Farmacologia - parte 2

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INTERAZIONI FARMACO-RECETTORE di sito specifico in grado di riconoscere una sostanza e di mediarne l’effetto.

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1850 Ehrlich serve contatto fisico

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Langley concetto di sostanza ricettiva F moderna = RECETTORE

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1970 studi di binding = Il primo metodo di studio dei recettori fu il metodo di binding che permette di studiare come il

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farmaco lega il recettore e dà origine a una certa risposta biologica (farmacologica).

Recettore per un farmaco → a) un recettore per un endogeno (la maggior parte) b) un enzima (digossina, aspirina) c) un canale

(Ca antagonisti, anestetici locali) d) un ac. nucleico (antibiotici, antimitotici) e) una prot. strutturale (antigottosi, colchicina,

interferisce con la polimerizzazione di una α-tubulina)

Farmaci di natura chimica ≠ possono interagire con lo stesso complesso recettoriale (GABA / BDZ / Barbiturici → recettore

GABAA ) ma ognuno si lega ad un sito ≠ presente sulla stessa macromolecola

CURVA INTERAZIONE FARMACO-RECETTORE

Un recettore è un complesso multiproteico: per interazione farmaco-recettore si fa riferimento solo al sito attivo dove si andrà

a legare il farmaco. Il recettore potrebbe avere un unico sito attivo oppure possederne diversi. Generalmente si schematizza

l’interazione con: R+X < — > RX (non si ha ancora la trasduzione)

Quando il recettore attivato cambia conformazione: RX → RX* RX* che è il complesso dal quale si ha la trasduzione del segnale

che porterà l’effetto. Il legame tra i due deve essere molto debole e reversibile. Altrimenti il farmaco non si allontanerebbe più

dal recettore dando un effetto tossico, divenendo un veleno [alchilammine-rec α-adrenergico]; i legami devono essere circa

20-200 volte più deboli di un legame covalente, come ad esempio un legame ad H o delle forze di Van der Waals. Per ottenere

l’effetto si devono instaurare molti legami ma deboli. Il farmaco deve avere una superficie complementare al recettore. La

specificità del farmaco dipende dalla sua concentrazione, idealmente più il recettore è specifico per il farmaco, tanto meno

deve essere concentrato [esempio i farmaci β2 a basse dosi diventano anche β1 ad alte dosi]. Del recettore bisogna conoscere

la sequenza, clonaggio, conformazione, tipologia, localizzazione

Studio caratteristiche dell’interazione F-R attraverso: curve dose-risposta o concentrazione-risposta, studio di binding,

isolamento, caratterizzazione, purificazione, clonazione del R. Le curve di interazione farmaco-recettore permettono di

identificare la k di dissociazione parametro che indica l'affinità di legame ma non mostra se è agonista o antagonista. La curva

dose-effetto o concentrazione-effetto (la differenza fra dose e concentrazione è che la concentrazione si usa in vitro, mentre

la dose in vivo) permette di determinare la potenza ed efficacia del farmaco e quindi se la molecola in questione è agonista.

RECETTORI

I recettori sono molecole proteiche che legano in modo specifico, definito e con affinità precisa uno o più mediatori endogeni

e che da questo legame subisce una trasformazione conformazionale capace di far scaturire un effetto biologico. In base alla

localizzazione:

Il recettore di membrana trasduce il segnale da parte di ligandi idrofili come neurotrasmettitori, fattori di crescita o

- citochine, che legano una parte esterna del recettore che cambia la sua conformazione e fa avvenire a cascata degli eventi

che alla fine danno l’effetto;

Il recettore intracellulare trasduce il segnale a partire da ormoni steroidei o molecole molto piccole di carattere lipofilo

- che passano per diffusione passiva attraverso la membrana e vanno nel citoplasma o nel nucleo, dove troveranno i

recettori. La trasduzione del segnale è legata alla regolazione dell’espressione di un gene.

Quando non era possibile clonare i recettori si utilizzava la reverse pharmacology è un approccio scientifico utilizzato nella

scoperta di farmaci che parte dall'osservazione degli effetti biologici di un composto per poi risalire al bersaglio molecolare

o al meccanismo d'azione. Le prime informazioni riguardo ai recettori sono state riguardo all’affinità e all’effetto, sulla base di

queste si è generata una nomenclatura che poi è stata sostituita da una nuova basata sulle info ottenute dalla clonazione.

L’effetto farmacologico è detto da un sunto di informazioni biochimiche e fisiologiche.

RECETTORI INTRACELLULARI

I recettori intracellulari stanno dentro la cellula, nel citoplasma o nel nucleo. Sono costituiti da un'unica catena di

amminoacidi, quindi 1 proteina con solo una funzione amminica e una carbossilica.

Dominio di legame al ligando (LBD) è al C-terminale, lega il ligando (es. ormoni steroidei, vitamine, ecc.).

- Il dominio N-terminale è coinvolto nella trans-attivazione e interazioni con cofattori.

- Il dominio di legame al DNA (DBD) è la porzione centrale che riconosce e si lega a sequenze specifiche del DNA

- (elementi di risposta = HRE) e va a trasdurre il segnale regolando la trascrizione del gene.

I ligandi sono molecole piccole e lipofile vitamine A e D, l’ormone tiroideo T4, e tra gli ormoni steroidei si hanno i corticosteroidi

(glucocorticoidi e mineralcorticoidi asse HPA) e gli ormoni sessuali. Normalmente il recettore lega quattro proteine che

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lo tengono in uno stato di inibizione, le HSP (heat shock protein), proteine sensibili allo shock da calore, con la funzione di

tenere il recettore vuoto e proteggerne la parte centrale che interagisce col DNA. Quando sopraggiunge il ligando, le HPS

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vengono liberate (perdono affinità per il recettore e si allontanano) e il recettore cambia conformazione, esponendo la

porzione centrale che lega il DNA; il passaggio successivo è la formazione del dimero grazie alla porzione amminica terminale

che viene fosforilata transattivazione, si auto-fosforilano. La dimerizzazione è mediata dal legame del ligando e

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dall'interazione diretta tra i domini LBD dei recettori. Entra nel nucleo dove il dimero individua una porzione precisa del DNA,

il promotore del gene. Quest’ultimo la lega e stimola l’espressione del gene, attivando la trascrizione. Si può avere anche una

situazione inversa per cui invece di stimolare la produzione di una determinata proteina si va ad inibire l’espressione genica. I

farmaci analoghi degli ormoni steroidei interferiscono con l’attivazione di questi recettori. In caso di infiammazione cronica,

come l’asma, si usa il cortisone: il glucocorticoide inibisce la trascrizione per il gene che va a trascrivere l’RNA per produrre

citochine pro-infiammatorie. I FANS invece si utilizzano per infiammazione acuta, agisce solo a livello delle COX.

RECETTORI DI MEMBRANA

I recettori che sono collocati sulla membrana sono attivati da ligandi piuttosto idrofili o grandi e non passano attraverso la

membrana cellulare per diffusione passiva o facilitata. Sulla superficie della membrana cellulare possono esserci tipi diversi

di recettori per cui entrano in gioco meccanismi di trasduzione molto diversi gli uni dagli altri. I recettori di membrana sono

suddivisi in superfamiglie e sono:

Recettori canale Hanno la capacità di attivare in maniera estremamente veloce (2 ms) la trasduzione del segnale.

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Sono proteine (4-5 subunità, ognuna formata da una catena singola che ha 4 domini transmembrana) che si dispongono

a formare e a delimitare un canale idrofilo che si apre col legame con agonisti o con NT. Queste 5 proteine hanno la

porzione amminica fuori, M1 (primo dominio transmembrana, fra questo e NH2 c’è il sito di legame del’antagonista), M2,

M3, M4. M2 è costituita da amminoacidi con caratteristiche idrofile, delimita l'interno del canale disponendo cariche che

aiutano l'ingresso degli ioni che devono avere carica opposta a questi. Quando si lega l’agonista si ha una fosforilazione

dei residui intracellulari e il canale si apre. L’attivazione di questo recettore determina una repentina variazione delle

concentrazioni ioniche intracellulari e del potenziale elettrico transmembrana (a riposo -70/-56). Quello più classico

è quello nicotinico e si ha l’entrata del sodio (depolarizzazione). Altri sono il GABAA, per la glicina e per il glutammato.

L’agonista può legarsi al sito di legame dell’agonista (curari per recettore nicotinico) o a un sito allosterico (ne esistono

diversi, es. BDZ per GABAa) o per interazione nel lume (esametonio).

Recettori accoppiati alle proteine G Circa il 70 % dei farmaci lega recettori di questo tipo, la differenza tra la prima e

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la seconda famiglia è il tempo, i tempi sono più lunghi. Dal punto di vista molecolare questi recettori sono costituiti da

una unica catena costituita da 7 eliche transmembrana che attraversano altrettante volte la membrana creando 3 anse

esterne e 3 anse interne, questi recettori sono accoppiati alle proteine G. La proteina G è eterotrimerica, possiede tre

subunità diverse: α, β e γ. La proteina G è dotata di attività GTPasica intrinseca, cioè, si occupa di legare e idrolizzare

GTP: aggiungendo un fosfato, è in grado di passare da uno stato inattivo quando lega GDP a uno stato attivo nel quale lega

il GTP. Questa attivazione fa perdere alle subunità β e γ affinità verso la α; l'α-GTP che va ad attivare l’effettore. Ognuno

degli effettori che può essere attivato porta a un effetto differente e ogni volta che il farmaco dà un effetto farmacologico,

terapeutico o collaterale, avviene la trasmissione del segnale che attiva una via biochimica precisa. Le proteine G attivano

gli effettori: un canale ionico o un sistema effettore come l’adenilato ciclasi e fosfolipasi C che producono secondi

messaggero, i più importanti sono AMP ciclico, inositolo-trifosfato (IP3 regola l’apertura dei canali Ca sul RE) e il

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diacilglicerolo. Quest’ultimi a loro volta iniziano una reazione a cascata che determina l’effetto. Poi per l’attività

GTPasica intrinseca la subunità α idrolizza il GPT a GDP e si riunisce alle altre due subunità e il tutto è pronto per un’altra

attivazione.

Caratteristiche funzionali delle subunità α. L’attività farmacologica risiede nel tipo di subunità α che va ad essere attivata

(identificati 20 isoforme):

α-Stimolatorie; hanno attività stimolatoria nei confronti della adenilato ciclasi che produce AMPc. Il cAMP attiva le

o chinasi cAMP dipendenti che vanno a fosforilare a loro volta degli enzimi a seconda del ligando. Tra questi i 3 recettori

β-adrenergici (β1, β2, β3); β3 risiede nel tessuto adiposo, β1 trova sede nel cuore β2 nei bronchi. Il recettore lega la

noradrenalina e la proteina G stimola l’adenilato ciclasi che produce cAMP. Nel cuore aumenta la forza di contrazione

e la frequenza cardiaca, nei bronchi causa broncodilatazione e quindi maggiore apporto di ossigeno (si può usare

agonista per l’asma).

α-Inibitorie suddivise in αi e αO (da other). Inibiscono l’adenilato ciclasi, quindi diminuiscono i livelli di AMPc. Ad

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o esempio, α2 adrenergico, recettore presinaptico nel SNA: le αO chiudono i canali del calcio, la sua mancanza

impedisce l'esocitosi delle vescicole sinaptiche, riducendo il rilascio del neurotrasmettitore nella fessura sinaptica.

Le αi invece aprono i canali del potassio.

α-Q sono subunità stimolatorie che vanno a stimolare la fosfolipasi C (beta) che produce IP3 e diacilglicerolo. IP3

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o lega e apre il recettore canale per il calcio posto sul reticolo endoplasmatico dove è presente la riserva di calcio della

cellula, aumenta la sua concentrazione nel citoplasma e attraverso altre proteine giunge alla cellula muscolare

facendo scorrere i filamenti di actina e miosina provocando la contrazione. L’α1 adrenergico si trova nel muscolo liscio,

aumentando il calcio intracellulare provo contrazione. L’IP3 si lega a recettori sul RE e fa rilasciare Ca+ nel citoplasma.

DAG attiva PKC che fosforila a sua volta degli enzimi. 18

La β-γ trasloca nel citoplasma, si inserisce sotto la membrana e richiama una chinasi che va a fosforilare il recettore,

impedendo un'altra immediata interazione. Una volta subita la prima attivazione, non è più attivabile finché non si è

conclusa la cascata di attivazione e si rimette nella condizione di riposo. Questo è proprio un meccanismo compiuto da

molti farmaci, in quanto tengono bloccato il recettore in modo da non renderlo più stimolabile. È coinvolto anche nel

processo di desensitizzazione: la βarrestina blocca la trasduzione del segnale.

La parte del recettore che trasduce il segnale è la porzione tra la TM5-TM6 e la porzione carbossilica terminale. La

struttura del recettore comincia con un NH2 iniziale, alla TM7 termina con la porzione carbossilica terminale, questa è

accanto all’ansa 5 e 6. Quando arriva ligando esternamente, il recettore cambia conformazione, ruota, si affianca alla

proteina G, acquisisce un fosforo, si stacca da βγ e va ad attivare l’effettore. La chinasi chiamata dalla βγ fosforila il

recettore esattamente in quelle due posizioni, sull’ansa 5-6 e sulla porzione carbossilica. Quando la cascata di attivazione

si è conclusa, αGDP si riaccoppia a βγ e una fosfatasi defosforila il recettore. A quel punto il recettore è nuovamente

stimolabile da un farmaco o da un endogeno.

Uno degli scopi della Farmacologia applicata è anche quello di poter intervenire sulla funzionalità recettoriale:

A livello del sito agonista/antagonista

▪ A livello dell’attivazione della proteina G: vi sono farmaci che vanno a legare la proteina G direttamente, bloccandola.

▪ Siccome questa può essere compartecipata da più recettori, può bloccare la trasduzione di vari tipi di segnale; è un

meccanismo proprio di molti veleni di serpenti e della tossina botulinica.

A livello del sistema effettore

▪ Sulla distruzione del secondo messaggero: se un enzima distruggere il secondo messaggero, la trasduzione del segnale si

▪ ferma.

Sulle variazioni indotte dai secondi messaggeri: L’AMPc all’aumento della sua concentrazione lega la PKA, costituita da

▪ una porzione catalitica e una porzione regolatoria. A mano a mano che AMPc aumenta e si lega al sito regolatorio che perde

affinità per il sito catalitico: quando la catalitica è libera, fosforila i substrati. Successivamente AMPc viene idrolizzato da

fosfodiesterasi. A questo punto la subunità regolatoria non essendo più legata all’AMPc riprende affinità per la catalitica, si

riuniscono e non si ha la fosforilazione. Un farmaco che inibisce la fosfodiesterasi fa sì che si mantenga per più tempo AMPc

legato alla PKA, prolungando l'azione attivatrice del secondo messaggero.

Recettori ad attività tirosin-cinasica intrinseca Sono attivati da sostanze endogene o da farmaci che mediano

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funzioni di proliferazione o differenziamento. Questi sono di solito recettori per i fattori di crescita o citochine

infiammatorie.

Presentano una struttura semplice: unica sequenza amminoacidica molto breve che attraversa solo una volta la

membrana. La parte citoplasmatica è responsabile della trasduzione ed è dotata di attività tirosin chinasica intrinseca,

cioè, fosforila solo le tirosine. Lavorano come dimeri: due recettori vengono attivati da una molecola di ligando, il

recettore di destra fosforila le tirosine del recettore di sinistra, e viceversa il recettore di sinistra fosforila le tirosine del

recettore di destra (transattivazione). Quindi avviene autofosforilazione. Questi recettori sono attivati dai fattori di

crescita, es. IGF (insulinico), NGF (neuronale), EGF (dell’epidermide), FGF (dei fibroblasti). Molti oncogeni sono recettori

per fattori di crescita.

- Recettori per le citochine sono fattori di regolazione per il sistema immunitario e il sistema emopoietico. Si vanno a

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legare al recettore ad attività tirosin chinasica, hanno due subunità che costituiscono il dimero, e come trasduzione del

segnale hanno delle chinasi che si chiamano janus (JAK) e la via è la JAK-STAT. Le janus chinasi sono una famiglia di tirosin

chinasi non-recettore, attivate dalle citochine che sono il ligando. In seguito al legame con il ligando, il recettore le

dimezza e attiva i jak che fosforilano dei fattori di trascrizione (STATs); migrano nel nucleo, regolano l'espressione genica

e mediano processi di proliferazione e differenziamento. Esistono di due famiglie:

- tipo 1 ormone della crescita, prolattina, interleuchina. Le interleuchine sono quasi sempre pro-infiammatorie.

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- tipo 2 interferone o il fattore VII della coagulazione, anticorpi, ovvero le immunoglobuline.

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Recettori ad attività guanilato-ciclasica Simile all’adenilato-ciclasi, la guanilato-ciclasi produce GMP ciclico. Questo

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recettore lega il peptide natriuretico. Regola la diuresi, la pressione arteriosa, ovvero il passaggio di Na+ nel dotto del

nefrone. Perdo sale ed acqua.

Recettori di adesione cellulare Sono recettori che regolano i rapporti tra una cellula e il suo micro (intorno della

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cellula) e macro (organo/tessuto) ambiente: regolano l’adesione della cellula e matrice extracellulare. I recettori di

adesione controllano la migrazione cellulare e la riparazione di strutture vascolari. Trasmettono segnali all’interno della

cellula che regolano: movimento, proliferazione, sopravvivenza della cellula, trascrizione dei geni. Cellule che si

muovono e che quindi portano questi recettori sono: cellule del sistema emopoietico e immunitario. I recettori di

adesione cellulare sono integrine, selectine e caderine. Questi recettori non sono mai da soli, ma cooperano con altri

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tipi di recettori di cui sfruttano la trasduzione del segnale. I recettori delle integrine sono costituiti da due subunità

intrappolate da un atomo di Mn2+ e regolate da un atomo di Mg2+. Con