Cristallizzazione proteica e Risoluzione strutturale di enzimi metabolici in virus giganti, Tesi

La risoluzione strutturale di mg 534

ha aiutato a capire meglio il primo componente di questo cluster. Con questo studio ci siamo concentrati sulla cristallizzazione di mg 535 e mg 536, successivi due enzimi del pathway metabolico delle dideossi-L-esoammine presenti in Megavirus chilensis, nella speranza di riuscire ad identificare le loro strutture e l'effettivo impiego del loro prodotto a livello strutturale nel virus, andando a vedere in quali strutture vengono principalmente utilizzati. Per condurre questo studio ci siamo avvalsi di tecniche di cristallizzazione a diffusione di vapore, hanging drop, dove abbiamo testato svariate condizioni per entrambe le proteine, cercando di ottimizzare un protocollo di cristallizzazione valido e ripetibile testandole senza additivi, con vari cofattori e con il loro stesso prodotto in soluzione per cercare quale fosse la condizione più favorevole.

19[Rappresentazione del modello proposto dei quattro domini della vita. Archea, Procarioti,

Eucarioti e Virus Giganti. (Plos One 5(12): e15530 ]

203 Materiali e metodi

3.1 Analisi bioinformatiche

La sequenza genomica di Megavirus chilensis è stata analizzata per identificare igeni putativi coinvolti nel processo di glicosilazione, sono stati usati i geni omologhi procarioti coinvolti nella produzione di zuccheri modificati. È stato utilizzato il programma BLAST-EXPLORER presente sul server NCBI (URL:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

È stata inoltre eseguito l'allineamento multiplo tra sequenze utilizzando il programma MUSCLE presente sul server EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/), permettendoci di confrontare le sequenze di interesse con le sequenze più conservate in altri organismi al fine di identificare le regioni più conservate e individuare gli aminoacidi caratterizzanti.

3.2 Clonaggio ed espressione delle proteine ricombinanti

Per la cristallizzazione di mg 535 ed mg 536 i geni sono stati clonati, ciascuno in un proprio plasmide.

Il vettore così ottenuto è stato inserito all'interno del ceppo Rosetta di E.coli (DE3).

Le cellule sono state poi fatte crescere in terreni con caratteristiche diffferenti.

3.3 Preparazione ed espressione di mg 535 con SeMet e mg 536

Mg 535 è stata fatta crescere seguendo il protocollo per la preparazione di un analogo strutturale della metionina, in proteine contenenti Selenio-Metionina, cui l'atomo di zolfo è sostituito da uno di selenio. Le caratteristiche biochimiche di metionina e selenio-metionina sono simili, tuttavia la seleniometionina radiomarcata (L Seleniometionina[75Se]), è rilevabile con maggiore facilità all'interno di un pattern di diffrazione in seguito al bombardamento con raggi X, facilitando il lavoro della ricorstruzione della

struttura tridimensionale. La coltura è stata portata avanti in un terreno 'povero' M9 minimal salt medium x5 contenente il 40 % di glucosio, 250 µL MgSO4 2M, 50 µL CaCl2 1 M, 500 µL FeSO4 4.2 g/l, 50 µL Tiamina 0.5% w/v, 500 µL di Ampicillina e Cloramfenicolo. Le colture sono state fatte crescere overnight a 37°C e successivamente inoculate al 5% in fiasche da 2L contenenti 500 mL di terreno della medesima composizione e stesso antibiotico, fatte crescere alla stessa temperatura con buona aereazione ed un'agitazione di 200rpm. Ad un OD di 0.5 (4.0 x 108 cellule/mL) sono stati aggiunti gli L-600 Amminoacidi: L-Lisina, L-fenilalanina, L-Treonina: 100 mg/L L-Isoleucina, L-Leucina, L-Valina: 50 mg/L e Selenio-Metionina: 50 mg/L in forma solida alla coltura, ed è stata abbassata la temperatura a 21°C. Dopo circa 30 minuti dall'inibizione della sintesi di Metionina, i batteri sono stati indotti con 0.2 mM di IPTG e lasciati

Esprimere overnight.I batteri contenenti il plasmide con mg 536 invece sono stati fati crescre nel terrenoricco 2YT (Difco) contentente 1mM di e 1 mM di cloramfenicolo a 37°C. Ampicillinae fatti crescere overnight. Il giorno seguente sono stati inoclulati i batteri dellaprecoltura al 2.5% e fatti crescere fino ad un OD di 0.6 e dopodiche indotti con6000.2 mM di IPTG e fatti esprimere ad una temperatura di 16°C.

223.4 Estrazione e Purificazione della ProteinaIl mattino seguente le colture sono state raccolte e messe a centrifugare a 6000 gper 10 minuti in modo da far precipitare tutto il pellet batterico contenente lanostra proteina d'interesse.La parte solida del centrifugato è stata successivamente risospesa in 85 mL di BufferA ( 50 mM Tris Hcl, 300 mM NaCl, pH 8.5) con aggiunta di 0.01% Lysozima e 0.01%di DNAse e tre tavolette di Anti Proteasi (Completa EPTA della Roche AppliedScience).I pellet risospesi sono stati sonicati alla potenza di 22 Watt con la procedura:

è stata fatta circolare la proteina, viene inseguito eluita con 20 volumi di colonna con un gradiente lineare di Imidazolocontenuto nel Buffer B (il buffer di eluizione: 50 mM tris Hcl, 300 mM NaCl, 1MImidazolo, pH 8.5) da 50 mM a 500 mM.

Questo tipo di separazione si basa sulla Ion Metal Affinity Chromatography dovel'His-Tag della nostra proteina, passando per l'His-trap contenente ioni Nichel dellacolonna di separazione, rimane intrappolata, lasciando passare tutte le altreproteine non ricombinanti prodotte da E.coli. Quando inizia ad aumentare la23concentrazione di Imidazolo contenuto nel buffer B attraverso la colonna la nostraproteina ricombinante inizia a staccarsi dalla 'trappola' in quanto l'Imidazolo neprende il posto, lasciando fuoriuscire il peptide.

3.6 SDS-PAGE

Per determinare l'effettivo peso molecolare e determinare il grado di purezza, èstata eseguita una corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide al 10% in presenzadi SDS

1. (Sodio Dodecil Solfato) . Questa tecnica permette di separare le proteine in base al loro peso molecolare e alla carica negativa conferita dal SDS (negatività e peso sono proporzionali). Come standard molecolare si è utilizzato il PageRuler Unstained Protein Ladder (Thermo Fisher Scientific). Si è andato a confrontare l'effettiva separazione della nostra proteina dal lisato, controllando che non ne sia eluita nei lavaggi al 2.5% e 5% di Buffer B durante l'eluizione. Dopo la corsa elettroforetica a 250 V il gel è stato messo a colorare con dello stainer a base di Coomassie colloidal staining overnight, prima di venire controllato.
2. Taglio His Tag, seconda purificazione e dissalatura
   Preparato il buffer per la rimozione del His tag all' N terminale (50 mM Tris, 300 mM NaCl, DTT 1mM pH 8.5, il cleavage buffer) si immette la proteina purificata in una membrana da dialisi (SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO, Thermo Scientific) con l'aggiunta di una 1

U di proteasi PreScission per l'His-tag, 'homemade' ricavata dal rhinovirus Umano. Lasciata agire overnight. Il mattino seguente la proteina e la membrana sono stati messi in una soluzione contenente il medesimo buffer di Cleavage ma senza DTT in modo da ridurne la concentrazione.

Controllato su gel l'effettivo taglio proteolitico del Tag, si rinietta la proteina nella colonna di purificazione della His-Trap, facendo attenzione di utilizzare la stessa colonna di purificazione in modo che l'esperienza sia riproducibile. In questo caso la nostra proteina eluirà per prima dalla colonna, dato che essendo priva del tag uscirà senza risentire dell'affinità con gli ioni nichel.

Raccolta la proteina dalla seconda purificazione si può eseguire un cambio di buffer, diminuendo la concentrazione di sali disciolti all'interno. Il desalting è stato eseguito su una colonna di dessalaggio Il Desalting (HiPrep 26/10 desalting, GE Healthcare).

24Buffer per mg 535 è composto da: 10 mM Tris Hcl e 150 mM NaCl a pH 8.5, mentre quello per mg 536 è composto da Caps 10 mM a pH 10.5.

3.8 Concentrazione Proteica

Le due purificazioni proteiche sono state concentrate con l'utilizzo di filtri Amicon® Ultra 15 mL con cutoff di 10KMW (MW mg 535: 31 kDa, MW mg 536: 42 kDa) fino al raggiungimento delle concentrazioni ottimali, controllate allo spettrofotometro a 280 nm e prestando attenzione a che non si formassero precipitati. Il primo lotto di mg 535, in SeMet, prodotto aveva una concentrazione di 0.6 mg/mL, mentre il primo lotto di mg 536 aveva un OD a 280 nm di 4,84 mg/mL. Sono stati successivamente fatti altri lotti per condurre i numerosi esperimenti di screen che sono stati necessari a trovare le condizioni ottimali di cristallizzazione.

3.9 Screening commerciali di cristallizzazione

Il processo di screening di cristallizzazione è stato sviluppato per i piccoli trial condotti nei laboratori accademici. Il concetto di

base è quella di combinare lo screening casuale di condizioni con lo screening sistematico nel minor numero di tentativi di cristallizzazione possibili. Lo screen è la combinazione migliore tra le varie combinazioni disponibili tra quelle raccolte dal Joint Center for Structural Genomics (JCSG). Il suo scopo è quello di massimizzare la copertura dei parametri di cristallizzazione senza alcuna ridondanza. Lo screen sistematico, con le sue varie condizioni di analisi, mira a testare le più svariate condizioni di cristallizzazione derivanti dall'analisi delle banche dati come PDB e permette all'operatore di iniziare il suo studio da una serie di reagenti che in passato sono stati responsabili della corretta formazione di cristalli di altre proteine. È un ottimo strumento di partenza per identificare il protocollo di cristallizzazione migliore. Tutti i reagenti utilizzati in questi screen sono noti per causare