Induzione e purificazione della componente periplasmatica del trasportatore GltT per l’L-glutammato di Neisseria meningitidis

LDH

Glucosio-6- Maltosio 6-

fosfato fosfato Piruvato

Gluconeogenesi

Acido 6-

fosfogluconico Glucosio

Entner- Pentosi fosfati

Doudoroff

Piruvato Sintesi acidi

grassi

Acetil-CoA Acetil-CoA

Pta-Ack Pta-Ack

Ciclo TCA

Acetato Acetato

Figura 5: Metabolismo del carbonio in N. meningitidis. In figura sono rappresentate

schematicamente le principali vie del metabolismo del carbonio nei meningococchi. 9

1.4 Il trasportatore GltT per l’L-glutammato

Sia nelle cellule eucariotiche che in quelle procariotiche sono presenti un gran numero di

proteine integrali di membrana e complessi proteici deputati al trasporto di soluti attraverso la

membrana. Tutte queste proteine sono state classificate in famiglie differenti in base ad

per l’L-glutammato

omologia di sequenza. Il trasportatore denominato GltT, è di tipo ABC ed

appartiene ad una famiglia strutturalmente distinta denominata anche simporto

dicarbossile/catione. A questa famiglia appartengono proteine espresse in cellule neuronali e

cellule gliali del sistema nervoso dei mammiferi deputate al recupero del glutammato

(neurotrasmettitore eccitatorio).

L’L-glutammato è importante nelle cellule batteriche per l’assimilazione dell’ammonio. La

glutammina sintetasi combina l’ammonio con il glutammato per formare glutammina, mentre

la glutammato deidrogenasi combina principalmente l’ammonio con l’α-chetoglutarato per

formare glutammato. Il glutammato rifornisce la cellula di azoto per la sintesi degli

amminoacidi.

L’L-glutammato è quindi un nutriente essenziale per N. meningitidis e viene captato dalla

cellula batterica mediante la sua proteina trasportatrice integrale di membrana GltT la cui

espressione è regolata da un fattore di attivazione trascrizionale GdhR, il quale, non solo

positiva l’espressione del gene

controlla in maniera gdhA, codificante per la L-glutammato

deidrogenasi NADPH specifica, ma, recenti studi, hanno dimostrato che ha una funzione di

regolatore negativo sull’espressione di geni chiave nella via di Entner-Doudoroff che sostituisce

meningococchi mancano dell’enzima

la via glicolitica in N. meningitidis (Figura 5). È noto che i

fosfofruttochinasi che catalizza la conversione da fruttosio-6-fosfato a fruttosio-1,6-bisfosfato.

GdhR blocca l’espressione della glucosio-6-fosfato-1-deidrogenasi e della 6-

fosfogluconolattonasi e, quindi, la conversione del glucosio a gliceraldeide-3-fosfato e

All’interno della cellula il meningococco

successivamente in piruvato (Holten e Jyssum, 1973).

non ha quindi disponibili fonti di glucosio in quanto questo viene rapidamente fosforilato a

glucosio-6-fosfato il quale non può essere metabolizzato dalla cellula batterica; bloccando la

via di Entner-Doudoroff, e quindi rallentando il catabolismo del glucosio. Il regolatore GdhR

inoltre l’espressione e la sinesi del trasportatore GltT dell’L-glutammato.

promuove

Essendo un trasportatore di tipo ABC GltT è formato da tre subunità, codificate da specifiche

ORF che mappano in un unico operone: NMC1938 che codifica per una proteina citoplasmatica

10

che lega l’ATP; NMC1936 che codifica per una permeasi transmembrana; NMC1935 che

codifica per la componente periplasmatica che lega il substrato (Figura 6).

La funzionalità di questo trasportatore è strettamente connessa alla diverse concentrazioni di

intra ed extra cellulari nell’uomo (bassa in ambiente intracellulare ed elevata nel plasma e

+

Na

nell’ambiente extracellulare). Nell’ambiente intracellulare è quindi bassa la concentrazione di

sodio ma elevata quella di L-glutammato dove, quindi, diventa indispensabile la funzione del

trasportatore GltT per permettere l’avanzamento del ciclo degli acidi tricarbossilici. Tali dati

suggeriscono che, la presenza di GltT è indispensabile per la virulenza del meningococco

inoltre mediante l’utilizzo di un

durante il suo ciclo infettivo. Tale ipotesi è stata rafforzata

modello di infezione in vivo in ceppi di meningococco GltT difettivi. Tali ceppi mostravano

infatti un’incapacità di adattamento e di sopravvivenza vari distretti corporei dell’ospite

nei è indispensabile per l’instaurarsi

murino dimostrando così che la disponibilità di L-glutammato

e per l’insorgere di meningite meningococcica (Colicchio et al., 2009). 11

Struttura del trasportatore GltT, di tipo ABC per l’L-glutammato.

Figura 6: In alto è

descritta la mappa genetica e fisica dell’operone GltT. In basso sono rappresentate le principali

componenti del trasportatore di tipo ABC per l’L-glutammato. In particolare la Orf, NMC1937

codificante per la permeasi transmembrana GltT; la Orf NMC1935, codificante per la subunità

periplasmatica del trasportatore ed infine la Orf NMC1938, codificante per l’ATP binding

protein. 12

1.5 La tecnica della cromatografia di affinità

La cromatografia di affinità si basa su interazioni specifiche tra un ligando immobilizzato su

una fase stazionaria e le biomolecole stesse, sfrutta quindi le interazioni specifiche di una

macromolecola con il suo ligando tramite legami idrogeno ed interazioni deboli. Questo tipo di

cromatografia permette la separazione di molecole molto simili tra loro sulla base delle loro

proprietà chimico-fisiche e sfrutta la diversa distribuzione dei composti tra le due fasi non

miscibili: quella stazionaria e quella mobile. Entrambe le fasi possono essere solide, liquide o

gassose e spesso si trovano in combinazione tra loro in base al tipo di cromatografia di affinità

che si intende svolgere.

Le tecniche cromatografiche vengono distinte in base al tipo di matrice usata per la fase

stazionaria, in base alla fase mobile, in base al meccanismo di interazione tra le molecole da

in base alla tecnica usata per l’eluizione.

separare, in base al sistema cromatografico ed infine

La cromatografia di affinità prevede l’immobilizzazione del ligando, specifico per la molecola

che si intende separare, su di una fase stazionaria inerte grazie ad un braccio spaziatore formato

da 6-10 atomi di Carbonio per prevenire eventuali fenomeni di ingombro sterico. Le fasi

stazionarie più comunemente utilizzate sono formate da: agarosio, sepharose,

polyacrylammide, destrano o cellulosa.

La procedura di una cromatografia di affinità è essenzialmente sviluppata in tre fasi:

1. Attacco ed immobilizzazione del ligando sulla matrice della fase stazionaria;

2. Adsorbimento che può essere sia specifico (per una sola molecola) che di gruppo (per

una classe di composti correlati da specifiche caratteristiche chimico-fisiche);

Eluizione che può essere sia specifica dove ci sarà l’aggiunta del ligando libero o di un

3. competitore per favorire il rilascio della molecola di interesse, sia non specifica dove ci

sarà l’aggiunta di soluzioni con pH o forza ionica diversi in modo da ridurre l’affinità

della molecola di interesse con il ligando.

Una volta che il ligando è stato stabilizzato sulla matrice della fase stazionaria si versa nella

colonna cromatografica la soluzione contente una miscela di molecole, come ad esempio

proteine, dove è compresa anche la molecola che si intende separare dal resto della miscela. Le

molecole non affini per il ligando verranno subito eluite, mentre la molecola di interesse resterà

intrappolata nella fase stazionaria a causa della sua affinità per il ligando, che verrà

successivamente eluita utilizzando soluzioni specifiche o non specifiche volte a ridurre

l’affinità tra il ligando e la molecola di interesse. 13

La cromatografia di affinità è spesso usata per la separazione di: substrati ed inibitori da enzimi,

proteine da anticorpi, ormoni da recettori, istoni da acidi nucleici.

Talvolta la cromatografia di affinità è utilizzata per separare determinate proteine ricombinanti

caratterizzate dalla presenza di un affinity tag o tag molecolare, come ad esempio la GST,

glutatione-S-trasferasi e His-Tag, costituito da una coda di istidine, e spesso tali proteine sono

caratterizzate anche da una giunzione per favorire il taglio del tag dopo l’eluizione ed ottenere

così solo la proteina di interesse. Nel caso di utilizzo di proteine ricombinanti ottenute tramite

fusione con la GST, il legame sarà specifico in quanto si utilizzerà come ligando una molecola

come il glutatione, e l’eluizione avverrà grazie all’utilizzo di una miscela

affine al tag,

contenente lo stesso ligando libero (eluizione specifica) che, per competizione, permetterà il

rilascio della proteina ricombinante.

Figura 7: Cromatografia di affinità. Rappresentazione di colonne usate per la cromatografia

per affinità con resina Glutathione sepharose 4B. 14

1.6 La tecnica dell’elettroforesi SDS-PAGE

L’SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) è il metodo più

usato per l’analisi qualitativa di proteine, in quanto viene utilizzato soprattutto per valutare il

grado di purezza, grazie alla separazione delle proteine stesse, basata sulle loro dimensioni, ed

molecolare. L’SDS-PAGE

inoltre, viene utilizzata per determinare il loro peso viene eseguita

all’interno di una cella elettroforetica, che può essere sia orizzontale che verticale, a cui viene

principio fondamentale di questa tecnica è basato sull’utilizzo

applicato un campo elettrico. Il

dell’SDS, ossia, un detergente fortemente anionico. I campioni da analizzare tramite questo tipo

β-

di elettroforesi vengono precedentemente sospesi in un loading buffer contenente:

mercaptoetanolo 5%, che rompe eventuali ponti disolfuro tra le cisteine che stabilizzano la

struttura terziaria delle proteine, glicerolo 10%, che addensa il campione per farlo scendere nel

pozzetto, ed infine blu di bromofenolo 0,02%, un colorante composto da molecole molto

quindi non risente dell’ostacolo dei pori del gel ed indica quando deve essere

piccole e che

interrotto il campo elettrico (quando il colorante raggiunge il fondo del gel viene staccata la

corrente). L’SDS si lega saldamente alle proteine e le denatura aprendole quindi in una struttura

filamentosa avente una serie di molecole di SDS cariche negativamente lungo tutta la superficie

ed in media è presente una molecola di SDS ogni 2 residui amminoacidici. In questo modo le

proteine verranno divise solo in base al loro peso molecolare in quanto avranno tutte carica

negativa.

L’elettroforesi su gel, in generale, sfrutta un campo elettrico che divide le molecole contenute

posti su di un gel. L’elettroforesi di tipo SDS-PAGE

nei campioni da analizzare è leggermente

diversa dall’elettroforesi tradizionale in quanto il gel