Il blocco del recettore A2B dell'Adenosina riduce l'attivazione dei fibroblasti nel tessuto tumorale

Nel tumore si genera un processo di guarigione tissutale cronico dovuto all’accumularsi di cellule

tumorali in un tessuto, creando un tessuto fibrotico tumorale, conosciuto anche come stroma.

I fibroblasti associati al tumore (cancer-associated fibroblast, CAF) rappresentano la maggioranza

delle cellule nello stroma del microambiente tumorale e vi è un crescente interesse per lo studio dei

CAF come bersagli farmacologici per le terapie antitumorali (Xing et al., 2010).

Infatti i CAF diventano, nel tessuto tumorale, una macchina sintetica che produce molti componenti

favorevoli alla progressione tumorale. Hanno un ruolo nella creazione della struttura della matrice

extracellulare (ECM) e nella riorganizzazione metabolica e immunitaria del microambiente

tumorale con un impatto notevole sulla resistenza alla chemioterapia (Hu et al., 2015).

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La principale funzione dei fibroblasti in un tessuto normale è la sintesi di matrice extracellulare

fibrillare compreso il collagene I, III, V e fibronectina (Rodemann & Muller, 1991). Essi

contribuiscono anche alla formazione della membrana basale attraverso la secrezione di collagene

IV e laminina (Chang et al., 2002). Producono anche un'ampia fonte di fattori solubili che agiscono

in modo paracrino e fattori di crescita autocrini che regolano la crescita delle cellule circostanti

nonché la loro stessa crescita. È interessante notare che i fibroblasti non solo mantengono l'integrità

della membrana della matrice extracellulare, ma in alcuni casi, contribuiscono anche al suo

rimodellamento secernendo proteasi, come le metalloproteinasi della matrice (MMP), che

degradano in modo efficace la matrice extracellulare (Simian et al., 2001). Un altro ruolo

importante dei fibroblasti è il loro coinvolgimento nella guarigione delle ferite durante la quale i

fibroblasti vengono attivati e diventano un tipo specializzato di fibroblasti, i miofibroblasti, che

sono dotati di una maggiore capacità di sintesi della matrice extracellulare. Tuttavia, il meccanismo

di come questi miofibroblasti ripristinano il loro fenotipo originale non è ancora chiaro. Oltre a

fibroblasti, altri tipi di cellule, come le cellule infiammatorie e dell’endotelio contribuiscono

all'integrità e omeostasi dello stroma. Tra i componenti delle cellule stromali, i CAF condividono

una morfologia simile con miofibroblasti osservati nella guarigione delle ferite (Eyden, 2008).

Durante la progressione del tumore, le cellule tumorali sono in grado di alterare le caratteristiche del

stroma adiacente per creare un microambiente favorevole alla loro crescita. Rispetto ai normali

fibroblasti e i miofibroblasti, i CAF sono geneticamente e fenotipicamente diversi, sono

perennemente attivati, non ritornano ad un fenotipo normale né vanno incontro ad apoptosi (Li et

al., 2007). I CAF si trovano in diversi tipi di cancro e sono molto eterogenei tra loro, derivano

probabilmente da fibroblasti residenti, da cellule epiteliali, da cellule endoteliali o da cellule

mesenchimali.

Un marcatore specifico dei CAF è FAP (Fibroblast Activation Protein) (Garin-Chesa et al., 1990),

una glicoproteina inducibile di superficie, appartenente alla famiglia delle serin-proteasi, ha attività

sia collagenasica e sia dipeptidil peptidasica, aiutando a degradare la ECM. La sua espressione è

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limitata altamente ai fibroblasti associati al tumore mentre non è espressa nei restanti fibroblasti

(Garin-Chesa et al., 1990).

Attraverso la secrezione di varie molecole i CAF possono avere un’azione immunomodulatoria sia

diretta che indiretta. Studi in vitro mostrano che il secretoma (totalità delle molecole secrete da una

cellula) dei CAF potrebbero reclutare e attivare le cellule del sistema immunitario, ma tali studi

sono limitati a cellule in vitro ed è difficile definire con precisione il ruolo dell’intero secretoma in

vivo. Generalmente si ritiene che l’azione del secretoma porti ad un immunodeficienza nel

microambiente tumorale, questo tuttavia può dipendere dalla complicata rete di comunicazione tra

le cellule dello stroma e quelle tumorali anziché essere una caratteristica specifica dei CAF (Harper

& Saison, 2014). La secrezione di citochine, chemochine e fattori pro-angiogenici come IL-6, IL-4,

IL-8, IL-10, fattore di necrosi tumorale (TNF), TGFβ, chemochina-motivo CC-ligando 2 ( CCL2),

CCL5 (noto anche come RANTES), chemochina-motivo CXC-ligando 9 (CXCL9), CXCL10,

CXCL12 (noto anche come SDF1), prostaglandina E2 (PGE2), ossido nitrico (NO) e antigene

leucocitario umano G (HLAG) possono avere un’azione diretta e indiretta sulla modulazione del

sistema immunitario nel microambiente tumorale (Soleymaninejadian et al., 2012). Il TGFβ regola

una miriade di risposte prevalentemente immunosoppressive, e recenti studi hanno anche implicato

TGFβ nella differenzazione delle cellule T helper 17 (cellule TH17) (Bailey et al., 2014), mostrando

la complessità della funzione immunomodulatoria del secretoma dei CAF. Studi in vitro mostrano

che il rilascio di IL-4, IL-6 e IL-8 da parte dei CAF può indurre ad un differenziamento

immunosoppressivo delle cellule mieloidi (Kim et al., 2012). Citochine come CXCL9, CXCL10 e

CXCL12, presenti nel secretoma dei CAF, sono implicate nel reclutamento delle cellule T (Barnas

et al., 2010).

I CAF possono anche modulare l'immunità indirettamente, tramite il loro impatto sulla angiogenesi

tumorale (regolando la migrazione trans-endoteliale di cellule del sistema immunitario), e attraverso

l’acquisizione di molecole di adesione sulla loro membrana, come la molecola di adesione

intercellulare 1 (ICAM1) (Powell et al., 1999). Favoriscono l’angiogenesi e l’accumulo di cellule

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immunitarie all’interno del microambiente tumorale attraverso la secrezione di diversi fattori di

crescita, come il fattore di crescita dell’endotelio vascolare A (VEGFA), il PDGF, il fattore di

crescita epidermico (EGF), IL-6, IL-8, CXCL12 e altri (Fukumura et al., 1998).

I CAF potrebbero anche secernere metaboliti ricchi di energia come ad esempio l’acido lattico e

l’acido piruvico, prodotti attraverso la via di glicolisi aerobica, che possono essere utilizzati dalle

cellule tumorali adiacenti per la produzione di ATP e per la biosintesi di proteine e lipidi necessari

per la crescita e lo sviluppo delle cellule tumorali. Ciò mostra uno scambio di energia tra le cellule

cataboliche dello stroma e le cellule anaerobiche tumorali (Martinez-Outschoorn et al, 2010).

I CAF promuovono la progressione tumorale secernendo, oltre a fattori di crescita, componenti pro-

migratori, così come l’up-regulation dell’espressione di serine-proteasi e metalloproteasi di matrice

che degradano e rimodellano la matrice extracellulare giocando un ruolo fondamentale anche nel

processo di metastatizzazione (Sternlicht et al., 1999) [Figura 5].

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Figura 5: La matrice extracellulare è attivamente rimodellata da parte dei CAF. Il rilascio di alcuni

fattori (sulla destra dell’immmagine) permette alle cellule tumorali di proliferare, sopravvivere,

metastatizzare e di resistere alla chemioterapia. Possono essere rilasciate sostanze che possono

essere usate dalle cellule tumorali per produrre energia, come il lattato. Attraverso la secrezione di

citochime, chemochine e altri fattori, i CAF sono in grado di modulare la risposta immunitaria (a

sinistra dell’immagine) oltre a promuovere l’angiogenesi.

Immagine presa da Kalluri, Nature Rev Cancer; 2016.

I fibroblasti sono delle cellule molto resistenti in quanto resistono a gravi stress che risultano essere

letali per altri tipi di cellule, compresi i danni causati dai chemioterapici e per questo potrebbero

rappresentare il tipo di cellula dello stroma maggiormente implicata nelle recidive del tumore

(Kalluri, 2016). 14

2. Scopo della tesi

Il lavoro della mia tesi si inserisce in un progetto finalizzato ad indagare ed approfondire i

meccanismi alla base degli effetti anti-tumorali di antagonisti del recettore A2B in un modello

murino di melanoma. In particolare lo scopo della mia tesi è stato quello di studiare gli effetti di un

antagonista selettivo del recettore A2B, il PSB1115, sui fibroblasti associati al melanoma.

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3. Materiali e metodi

3.1 Cellule e topi

Cellule B16.F10 (cellule di melanoma murino) (LGC Standards srl., Milano, Italia) vengono

mantenute in coltura in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) con il 10% FBS, L-

glutammina 2mM, penicillina 100 U/ml e streptomicina 0.1 mg/ml (Sigma-Aldrich, Milano).

Sono stati utilizzati topi C57BL/6, forniti dalla Charles River (Charles River, Lecco, Italia),

mantenuti presso il laboratorio di Sperimentazione Preclinica dell’Università di Salerno. Tutti gli

esperimenti sono stati condotti in accordo alle linee guida stabilite per la tutela degli animali (DL

No. 116 del 27 gennaio 1992, e European Communities Council Directive del 24 Novembre 1986,

86/609/ECC). Al termine di ciascun esperimento i topi sono stati sacrificati mediante dislocazione

cervicale.

3.2 Modello sperimentale e trattamenti in vivo

Le cellule B16.F10 sono state sospese in Phosphate-Buffered Saline (PBS) e impiantate

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(2×10 /100μl) sottocute sul dorso destro di ciascun animale previamente anestetizzato e rasato.

Dopo una settimana dall’impianto, quando la lesione tumorale era evidente e misurabile, i topi sono

stati randomizzati e trattati come descritto in seguito. La crescita del tumore è stata costantemente

monitorata misurando il diametro maggiore (D) e minore (d) della lesione mediante un calibro

elettronico. Il volume della lesione è stato calcolato mediante la seguente formula: 4/3π[D/2 x

2

(d/2) ].

Per i trattamenti sono stati utilizzati: PSB1115 (1 mg/Kg) (Sigma Aldrich, Milano, Italia)

somministrato per via peritumorale (p.t.) il settimo giorno dall’impianto delle cellule di melanoma,

per sette giorni consecutivi. Phosphate-buffered saline (PBS) è stato usato come veicolo per il PSB

1115. 16

3.3 Isolamento dei fibroblasti ed esperimenti in vitro

Per isolare i fibroblasti associati al tumore i campioni di melanoma sono stati prelevati

asetticamente dal topo, lavati con PBS sterile e posizionati in una piastra di Petri con RPMI1640

medium supplementato con 10% FBS, 100 U/ml penicillina, 0.1 mg/ml streptomicina, riponendo la

piastra in un incubatore, in modo da permettere ai fibroblasti di fuoriuscire dal tessuto tumorale in

5-7 giorni.

I fibroblasti una volta isolati sono stati fatti crescere su una superficie polilisinata e trattati con

Bay60-6583 (1, 10 o 100 nM) o con PSB1115 (100nM). Per analizzare l’attivazione di ERK1/2, le

cellule sono state stimolate con Bay60-6583 (10 nM) ad intervalli di tempo diversi (5-30-60

minuti).

3.4 Immunofluorescenza

Sezioni congelate di melanoma sono state fissate con paraformaldeide (PFA) al 4% e sono stati

bloccati i siti aspecifici incubandole con bovine serum album