Modulazione delle vie di proliferazione cellulare mediata da vinclozolin in un modello in vitro di neuroblastoma umano

ALMA MATER STUDIORUM-UNIVERSITA’ DI

BOLOGNA

DIPARTIMENTO DI FARMACIA E BIOTECNOLOGIE

CORSO DI STUDIO IN FARMACIA

MODULAZIONE DELLE VIE DI PROLIFERAZIONE

CELLULARE MEDIATA DA VINCLOZOLIN IN UN MODELLO IN

VITRO DI NEUROBLASTOMA UMANO

Tesi di laurea in Tossicologia

Tesi Sperimentale

Presentata da: Relatore:

Maria Carmen Prof.ssa ***

Matricola n° Correlatrici:

000000000 Prof.ssa ****

Dott.ssa *****

Anno accademico 2023/2024 Indice

Indice

1. Introduzione......................................................................................................3

1.1 Gli interferenti endocrini........................................................................3

1.1.1 Classificazione degli IE................................................................4

1.1.2 Distribuzione ambientale ed esposizione umana........................14

1.2 Meccanismi d’azione degli IE..............................................................16

1.3 Tossicità degli IE a livello del SNC.....................................................19

1.4 Effetti epigenetici degli IE....................................................................22

1.5 Il VNZ..................................................................................................24

1.5.1 Neurotossicità del VNZ..............................................................27

2. Scopo della ricerca...........................................................................................28

3. Materiali e Metodi...........................................................................................30

3.1 Linea cellulare......................................................................................30

3.2 Terreni di coltura e soluzioni...............................................................30

3.2.1 Terreno di coltura.......................................................................30

3.2.2 Soluzioni.....................................................................................31

3.3 Allestimento delle colture cellulari.......................................................32

3.4 Differenziamento linea SH-SY5Y........................................................32

3.5 VNZ....................................................... .............................................32

..

3.6 Test dell’Alamar Blue per la determinazione della vitalità

neuronale....................................................................................................33

3.7 Test della sonda H DCF-DA per la determinazione della formazione di

2

ROS............................................................................................................35

1

Indice

3.8 Western Blotting per la determinazione della fosforilazione di Akt e

mTOR e dell’attivazione di p53, Bax e Bcl2...............................................36

4. Risultati............................................................................................................38

4.1 Valutazione della citotossicità del VNZ in cellule SH-SY5Y..............38

4.2 Valutazione della formazione di ROS in cellule SH-SY5Y................39

4.3 Analisi dei livelli di pAkt, p-mTOR, p53, Bax e Bcl2 dopo trattamento

con VNZ a concentrazioni subtossiche......................................................40

5. Discussione.......................................................................................................42

6. Bibliografia......................................................................................................45

7. Ringraziamenti................................................................................................53

2

Introduzione

1. Introduzione

1.1 Gli interferenti endocrini

A partire dagli anni Cinquanta, si è evidenziato un aumento di patologie, quali il

cancro al seno e alla prostata, e di disturbi della riproduzione, come l’infertilità.

Questi effetti sono stati correlati con l’esposizione a determinate sostanze

chimiche, appartenenti alla classe degli interferenti endocrini (IE). Nel 1996, la

Environmental Protection Agency (EPA) definì per la prima volta nella storia

queste molecole come “sostanze esogene o miscele di sostanze che interferiscono

con la sintesi, secrezione, trasporto, metabolismo, legame con il recettore o

eliminazione degli ormoni” [1]. Gli studi sugli IE hanno indotto l’Organizzazione

Mondiale della Sanità (OMS) a modificare questa definizione, nel 2002,

affermando che “un IE è una sostanza esogena o una miscela di sostanze che altera

le funzioni del sistema endocrino e conseguentemente causa effetti avversi in un

organismo sano, oppure sulla sua progenie” [2].

L’ultima definizione di IE la diede, nel 2012, la Endocrine Society, dichiarando

che tali molecole sono “sostanze esogene che interferiscono con ogni aspetto

dell’azione ormonale”. Tra la precedente definizione e quest’ultima vi sono due

differenze: la prima è la sostituzione di “funzione del sistema endocrino” con

“azione ormonale”, intesa più in generale come attivazione dei recettori ormonali

e conseguente risposta cellulare; la seconda consiste nell’eliminazione di “effetti

avversi” perché questa terminologia è poco precisa, potrebbe fuorviare e

influenzare studi scientifici su queste sostanze [2].

L’immissione degli IE nell’ambiente risale agli anni Quaranta del Novecento e ad

oggi si conoscono circa mille molecole che appartengono al gruppo degli IE, che

risulta ancora in gran parte sconosciuto. Queste sostanze sono oggi molto diffuse

nell’ambiente. Gli IE hanno origine sia naturale, come micotossine e isoflavoni,

sia sintetica, come fungicidi, pesticidi, metalli pesanti, prodotti chimici industriali,

plastificanti e farmaci. Ogni giorno l’uomo è esposto agli IE, a basse dosi e

costantemente, attraverso tre fonti: l’ingestione di cibo e acqua contaminati e

3

Introduzione

l’inalazione di aria inquinata [3]. Gli IE si distribuiscono in fiumi e mari a causa

del rilascio di acque reflue urbane e industriali; vengono immessi nell’atmosfera

attraverso i gas di scarico delle automobili, delle industrie e per via

dell’incenerimento di rifiuti. Queste sostanze, dalle acque e dall’atmosfera, si

depositano nel suolo, nel terreno e nei fondali marini [4]. Di conseguenza, pesci,

uccelli e mammiferi entrano in contatto con esse tramite il loro nutrimento e queste

si accumulano nei tessuti animali. Gli IE entrano nel processo di

biomagnificazione che comporta l’aumento della loro concentrazione salendo

nella catena trofica e, in tale modo, raggiungono l’uomo attraverso la dieta [5].

Alcuni IE sono caratterizzati da un’alta stabilità molecolare, che li rende sostanze

molto persistenti. Tali sostanze sono ad alto rischio per la salute umana e la loro

produzione è stata bandita circa vent’anni fa. Nonostante questo, essi possono

essere ancora rilevabili nell’ambiente. Altri IE, invece, sono degradati più

facilmente da batteri o altri processi chimici come la fotolisi e l’ossidoriduzione

[4].

La preoccupazione per l’impatto di queste sostanze sulla salute umana è cresciuta

particolarmente negli ultimi trent’anni. Essi, infatti, interagendo con il sistema

endocrino attraverso molteplici meccanismi d’azione, comportano disturbi nella

riproduzione, che possono anche essere transgenerazionali e sono fattori di rischio

per l’insorgenza di patologie come il cancro [6]. Negli ultimi anni si sta osservando

il ruolo di queste molecole a livello centrale. Gli IE possono provocare disturbi

comportamentali e neurotossicità non solo a causa dell’alterazione di sintesi,

metabolismo e rilascio di molecole endogene, come neuropeptidi,

neurotrasmettitori e neurormoni, ma anche attraverso l’attivazione di pathways

molecolari dannosi per le cellule nervose [4].

1.1.1 Classificazione degli IE

Gli IE possono essere classificati in vari modi: nel 2012 l’OMS, diede una sua

classificazione, suddividendoli in quattro macro-classi. Questa suddivisione si

4

Introduzione

basa sulle caratteristiche chimico-fisiche, di accumulo nei tessuti e di applicazione

[7].

1. Sostanze Alogenate Persistenti e Bioaccumulabili o Persistant organic

Pollutants (POPs):

I POPs sono sostanze chimiche persistenti nell’ambiente con effetti negativi diretti

sulla salute umana. Esse sono altamente tossiche, nonostante siano presenti in

quantità inferiori rispetto ad altre sostanze [8]. Queste sostanze sono rilasciate

nell’aria, nel suolo e nelle acque e, poiché non si degradano, possono essere

trasportate a lungo raggio. Accumulandosi nei tessuti animali, entrano nella catena

alimentare e, in questo modo, raggiungono l’uomo [9]. In accordo con la

Convenzione di Stoccolma tenutasi nel 2001, la produzione di alcune di queste

sostanze è stata limitata, mentre per altre è stata definitivamente messa al bando. I

primi POPs identificati vennero chiamati “dirty dozen” poiché causavano gravi

danni sull’uomo e sull’ecosistema: la loro produzione è stata vietata. Questi sono:

aldrina, clordano, diclorodifeniltricloroetano, dieldrina, endrina, eptacloro,

esaclorobenzene, mirex, toxafene, policlorobifenili, dibenzodiossine e

policlorodibenzofurani [3]. Le più alte concentrazioni di POPs si trovano nelle aree

urbane e industrali e sono dovute alle emissioni di gas e al trattamento delle acque

reflue, mentre nelle zone rurali, la presenza di questi inquinanti è dovuta

principalmente alle sostanze usate nell’agricoltura [9]. La categoria dei POPs non

comprende soltanto i composti capostipite, ma anche i congeneri, ovvero i loro

omologhi o isomeri. I congeneri sono un ampio numero di molecole: per tale

motivo, l’esposizione umana a queste sostanze e la loro presenza nell’ambiente è

estremamente elevata.

Tra i POPs troviamo le seguenti molecole.

Le diossine (Fig. 1) sono un ampio gruppo di molecole che comprendono le

policlorodibenzodiossine, i dibenzofurani, i bifenili e altri composti diossino-

simili [10]. Queste molecole esistevano prima dell’industrializzazione soltanto in

piccolissime quantità, dovute a processi, come la combustione, o eventi geologici,

come l’eruzione vulcanica. La loro produzione massiva, cominciata intorno agli

5

Introduzione

anni Quaranta, è stata causata dalle attività industriali dell’uomo [10]. Le diossine

sono estremamente persistenti nell’ambiente e molto liposolubili. L’uomo ne viene

esposto principalmente attraverso l’ingestione di alimenti di origine animale tra

cui carne, pesce e latticini [11].

Fig.1 Struttura base delle diossine, variamente sostituita per ogni molecola del gruppo.

La diossina più tossica per contaminazioni di tipo ambientale e alimentare è la

2,3,7,8-tetraclorodibenzo-diossina (TCDD) (Fig. 2). Essa è estremamente

bioaccumulabile nei tessuti umani: il suo tempo di dimezzamento si è stimato

essere di 7-11 anni. La TCDD è nota per essere stata ampiamente utilizzata dalle

forze militari degli Stati Uniti nella Guerra del Vietnam come defoliante. La

molecola veniva chiamata Agente Arancio e il suo impiego era finalizzato ad

eliminare la copertura forestale e distruggere le colture. Sono stati svolti studi

sull’esposizione dei soldati americani a questa molecola e si è riscontrato che a

distanza di quattro decenni questa diossina fosse ancora presente nei tessuti lipidici

[10]. Fig.2 Struttura della TCDD.

Il meccanismo d’azione delle diossine si esplica attraverso il loro legame con il

recettore degli idrocarburi arilici aromatici: esso può indurre la trascrizione o la

repressione di geni, in particolare quelli del citocromo P450. Inoltre, le diossine

possono interagire con i recettori nucleari per gli estrogeni e per gli androgeni [12].

A causa di queste interazioni, le diossine sono implicate in una lunga serie di

disturbi: esse sono fattori di rischio per il cancro; comportano deficienza

immunitaria, anomalie riproduttive e dello sviluppo, insorgenza di patologie come

6

Introduzione

il diabete e la cloracne. Possono inoltre compromettere il funzionamento del

sistema nervoso centrale (SNC) e periferico [10].

I policlorobifenili (PCB) sono una classe costituita da 209 composti

organoclorurati e singolarmente indicati come congeneri (Fig. 3). A partire dagli

Quaranta, le miscele di PCB furono prodotte in grandi quantità in tutto il mondo

per diverse applicazioni industriali. È stato stimato che la produzione mondiale di

queste molecole fosse di 1.2 - 2 milioni di tonnellate. Ad oggi si ritiene che 0,2 -

0,4 milioni di tonnellate siano ancora presenti nell’ambiente data la loro

persistenza [13]. Sono stati studiati a fondo gli effetti che i PCB hanno sull’uomo:

possono causare endometriosi e fibromi, tumori uterini e soppressione dell’attività

degli ormoni tiroidei e del sistema immunitario. I PCB aumentano il rischio di

diabete [14] e hanno un impatto negativo sullo sviluppo neurologico [15].

Figura 3. Struttura base dei PCB. I congeneri sono variamente sostituiti.

Il diclorodifeniltricloroetano (DDT) (Fig. 4) è un insetticida molto lipofilo,

semivolatile, introdotto durante la Seconda Guerra Mondiale con applicazioni

principalmente agricole e usato anche contro la malaria. È stato stimato che la sua

produzione mondiale fosse di 4,5 milioni di tonnellate. Il suo tempo di emivita è

di 10 - 15 anni. Il DDT viene trasportato a lungo raggio da aria e acqua ed è

estremamente bioaccumulabile oltre che persistente nell’ambiente [16]. Nel 1980,

la dispersione di questa sostanza insieme ad altre simili come dicofol e

diclorodifenildicloroetilene (DDE) causò la contaminazione del Lago Apopka, in

Florida [17]. Le conseguenze riscontrate da questo evento furono il declino della

popolazione di alligatori del Lago Apopka e una diminuzione della vitalità delle

loro uova. Vennero inoltre riportate per circa un decennio diverse anomalie nello

sviluppo delle gonadi dei piccoli alligatori. Inoltre, furono rilevati squilibri nei

valori di concentrazione degli ormoni sessuali nel sangue. Questi valori,

7

Introduzione

confrontati con quelli degli alligatori dei laghi vicini, vennero correlati all’azione

del DDT [18]. Questa sostanza venne bandita dapprima in Svezia, poi negli Stati

Uniti e a seguire in tutti gli altri Paesi. Gli effetti del DDT sulla salute umana sono

molteplici: essa può dare insorgenza di leucemie e linfomi. Inoltre, può causare

altri tipi di cancro come al pancreas, al cervello, al seno e alla prostata. Il DDT è

in grado di aumentare il rischio dello sviluppo di endometriosi e di dare alterazioni

del ciclo mestruale. Infine, si sono osservati i suoi effetti dannosi nello sviluppo

neurologico [16]. Figura 4. Struttura del DDT.

(PFOS)

Il perfluoroottansulfonato (Fig. 5) è un surfactante sintetico, con molti

atomi di fluoro. La sua struttura molecolare termina con un gruppo solfonato [7].

Il PFOS è idrofobico ma proteinofilico: è una sostanza che si accumula in

particolare nel fegato, proprio per il suo legame con le proteine circolanti che

raggiungono quest’organo. Si accumula meno nel tessuto adiposo, a differenza

degli altri POPs [7]. La produzione di questa molecola è terminata nel 2001. Essa

veniva utilizzata per la produzione di polimeri che venivano incorporati nei

repellenti per le macchie e in altri agenti di rivestimento superficiale [19].

Figura 5. Struttura dei PFOS.

L’acido perfluoroottanico (PFOA) (Fig. 6) è anch’esso un surfactante. Ha una

struttura simile al PFOS, ma termina con un gruppo carbossilico. Il PFOA ha un

grande potenziale di accumularsi nei tessuti umani lipofili. La sua maggiore

8

Introduzione

applicazione fu quella di emulsionante nella produzione di fluoropolimeri come il

Teflon. Inoltre, viene utilizzato nelle industrie per la sua capacità di conferire a

prodotti come abbigliamento, tappeti e pentole la resistenza ad alte temperature

[19]. Figura 6. Struttura dei PFOA.

Gli effetti di PFOS e PFOA sono stati riscontrati in diversi studi epidemiologici

nella riproduzione maschile e femminile. Causano cambiamenti nei livelli di

ormoni quali estrogeni, testosterone, ormone luteinizzante e follicolostimolante

[20]. Inoltre, sono stati osservati effetti neurotossici di tali sostanze, che conducono

ad un ritardo dello sviluppo neuromotorio, diminuzione delle funzioni cognitive e

di memoria [21].

Sostanze Meno Persistenti e Meno Bioaccumulabili

2. Plasticizzanti: ftalati

- Fenoli non alogenati: bisfenolo A (BPA)

-

Gli ftalati (Fig. 7) sono esteri dell’acido ftalico e comprendono un vasto gruppo

di sostanze di cui il di(2-etilesil)ftalato (DEHP) (Fig. 8) è capostipite.

Queste sostanze si usano principalmente nell’industria delle plastiche come

plastificanti, ovvero come sostanze aggiunte alla materia per migliorane la

modellabilità e flessibilità. Il DEHP si impiega anche come solvente nei prodotti

per la cura personale, veicolo per pesticidi, negli imballaggi alimentari e nella

produzione di vari oggetti quali dispositivi medici, giochi, cavi, inchiostri per

stampanti, colori, vernici e adesivi [22]. Gli effetti negativi degli ftalati sembrano

interessare l’apparato genitale-riproduttivo maschile, causando una diminuzione

dei livelli di testosterone, ipospadia e criptorchidismo [23]. Tali sostanze sono

neurotossiche e, recentemente, è stato riportato un effetto di danneggiamento a

livello degli astrociti [24]. 9

Introduzione

Figura 7. Struttura di base degli ftalati.

Figura 8. Struttura di DEHP.

Il BPA (Fig. 9) è un monomero plastificante che è stato molto usato nei paesi

industrializzati per la produzione di plastiche di uso alimentare, come contenitori

riutilizzabili di cibo e bevande, biberon per bambini, stoviglie e bottigliette

d’acqua, ma anche per la produzione di lenti per gli occhiali, tubi, oggetti di

elettroni