Il ruolo del complesso CD271 PDE4 nei fibroblasti e nei miofibroblasti

MATERIALI E METODI

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Culture cellulari

Negli esperimenti in vitro condotti in questo progetto sono stati usati fibroblasti umani otte-

nuti da cute di scarto, proveniente dalle sale operatorie del Policlinico di Modena, di pazienti

sani di età inferiore ai 40 anni. Il materiale è stato raccolto previo consenso informato da

parte del paziente con il parere positivo del comitato etico. Le biopsie cutanee, dopo essere

state trattate con antibiotico (penicillina/streptomicina) per 1 ora 4°C, vengono sgrassate in

una piastra peltri mediante l’uso di pinze e forbici in un ambiente sterile. Successivamente

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vengono ridotti in frammenti di circa 0,5 cm e immersi in dispasi II (5mg/ml) overnight a 4°C,

per permettere all’amino-endopeptidasi di separare l’epidermide dal derma. Il giorno se-

guente il derma viene separato dall’epidermide con l’aiuto di due pinzette e sminuzzato. Di

seguito, i frammenti di qualche millimetro vengono trasferiti in una fiasca e ricoperti con un

velo di terreno per facilitare l’adesione alla plastica. Ogni due giorni è stato aggiunto qualche

ml di terreno di coltura, ponendo attenzione a non provocare il distacco dei frammenti dal

substrato. Dagli espianti i fibroblasti fuoriescono spontaneamente aderendo al supporto di

coltura. Quando le cellule raggiungono la subconfluenza, da prima vengono staccati i dermi

dalla plastica di coltura, poi i fibroblasti vengono lavati con tampone fosfato salino (PBS)

senza calcio e magnesio e staccati con una soluzione di tripsina 0.05/EDTA 0.02, per risemi-

narli in nuove fiasche. Le cellule vengono mantenute in coltura in terreno DMEM con siero di

vitello bovino (FBS) al 5%, L-glutammina al 2% e Penicillina-Streptomicina al 1%.

Per ottenere le culture di mio-fibroblasti, fibroblasti dermici sono stati stimolati a differen-

ziare mediante l’apporto di TGF-β (1 ng/ml, Sigma, St. Louis, MO) per sei giorni, cambiando

1

il terreno ogni due giorni. Il fenotipo è stato controllato valutando l’espressione della pro-

teina contrattile α-smooth muscle actin (SMA) mediante immunofluorescenza e western

blotting. - 24 -

Analisi della differenziazione dei fibroblasti in mio-

fibroblasti

Immunofluorescenza

Per verificare il differenziamento dei fibroblasti in miofibroblasti si utilizza la tecnica di im-

munofluorescenza diretta per marcare, con un anticorpo monoclonale coniugato ad un cro-

moforo, i filamenti di α-SMA caratteristici di questo fenotipo cellulare.

Fibroblasti dermici umani sono stati seminati in e stimolati con 1 ng/ml TGF-

chamber slide

(Sigma) aggiunto al terreno con BSA 0,1%. Dopo 6 giorni, le chamber slide sono state

β 1

aperte e i vetrini sono stati lavati con tampone fosfato salino (PBS) e fissati con formaldeide

al 3,6% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. La formaldeide è un agente cross lin-

kante che serve a preservare la morfologia cellulare e l’immugenicità. Dopo un lavaggio in

PBS, le cellule fissate sui vetrini sono state permeabilizzate con 0,1% Triton X-100 a 37°C per

5 minuti, lavate nuovamente e incubate con una soluzione di blocco (2ml per vetrino di BSA

al 0,5% e 5% di siero) per 1 ora a temperatura ambiente. Il Triton X-100 è un detergente che

serve a rendere permeabile la membrana delle cellule agli anticorpi che verranno aggiunti in

seguito, mentre la soluzione di blocco serve per evitare eventuali legami aspecifici. Dopo un

lavaggio, le cellule sono state incubate con l’anticorpo monoclonale anti-α-SMA prodotto nel

topo (1:400, Sigma, St Louis, MO) per 45 minuti a 37°C. I vetrini sono poi stati lavati tre volte

con PBS ed incubati con una diluizione 1:130 di anticorpo secondario anti-topo AlexaFluor

coniugato al fluorocromo 488 (Molecular Probe inc, Eugene, OR, USA) a temperatura am-

biente per 45 minuti. I vetrini sono stati nuovamente lavati per tre volte in PBS, in acqua

distillata e chiusi usando glicerina tamponata.

I vetrini sono stati conservati a -20°C al buio in attesa di essere analizzati mediante un micro-

scopio confocale a scanner laser (Leica TCS SP2; Leica; Heerbrugg, Switzerland).

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Western Blotting

Il western blotting o immunofissazione è una tecnica biochimica che permette di identificare

la presenza di una determinata proteina su un supporto, che comunemente è una membrana

di nitrocellulosa, su cui erano state trasferite le proteine precedentemente separate tramite

elettroforesi su gel di poliacrilammide.

Lisi cellulare

I fibroblasti pretrattati due ore con DMSO o Apremilast sono stati stimolati con TGF-β NGF

1,

o DMSO (per 48h o 6 day) e lisati direttamente in piastra di cultura, in ghiaccio, con l’impiego

di un particolare tampone di lisi specifico per α-SMA a pH 7,5 (20mM Tris-

HCl, 150mM NaCl, 0,5% Deoxycholate Sodiumm, 1% Triton ) al quale, al momento

dell’uso, viene aggiunto un cocktail di inibitori di proteasi (PMSF 1mM, aprotinina 1µg/ml,

leupeptina 1µg/ml). In dettaglio, dalla piastra di coltura viene asportato tutto il terreno, si

lava accuratamente con la soluzione tampone PBS e si dispensano circa 200-300 μl di tam-

pone di lisi, distribuito uniformemente su tutta la superficie della piastra. Il lisante viene la-

sciato agire per un totale di 5 minuti avendo l’accortezza di favorire meccanicamente (attra-

verso una scraper) il distacco delle cellule dalla piastra. Il lisato cellulare viene raccolto in una

eppendorf e risospeso più volte mediante l’utilizzo di una siringa da insulina per disgregare

le cellule a freddo. A questo punto esso viene raccolto e centrifugato a 4°C per 30 minuti e

se ne conserva il surnatante a -20°C fino al momento dell’utilizzo.

Il contenuto proteico dei lisati è stato quantificato al momento dell’utilizzo mediante lettura

allo spettrofotometro, utilizzando un kit commerciale (Protein Assay Bio-Rad) basato sulla

metodica di Bradford e predisponendo una curva standard di taratura con BSA (Albumina di

Siero Bovino; Sigma Aldrich). - 26 -

Corsa elettroforetica

Un volume totale di 20µl di lisato per campione è stato denaturato a 90°C per 5 minuti e poi

posto in ghiaccio prima di essere caricato sul SDS PAGE al 10 %. La visualizzazione della corsa

è stata resa possibile mediante l’aggiunta di un sample buffer 6X (blu di bromofenolo 0,6%,

SDS 30%, tris-HCl pH 6,8 1,5M e β-mercaptoetanolo 5 %) fino ad una concentrazione finale

per ogni campione di 1X. I campioni sono stati sottoposti ad una corrente costante di 120volt

per 2 ore e 30 minuti in tampone di corsa (Running Buffer) costituito da: Tris 25mM, glicina

250mM, SDS 0,1%.

Trasferimento su membrana di nitrocellulosa

Una volta terminata la corsa, si è provveduto a trasferire le proteine su una membrana di

nitrocellulosa (PVDF) per elettrotrasferimento a 100 volt per 1 ora a temperatura ambiente

in un tampone, transfer Buffer costituito da: Tris 25mM, glicina 200mM, metanolo 20%. Per

verificare l’efficienza e la qualità del trasferimento delle proteine, le membrane sono state

colorate con Rosso Ponceau. - 27 -

Immunoblotting e rivelazione

Per eliminare gli eventuali legami aspecifici le membrane sono state lasciate basculare per

due ore a temperatura ambiente nel blocking buffer costituito da: PBS buffer, pH 7.4 con

Tween 20 allo 0,2% e nonfat milk al 5%.

Le membrane sono state poi incubate per una notte a 4 °C con gli anticorpi specifici: l’anti-

corpo monoclonale di topo anti α-SMA (1:3000; Sigma, St Louis, MO), l’anticorpo monoclo-

nale di topo anti-β-actina (1:1000; Sigma, St Louis, MO) e l’anticorpo monoclonale di topo

anti-vinculina (1:400; Sigma, St Louis, MO). Il giorno successivo le membrane sono state la-

vate più volte in TBS-Tween 20% (il primo lavaggio è stato di 20’ seguito da tre lavaggi da 5’),

poi incubate con anticorpo secondario anti-mouse coniugato alla perossidasi di capra (1:

3000; Biorad, Hercules, CA) per 45 minuti a temperatura ambiente. Infine, le membrane

sono state lavate nuovamente con TBS-Tween 20% e le proteine di interesse sono state rive-

late utilizzando il sistema di rivelazione in chemiluminescenza ECL (Amersham Biosciences

UK Limited, Little Chalfont Buckinghamshire, England). In breve, le membrane sono state in-

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cubate per 1 minuto con 0,125ml/cm di soluzione di rivelazione, costituita dalle soluzioni A

e B in proporzione 1:1. Una volta asciugata, la membrana è stata posta in una cassetta da

autoradiografia a contatto con una lastra fotografica (GE Amersham) per un tempo variabile,

necessario ad impressionarla, e successivamente la lastra è stata sviluppata immergendola

in un liquido di sviluppo e poi di fissaggio.

L'intensità delle bande è stata quantitativamente determinato utilizzando il software ImageJ

(Wayne Rasband, National Institute of Mental Health, Bethesda, MD, USA) normalizzando i

livelli delle proteine in base all’espressione di β- actina.

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Trattamenti cellulari

Per studiare il ruolo del complesso CD271-PDE4, le culture di fibroblasti e miofibroblasti sono

β-amiloide,

state trattare con Apremilast, un inibitore selettivo per le PDE4, con la un ligando

di CD271, in grado di attivare la sua via di trasduzione del segnale indipendentemente dalla

presenza dei co-recettori e con le neurotrofine in grado di legarsi anche ai co-recettori di

CD271, i TrK.

In dettaglio, le cellule, a 48 ore dalla semina, sono state pretrattate con il farmaco Apremilast

alla concentrazione di 10µM, o il DMSO (il suo eluente), a 37°C per 2 ore in terreno di coltura

senza siero (DMEM con BSA 1%). Trascorso tale tempo, sono stati aggiunti alle colture i se-

guenti stimoli: 100 ng/ml di NGF ricombinante umano (Sigma-Aldrich), 100 ng/ml di NT-3

(Sigma, St. Louis, MO) e 40mM del frammento 25-35 di β-amiloide (Bachem, Bubendorf, Swi-

tzerland). Come controllo abbiamo utilizzato il diluente, di Apremilast, il DMSO.

Le culture cellulari sono state mantenute in cultura con gli stimoli per due giorni, e poi sotto-

poste a vari test per studiare apoptosi, differenziamento, migrazione e proliferazione.

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Analisi della proliferazione

MTT Assay

Il test MTT (3,(4,5-dimethylthiazol-2)2,5 difeniltetrazolium bromide) è un saggio di laborato-

rio colorimetrico standard per misurare l'attività dell’enzima mitocondriale succinato deidro-

genasi che riduce l’MTT a Formazano, facendo virare il composto da un colore giallo ad un

colore blu-violetto intenso che colora le cellule. La quantità di Formazano prodotta è diretta-

mente proporzionale al numero di cellule vive, perciò misurando la densità ottica (OD), me-

diante una spettrofotometro, è possibile ricavare in modo indiretto la percentuale di cellule

vitali.

I fibroblasti e i miofibroblasti vengono scongelati al passaggio P4 e piastrati in una multiwell

da 96 pozzetti c