figura 11. Positività alla fluorescenza di FAM e VIC in ogni microcamera

Il rapporto CDKN2A/RNasi P, inoltre, non tiene in considerazione la percentuale di arricchimento, ossia la percentuale di cellule tumorali presenti nel campione rispetto al totale. Infatti, essendo presente nel campione anche tessuto non tumorale, il rapporto potrebbe essere diverso da quello atteso, ossia un valore di 1 nel caso di mancanza di delezione, un rapporto di 0,5 in caso di delezione in eterozigosi e uno pari a 0 nel caso di delezione in omozigosi. Per uno studio più approfondito, quindi, bisognerebbe determinare con precisione la percentuale di arricchimento, per poi moltiplicare questo valore per il rapporto CDKN2A/gene di riferimento, per evitare un aumento del valore del rapporto causato dalla presenza di cellule non tumorali, in cui non è presente la delezione di CDKN2A. Visto che spesso la valutazione della percentuale di

arricchimento da parte di un patologo non è molto accurata, la stima da parte di un secondo patologo potrebbe aumentare l'accuratezza portando a risultati migliori. In confronto a campioni con amplificazioni genomiche, in cui è relativamente facile osservare cambiamenti mediante digital PCR a causa di un grande cambiamento nel numero di copie di un gene, nei casi di delezione il cambiamento del numero di copie in tutto il tessuto è relativamente piccolo, soprattutto in caso di un basso contenuto di cellule tumorali. Per questo motivo, l'estrazione del DNA da una piccola area di tessuto, molto ricca di cellule tumorali potrebbe migliorare i risultati, specialmente per il fatto che la digital PCR è sensibile e precisa anche con basse concentrazioni di DNA.

I 7 campioni con la delezione hanno mostrato un rapporto compreso tra 0,12 e 0,66, mentre in quelli che non presentavano la delezione in FISH il rapporto era compreso tra 0,8 e 1,42. Per questo

motivo,26è stato deciso di scegliere un valore soglia pari a 0,7 (<0,7), per la discriminazione dei casi di delezione in omozigosi e dei casi wildype. I campioni 8 e 12 erano gli unici ad avere un rapporto inferiore a 1, con un valore pari a 0,8, vicino al valore di cutoff, nonostante avessero una percentuale di co-delezione in FISH rispettivamente del 10% e 0%. Tuttavia, dal momento che la percentuale di cellule tumorali nel campione era rispettivamente del 40% e 80%, i valori ottenuti possono avere un senso, alla luce anche della scelta di 0,7 come valore di cutoff. CONCLUSIONI 4. Le tecniche molecolari e citogenetiche sono fondamentali per lo studio e la diagnosi dei tumori. Per questo motivo, spesso, trovano ampio utilizzo nell'analisi della variazione del numero di copie, come delezioni o amplificazioni, e dei riarrangiamenti cromosomici. Molte metodiche e tecnologie sono state sviluppate per questo scopo, tra cui, ad esempio, la FISH e la digital PCR. Il vantaggio

dellaFISH è quello di analizzare l'eterogeneità cellulare all'interno di un tumore, ma la digital PCR è più sensibile e precisa, senza contare il fatto che potrebbe essere anche utilizzata per l'analisi di DNA tumorale circolante proveniente dal sangue; al contrario, la FISH viene eseguita su una sezione di tessuto, spesso prelevata in modo invasivo. Inoltre, utilizzando la digital PCR si risparmierebbe in termini di costi e di tempo, dal momento che la FISH è una metodica laboriosa, che richiede una preparazione tecnica molto avanzata e che permette di analizzare un solo campione alla volta. Nonostante la FISH sia ancora la tecnica principale utilizzata per la rilevazione delle anomalie citogenetiche di molti bersagli, in questo studio si è indagata la possibilità di avere gli stessi risultati con una metodica di digital PCR, ottenendo un riscontro positivo. Impostando empiricamente, infatti, un valore soglia di 0,7 per la

discriminazione dei risultati della digital PCR, si è ottenuta una piena corrispondenza tra i risultati delle due metodiche. Indubbiamente, ulteriori studi dovranno essere condotti su un ampio e diversificato numero di campioni, per ottenere risultati solidi che possano consentire alla digital PCR di diventare un potente strumento nella diagnosi dei gliomi e non solo, in ambito clinico. Inoltre, in un futuro studio si dovrebbe anche calcolare il livello di sensibilità e di specificità della metodica, contando il numero di falsi positivi e di falsi negativi e tenendo conto anche della percentuale di arricchimento fornita da uno o più patologi.

In conclusione, i dati ottenuti mediante questo studio dimostrano che la digital PCR può essere una valida alternativa alla FISH per la rilevazione della delezione in omozigosi di CDKN2A in gliomi dell'adulto e non solo. Mediante digital PCR potrebbe essere possibile rilevare non solo anomalie di CDKN2A, ma anche di

Tanti altri bersagli coinvolti nello sviluppo e nella patogenesi di molti tumori. Inoltre, si eviterebbero anche interventi invasivi per prelevare il materiale necessario per un'analisi FISH, dal momento che per la digital PCR è sufficiente poco materiale e, potenzialmente, prelevabile dal sangue. Tuttavia, studi più approfonditi dovranno essere svolti per poter portare questa metodica in ambito clinico, sostituendo o affiancando la FISH nella diagnosi e nella prognosi di vari tumori.

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