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Il blocco del recettore A2B dell'Adenosina riduce l'attivazione dei fibroblasti nel tessuto tumorale Appunti scolastici Premium

Tesi in farmacologia. In questa tesi si dimostra come il blocco del recettore A2B dell'Adenosina mediante un antagonista specifico riesca a ridurre l'attivazione dei fibroblasti in una forma maligna nel tessuto tumorale. I fibroblasti, insieme ad altre cellule stromali nel microambiente tumorale giocano un ruolo chiave nell'aiutare la progressione e lo sviluppo delle cellule tumorali. Sono stati condotti... Vedi di più

Materia di Laboratorio di ricerca preclinica relatore Prof. S. Morello

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Abstract

Il microambiente tumorale può influenzare la crescita e lo sviluppo tumorale. Molecole solubili

come citochine, chemochine e fattori di crescita rilasciati nel tessuto tumorale da cellule dello

stroma, incluse le cancerose e/o cellule infiltranti la lesione tumorale possono promuovere la

crescita del tumore, favorire l’angiogenesi tumorale e l’immunosoppressione. L’adenosina che

deriva dal catabolismo dell’ATP, è un fattore che contribuisce a creare un ambiente

immunosoppressivo, che aiuta il tumore ad evadere le risposte del sistema immunitario. Studi

recenti hanno dimostrato che tra i sottotipi recettoriali dell’adenosina, il recettore A2B potrebbe

avere un ruolo importante nel mediare gli effetti pro-tumorali dell’adenosina, quali

immunosoppressione, angiogenesi e proliferazione delle cellule tumorali. E’ stato dimostrato che il

blocco selettivo di A2B con antagonisti selettivi inibisce la crescita tumorale in modelli sperimentali

di tumore. Tuttavia il meccanismo alla base di tale attività non è ancora del tutto noto. In questo

lavoro di tesi abbiamo valutato gli effetti di un antagonista selettivo di A2B, il PSB1115 sulla

crescita tumorale in vivo, focalizzandoci sugli effetti di tale molecola su cellule dello stroma

tumorale, in un modello murino di melanoma. I risultati indicano che il blocco del recettore A2B

inibisce la crescita tumorale in vivo e tale effetto è associato ad una diminuzione dell’espressione di

FAP (fibroblast activation protein), un marcatore specifico dei fibroblasti associati al tumore

(CAF). Inoltre l’espressione di FGF2 e CXCL12 in cellule FAP+ è ridotta in animali trattati con il

PSB1115. Esperimenti condotti su fibroblasti isolati dal tessuto tumorale indicano che la

regolazione dell’espressione di FGF2 e CXCL12 è dipendente dalla stimolazione diretta del

recettore A2B espresso da tali cellule.

I dati suggeriscono quindi che il blocco farmacologico del recettore A2B riduce la crescita del

melanoma in vivo agendo anche su cellule stromali, quali i fibroblasti associati al tumore, riducendo

sia il loro stato di attivazione che i livelli di espressione di FGF2 e CXCL12, che possono

contribuire a regolare la crescita tumorale.

Indice

1. Introduzione Pag 1

1.1 Adenosina: metabolismo e recettori 1

1.2 Adenosina e cancro 3

1.3 Microambiente tumorale e progressione del tumore 6

1.4 Fibroblasti associati al tumore 7

2. Scopo della tesi 12

3. Materiali e metodi 13

1.1 Cellule e topi 13

1.2 Modello sperimentale e trattamenti in vivo 13

1.3 Isolamento dei fibroblasti e trattamento in vitro 14

1.4 Immunofluorescenza 14

1.5 Western Blotting 15

1.6 Analisi citofluorimetrica 15

4. Risultati 17

4.1 Il PSB1115 riduce l’espressione di FAP, FGF2 e CXCL12 (SDF-1α) nel tessuto

tumorale 17

4.2 Il recettore A2B regola l’espressione di fattori rilasciati dai fibroblasti associati al

melanoma 23

4.3 Gli effetti indotti dai modulatori farmacologici di A2B sono indipendenti dalla

stimolazione del recettore A2A 27

5. Discussione 29

6. Referenze bibliografiche 31

7. Ringraziamenti

1.Introduzione

Adenosina: metabolismo e recettori

1.1

L'adenosina è un nucleoside purinico composto da una molecola di adenina legata ad un ribosio

attraverso un legame β-N9-glicosidico [Figura 1].

Figura 1 Struttura dell’Adenosina.

È generata dalla degradazione dell’Adenosina trifosfato (ATP), rilasciato dalle cellule

infiammatorie e/o dalle cellule morenti nel tessuto (Antonioli et al., 2013). In condizioni di ipossia o

infiammazione i livelli di adenosina aumentano (Ramakers et al., 2012). L’adenosina modula

l’attività delle cellule immunitarie, come i linfociti T, le cellule T regolatrici (Treg) e linfociti B,

stimolando la secrezione di mediatori antiinfiammatori. Tuttavia, un aumento dei livelli

extracellulari dell’adenosina favorisce la progressione tumorale proteggendo le cellule tumorali

stesse dall’azione delle cellule immunitarie (Ohta et al., 2006).

L’ATP, una volta rilasciato nello spazio extracellulare, viene metabolizzato ad opera degli enzimi di

superficie CD39 e CD73: il CD39 converte l’ATP ad AMP mentre e il CD73 l’AMP ad Adenosina

[Figura 2]. L’induzione di questi enzimi è mediata da fattori di trascrizione sensibili all’ipossia,

come HIF-α (Hypoxia-inducible factor 1-alpha) e il fattore trascrizionale Sp1 (Synnestvedt et al.,

2002). La diminuzione della concentrazione di adenosina è mediata da specifici enzimi come

l’Adenosina Chinasi (AK), che trasforma l’adenosina in AMP, e dall’Adenosina Deaminasi (AD),

4

che trasforma l’adenosina in Inosina [Figura 2]. In condizioni di ipossia l’espressione di AK

diminuisce favorendo un aumento della concentrazione di adenosina.

Figura 2: Metabolismo dell’ATP. Una volta rilasciato dalle cellule immunitarie, l’ATP viene

metabolizzato dal CD39 e dal CD73 in Adenosina (Ado). L’adenosina prodotta agisce sui recettori

dell’adenosina (AR) e viene rimossa dallo spazio extracellulare dall’Adenosina Chinasi (AK) che la

converte in AMP oppure può essere metabolizzata ad Inosina ad opera dell’Adenosina Deaminasi

(AD). L’ipossia diminuisce l’espressione di AK aumentando la concentrazione di Ado nello spazio

extracellulare.

L’adenosina esplica le proprie azioni mediante 4 recettori metabotropici (AR): A1, A2A, A2B e A3,

che attraversano la membrana sette volte, interagendo nello spazio citoplasmatico con una proteina

G. A1 e A3 sono recettori accoppiati a proteine Gi e la loro attivazione porta ad una diminuzione

dei livelli di cAMP, mentre A2A e A2B sono accoppiati a proteina Gs la cui attivazione porta ad un

aumento dei livelli di cAMP [Figura 3]. A2B può essere inoltre accoppiato alla proteina Gq

attivando la fosfolipasi C e la mobilitazione delle riserve di calcio in molti tipi di cellule (Palmer et

al., 1995) [Figura 3]. 5

Figura 3: Recettori dell’adenosina e signalling intracellulare. Immagine presa da

https://sites.google.com/a/unicam.it/diego-dal-ben/activities-and-collaborations

I recettori dell’adenosina hanno una distribuzione variabile in diversi sistemi (sistema nervoso

centrale, cardiovascolare, renale, respiratorio, immunitario e gastrointestinale) dove partecipano alla

modulazione delle normali funzioni biologiche .

Adenosina e cancro

1.2

Molteplici meccanismi immunosoppressori impediscono a cellule del sistema immunitario di

ostacolare la progressione del tumore. Tra questi, l’accumulo di adenosina nello spazio

extracellulare risulta essere una potente strategia da parte delle cellule tumorali per evadere le

risposte del sistema immunitario. Attraverso l’interazione con i recettori dell’adenosina, soprattutto

A2A e A2B, essa protegge i tessuti da reazioni immunitarie eccessive dopo un danno tissutale (Ohta

et al., 2006). Tale meccanismo viene sfruttato dalle cellule tumorali per creare immunodeficienza

nel microambiente tumorale. Essendo l’adenosina una molecola altamente instabile (di breve

emivita), i suoi effetti sono limitati al microambiente in cui viene rilasciata e dipendono

principalmente dai diversi livelli di espressione dei recettori metabotropici da essa attivati. Come

6

conseguenza dell’interazione dei recettori A2A e A2B si induce un forte effetto

immunosoppressorio attraverso l’aumento di cAMP che porta all’inibizione della segnalazione di

NF-kB, dei recettori dei linfociti T (TCR) e della segnalazione JAK-STAT, limitando così la risposta

di citochine e fattori di crescita (Palmer et al., 2008).

L’ipossia, fenomeno molto comune nel microambiente tumorale di molti tumori, è una dei principali

fattori che permettono l’accumulo di adenosina nello spazio extracellulare. Oltre all’ipossia, altri

fattori sono coinvolti nell’aumento della concentrazione di adenosina: l’adenosina stessa (sulle

cellule endoteliali), IL-2 (sulle Treg), PGE2 (sui linfociti e cellule mieloidi), TNF-α (sulle cellule

endoteliali), interferoni di tipo I (sulle cellule endoteliali, TGF-β (sulle cellule Th17, le cellule T e le

MDSC) (Regateiro et al., 2011) e altri. Nel microambiente tumorale sono molte le cellule che hanno

la capacità di generare adenosina, come le cellule tumorali , le Treg , i linfociti T helper 17 , le

MDSC , le cellule endoteliali, i CAF e altri tipi di cellule (Turcotte et al., 2015).

Il rilascio di ATP dalle cellule morenti nell’ambiente tumorale rappresenta un segnale critico di

pericolo per le cellule dendritiche che attivano le cellule T helper 1 (Th1) innescando così

meccanismi di risposte immunitarie antitumorali (Ghiringhelli et al., 2009). Contrariamente,

l’adenosina ha dimostrato diminuire la capacita delle cellule dendritiche di attivare le risposte

immunitarie Th1, sopprimendo così la loro azione antitumorale.

Numerosi studi hanno evidenziato che il recettore A2B ha un ruolo importante nel promuovere la

progressione tumorale mediata dall’adenosina. A differenza del recettore A2A, l’A2B è un recettore

a bassa affinità, si attiva solo quando i livelli di adenosina sono molto elevati, condizione che si

verifica nel microambiente tumorale (Haskó et al., 2009). La stimolazione di A2BR può

promuovere la metastasi del tumore oltre ad indurre immunosoppressione. Inoltre è coinvolto nella

formazione di nuovi vasi sanguigni a partire da quelli già presenti, mediante la produzione di fattori

pro-angiogenici come il fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF) che viene rilasciato,

dopo la stimolazione del recettore A2B, dalle cellule endoteliali, tumorali e da cellule dendritiche

differenziate (Ryzhov et al., 2008). 7

L’ipossia è uno stimolo importante per l’up-regolazione dell’espressione del recettore A2B. Infatti è

stato dimostrato che l’ipossia può indurre la trascrizione di questo recettore attraverso il fattore di

trascrizione HIF-1α nelle cellule endoteliali (Eltzshig et al., 2003). Inoltre è stato dimostrato che

l’ipossia è in grado di indurre l’espressione del recettore A2B anche sulle cellule dendritiche, cellule

muscolari, fibroblasti e cellule T (Zhao et al., 2008).

Molti tipi di tumore overesprimono il recettore A2B il blocco specifico del recettore induce una

e

riduzione della crescita tumorale in modelli murini anche se il meccanismo di tale effetto rimane

sconosciuto.

Per tali motivi il blocco terapeutico degli effetti dell’adenosina, oppure il blocco della sua

generazione, rappresentano un approccio promettente per l’immunoterapia del cancro.

Recentemente nel nostro laboratorio ci siamo focalizzati soprattutto sullo studio degli effetti del

blocco farmacologico del recettore A2B sulla crescita tumorale in un modello murino di melanoma

(Iannone te al., 2013; Sorrentino et al., 2015, 2016). I nostri dati dimostrano che l’antagonista di

A2B riduce la crescita tumorale riducendo l’immunosoppressione mediata da cellule soppressive

mieloidi, MDSCs, aumentando così la risposta mediata dalle cellule T e riduce l’angiogenesi

tumorale. In questo studio abbiamo valutato gli effetti del blocco di A2B su un’altra componente

cellulare dello stroma tumorale, i fibroblasti.

1.3 Microambiente tumorale e progressione del tumore

Nel tessuto tumorale le cellule tumorali non agiscono da sole nella formazione del tumore ma sono

in grado di stabilire rapporti stretti con le cellule del microambiente stromale. Lo sviluppo di un

microambiente stromale alterato è comune a molti tipi di tumori e ciò favorisce in modo molto

significativo alla crescita, alla migrazione e alla metastatizzazione delle cellule tumorali, oltre ad

indurre, in molti casi, resistenza alla chemioterapia. Per questo motivo capire fino in fondo il

8

meccanismo con cui le cellule dello stroma interagiscono con le cellule tumorali risulta essere di

grande rilevanza terapeutica.

Lo stroma è formato da vari tipi di cellule, tra cui i fibroblasti, cellule epiteliali, grasse, vascolari,

immunitarie, infiammatorie e cellule muscolari lisce [Figura 4]. Esse comunicano in modo

altamente eterogeneo con le cellule tumorali attraverso fattori di crescita, citochine, interleuchine e

chemochine, che agendo in modo paracrino sulle cellule circostanti possono indurre direttamente

proliferazione e migrazione delle cellule tumorali e supportare l’angiogenesi (Bhowmick et al.,

2004). Inoltre c’è una crescente evidenza che caratteristiche del microambiente tumorale dei tumori

solidi, come ipossia, stress ossidativo, basso pH e mancanza di nutrimenti, possono contribuire in

modo marcato all’instabilità genetica delle cellule tumorali a causa della ridotta trascrizione di geni

che riparano il DNA in risposta a tali condizioni, favorendo così mutazioni delle cellule tumorali

(Bindra & Glazer, 2005). 9

Figura 4: Interazioni tra cellule di melanoma e cellule del microambiente stromale. Immagine presa

da: http://www.intechopen.com/books/research-on-melanoma-a-glimpse-into-current-directions-

and-future-trends/stromal-microenvironment-alterations-in-malignant-melanoma.

1.4 Fibroblasti associati al tumore

Nel tumore si genera un processo di guarigione tissutale cronico dovuto all’accumularsi di cellule

tumorali in un tessuto, creando un tessuto fibrotico tumorale, conosciuto anche come stroma.

I fibroblasti associati al tumore (cancer-associated fibroblast, CAF) rappresentano la maggioranza

delle cellule nello stroma del microambiente tumorale e vi è un crescente interesse per lo studio dei

CAF come bersagli farmacologici per le terapie antitumorali (Xing et al., 2010).

Infatti i CAF diventano, nel tessuto tumorale, una macchina sintetica che produce molti componenti

favorevoli alla progressione tumorale. Hanno un ruolo nella creazione della struttura della matrice

extracellulare (ECM) e nella riorganizzazione metabolica e immunitaria del microambiente

tumorale con un impatto notevole sulla resistenza alla chemioterapia (Hu et al., 2015).

10

La principale funzione dei fibroblasti in un tessuto normale è la sintesi di matrice extracellulare

fibrillare compreso il collagene I, III, V e fibronectina (Rodemann & Muller, 1991). Essi

contribuiscono anche alla formazione della membrana basale attraverso la secrezione di collagene

IV e laminina (Chang et al., 2002). Producono anche un'ampia fonte di fattori solubili che agiscono

in modo paracrino e fattori di crescita autocrini che regolano la crescita delle cellule circostanti

nonché la loro stessa crescita. È interessante notare che i fibroblasti non solo mantengono l'integrità

della membrana della matrice extracellulare, ma in alcuni casi, contribuiscono anche al suo

rimodellamento secernendo proteasi, come le metalloproteinasi della matrice (MMP), che

degradano in modo efficace la matrice extracellulare (Simian et al., 2001). Un altro ruolo

importante dei fibroblasti è il loro coinvolgimento nella guarigione delle ferite durante la quale i

fibroblasti vengono attivati e diventano un tipo specializzato di fibroblasti, i miofibroblasti, che

sono dotati di una maggiore capacità di sintesi della matrice extracellulare. Tuttavia, il meccanismo

di come questi miofibroblasti ripristinano il loro fenotipo originale non è ancora chiaro. Oltre a

fibroblasti, altri tipi di cellule, come le cellule infiammatorie e dell’endotelio contribuiscono

all'integrità e omeostasi dello stroma. Tra i componenti delle cellule stromali, i CAF condividono

una morfologia simile con miofibroblasti osservati nella guarigione delle ferite (Eyden, 2008).

Durante la progressione del tumore, le cellule tumorali sono in grado di alterare le caratteristiche del

stroma adiacente per creare un microambiente favorevole alla loro crescita. Rispetto ai normali

fibroblasti e i miofibroblasti, i CAF sono geneticamente e fenotipicamente diversi, sono

perennemente attivati, non ritornano ad un fenotipo normale né vanno incontro ad apoptosi (Li et

al., 2007). I CAF si trovano in diversi tipi di cancro e sono molto eterogenei tra loro, derivano

probabilmente da fibroblasti residenti, da cellule epiteliali, da cellule endoteliali o da cellule

mesenchimali.

Un marcatore specifico dei CAF è FAP (Fibroblast Activation Protein) (Garin-Chesa et al., 1990),

una glicoproteina inducibile di superficie, appartenente alla famiglia delle serin-proteasi, ha attività

sia collagenasica e sia dipeptidil peptidasica, aiutando a degradare la ECM. La sua espressione è

11

limitata altamente ai fibroblasti associati al tumore mentre non è espressa nei restanti fibroblasti

(Garin-Chesa et al., 1990).

Attraverso la secrezione di varie molecole i CAF possono avere un’azione immunomodulatoria sia

diretta che indiretta. Studi in vitro mostrano che il secretoma (totalità delle molecole secrete da una

cellula) dei CAF potrebbero reclutare e attivare le cellule del sistema immunitario, ma tali studi

sono limitati a cellule in vitro ed è difficile definire con precisione il ruolo dell’intero secretoma in

vivo. Generalmente si ritiene che l’azione del secretoma porti ad un immunodeficienza nel

microambiente tumorale, questo tuttavia può dipendere dalla complicata rete di comunicazione tra

le cellule dello stroma e quelle tumorali anziché essere una caratteristica specifica dei CAF (Harper

& Saison, 2014). La secrezione di citochine, chemochine e fattori pro-angiogenici come IL-6, IL-4,

IL-8, IL-10, fattore di necrosi tumorale (TNF), TGFβ, chemochina-motivo CC-ligando 2 ( CCL2),

CCL5 (noto anche come RANTES), chemochina-motivo CXC-ligando 9 (CXCL9), CXCL10,

CXCL12 (noto anche come SDF1), prostaglandina E2 (PGE2), ossido nitrico (NO) e antigene

leucocitario umano G (HLAG) possono avere un’azione diretta e indiretta sulla modulazione del

sistema immunitario nel microambiente tumorale (Soleymaninejadian et al., 2012). Il TGFβ regola

una miriade di risposte prevalentemente immunosoppressive, e recenti studi hanno anche implicato

TGFβ nella differenzazione delle cellule T helper 17 (cellule TH17) (Bailey et al., 2014), mostrando

la complessità della funzione immunomodulatoria del secretoma dei CAF. Studi in vitro mostrano

che il rilascio di IL-4, IL-6 e IL-8 da parte dei CAF può indurre ad un differenziamento

immunosoppressivo delle cellule mieloidi (Kim et al., 2012). Citochine come CXCL9, CXCL10 e

CXCL12, presenti nel secretoma dei CAF, sono implicate nel reclutamento delle cellule T (Barnas

et al., 2010).

I CAF possono anche modulare l'immunità indirettamente, tramite il loro impatto sulla angiogenesi

tumorale (regolando la migrazione trans-endoteliale di cellule del sistema immunitario), e attraverso

l’acquisizione di molecole di adesione sulla loro membrana, come la molecola di adesione

intercellulare 1 (ICAM1) (Powell et al., 1999). Favoriscono l’angiogenesi e l’accumulo di cellule

12

immunitarie all’interno del microambiente tumorale attraverso la secrezione di diversi fattori di

crescita, come il fattore di crescita dell’endotelio vascolare A (VEGFA), il PDGF, il fattore di

crescita epidermico (EGF), IL-6, IL-8, CXCL12 e altri (Fukumura et al., 1998).

I CAF potrebbero anche secernere metaboliti ricchi di energia come ad esempio l’acido lattico e

l’acido piruvico, prodotti attraverso la via di glicolisi aerobica, che possono essere utilizzati dalle

cellule tumorali adiacenti per la produzione di ATP e per la biosintesi di proteine e lipidi necessari

per la crescita e lo sviluppo delle cellule tumorali. Ciò mostra uno scambio di energia tra le cellule

cataboliche dello stroma e le cellule anaerobiche tumorali (Martinez-Outschoorn et al, 2010).

I CAF promuovono la progressione tumorale secernendo, oltre a fattori di crescita, componenti pro-

migratori, così come l’up-regulation dell’espressione di serine-proteasi e metalloproteasi di matrice

che degradano e rimodellano la matrice extracellulare giocando un ruolo fondamentale anche nel

processo di metastatizzazione (Sternlicht et al., 1999) [Figura 5].

13

Figura 5: La matrice extracellulare è attivamente rimodellata da parte dei CAF. Il rilascio di alcuni

fattori (sulla destra dell’immmagine) permette alle cellule tumorali di proliferare, sopravvivere,

metastatizzare e di resistere alla chemioterapia. Possono essere rilasciate sostanze che possono

essere usate dalle cellule tumorali per produrre energia, come il lattato. Attraverso la secrezione di

citochime, chemochine e altri fattori, i CAF sono in grado di modulare la risposta immunitaria (a

sinistra dell’immagine) oltre a promuovere l’angiogenesi.

Immagine presa da Kalluri, Nature Rev Cancer; 2016.

I fibroblasti sono delle cellule molto resistenti in quanto resistono a gravi stress che risultano essere

letali per altri tipi di cellule, compresi i danni causati dai chemioterapici e per questo potrebbero

rappresentare il tipo di cellula dello stroma maggiormente implicata nelle recidive del tumore

(Kalluri, 2016). 14

2. Scopo della tesi

Il lavoro della mia tesi si inserisce in un progetto finalizzato ad indagare ed approfondire i

meccanismi alla base degli effetti anti-tumorali di antagonisti del recettore A2B in un modello

murino di melanoma. In particolare lo scopo della mia tesi è stato quello di studiare gli effetti di un

antagonista selettivo del recettore A2B, il PSB1115, sui fibroblasti associati al melanoma.

15

3. Materiali e metodi

3.1 Cellule e topi

Cellule B16.F10 (cellule di melanoma murino) (LGC Standards srl., Milano, Italia) vengono

mantenute in coltura in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) con il 10% FBS, L-

glutammina 2mM, penicillina 100 U/ml e streptomicina 0.1 mg/ml (Sigma-Aldrich, Milano).

Sono stati utilizzati topi C57BL/6, forniti dalla Charles River (Charles River, Lecco, Italia),

mantenuti presso il laboratorio di Sperimentazione Preclinica dell’Università di Salerno. Tutti gli

esperimenti sono stati condotti in accordo alle linee guida stabilite per la tutela degli animali (DL

No. 116 del 27 gennaio 1992, e European Communities Council Directive del 24 Novembre 1986,

86/609/ECC). Al termine di ciascun esperimento i topi sono stati sacrificati mediante dislocazione

cervicale.

3.2 Modello sperimentale e trattamenti in vivo

Le cellule B16.F10 sono state sospese in Phosphate-Buffered Saline (PBS) e impiantate

5

(2×10 /100μl) sottocute sul dorso destro di ciascun animale previamente anestetizzato e rasato.

Dopo una settimana dall’impianto, quando la lesione tumorale era evidente e misurabile, i topi sono

stati randomizzati e trattati come descritto in seguito. La crescita del tumore è stata costantemente

monitorata misurando il diametro maggiore (D) e minore (d) della lesione mediante un calibro

elettronico. Il volume della lesione è stato calcolato mediante la seguente formula: 4/3π[D/2 x

2

(d/2) ].

Per i trattamenti sono stati utilizzati: PSB1115 (1 mg/Kg) (Sigma Aldrich, Milano, Italia)

somministrato per via peritumorale (p.t.) il settimo giorno dall’impianto delle cellule di melanoma,

per sette giorni consecutivi. Phosphate-buffered saline (PBS) è stato usato come veicolo per il PSB

1115. 16

3.3 Isolamento dei fibroblasti ed esperimenti in vitro

Per isolare i fibroblasti associati al tumore i campioni di melanoma sono stati prelevati

asetticamente dal topo, lavati con PBS sterile e posizionati in una piastra di Petri con RPMI1640

medium supplementato con 10% FBS, 100 U/ml penicillina, 0.1 mg/ml streptomicina, riponendo la

piastra in un incubatore, in modo da permettere ai fibroblasti di fuoriuscire dal tessuto tumorale in

5-7 giorni.

I fibroblasti una volta isolati sono stati fatti crescere su una superficie polilisinata e trattati con

Bay60-6583 (1, 10 o 100 nM) o con PSB1115 (100nM). Per analizzare l’attivazione di ERK1/2, le

cellule sono state stimolate con Bay60-6583 (10 nM) ad intervalli di tempo diversi (5-30-60

minuti).

3.4 Immunofluorescenza

Sezioni congelate di melanoma sono state fissate con paraformaldeide (PFA) al 4% e sono stati

bloccati i siti aspecifici incubandole con bovine serum albumin (BSA) 20% contenente TritonX-100

0.5% per 30 minuti a temperatura ambiente. I fibroblasti cresciuti su superfici polilisinate sono stati

lavati due volte con PBS, fissati con 4% PFA e incubati con goat serum al 20% o BSA al 5% per

30 minuti a temperatura ambiente.

I campioni sono stati poi incubati per tutta la notte con gli anticorpi primari: anti-FAPα, anti-FGF-2

(1:1000; Santa Cruz Biotechnology) e anti-CXCL12 (1:100; Santa Cruz Biotechnology). Il giorno

dopo gli anticorpi primari sono stati rilevati con l’aggiunta di anticorpi secondari come Alexa

Fluor® 488 Goat Anti-Rabbit IgG (1:5000; Life Technologies, Italia) per l’anti-FAPα, Alexa Fluor®

555 Goat Anti-Rabbit IgG (1:5000; Life Technologies, Italia) per l’anti FGF-2 e Alexa Fluor® 488

Goat Anti-Mouse IgG (1:5000; Life Technologies, Italia) per l’anti-CXCL12. Sono stati lasciati 2

ore a temperatura ambiente. Per visualizzare i nuclei è stato usato il DAPI. Le sezioni sono state

osservate usando uno Zeiss LSM 710 Laser Scanning Microscope (Carl Zeiss

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DESCRIZIONE TESI

Tesi in farmacologia. In questa tesi si dimostra come il blocco del recettore A2B dell'Adenosina mediante un antagonista specifico riesca a ridurre l'attivazione dei fibroblasti in una forma maligna nel tessuto tumorale. I fibroblasti, insieme ad altre cellule stromali nel microambiente tumorale giocano un ruolo chiave nell'aiutare la progressione e lo sviluppo delle cellule tumorali. Sono stati condotti espetimenti in vivo e in vitro.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologia farmaceutiche
SSD:
Università: Salerno - Unisa
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher max-92_ di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Laboratorio di ricerca preclinica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Salerno - Unisa o del prof Morello Silvana.

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