Schemi genetica II - parte I

FUSIONE NON OMOLOGA DELLE ESTREMITÀ

Questo fenomeno si ha nel caso in cui si verifichi la rottura del doppio filamento e non si abbia una seconda copia di esso da utilizzare come stampo per la riparazione del danno (si verifica solo in G1).

Vengono richiamate delle proteine che si attaccano alle estremità rotte del DNA; il metodo di riparazione è:

1. Apertura del doppio filamento in entrambe le estremità
2. Ricerca ed appaiamento di sequenze complementari tra i filamenti singoli appena generati (grazie all'azione di una DNA ligasi)
3. Eliminazione di tutti quei nucleotidi che invece non sono stati appaiati
4. Rigenerazione del legame tra i filamenti.

Questo processo di riparazione porta all'eliminazione di nucleotidi, generando così la cosiddetta "impronta", che è fondamentale per ristabilire la continuità genomica.

Se tra gli elementi eliminati vi erano nucleotidi che partecipavano alla costituzione di un gene,

questo verrà perduto, generando così un disordine genico.

MODELLO FoSTeS (FORK STALLING AND TEMPLATE SWITCHING)

Meccanismo che si forma durante la replicazione del dna nel momento in cui la DNA polimerasi incontra una porzione danneggiata.

Questo enzima può continuare la replicazione a livello di un altro filamento stampo, situato nelle vicinanze, in cui sono presenti delle aree di microomologia (basi che sono simili): in questo modo by-passa la zona danneggiata.

Nello specifico:

• Quando incontra il danno passa a un altro filamento stampo per evitare l'interruzione della duplicazione del dna
• Poi torna a replicare il suo filamento saltando la porzione danneggiata.

Con questo meccanismo si possono determinare sia duplicazioni che delezioni di geni. Inoltre, in genere, questo meccanismo è causa di CNVs complesse: duplicazioni interrotte da delezioni.

La maggior parte dei riarrangiamenti genomici ha dei punti dirottura fissi, e questo è dovuto

1. Si utilizza una tecnica di ibridazione fluorescente per analizzare il DNA.

2. Si utilizzano sonde fluorescenti: se il DNA è normale, si avrà una colorazione rossa. Se il DNA è duplicato, si avrà una colorazione verde.

3. I DNA vengono fatti ibridare su un vetrino contenente metafasi e analizzati con un microscopio a fluorescenza.

4. Entrambi i DNA competono per l'ibridazione delle stesse zone di DNA.

5. I vetrini vengono successivamente analizzati al computer.

Si analizzano, per ciascun cromosoma, le zone duplicate o delete del DNA test.

Possono esserci 3 tipi di fluorescenza:

• Gialla: data dalla combinazione dei segnali verde e rosso. Questo dimostra che la quantità di DNA normale presente nel tessuto normale e nel tumore è equivalente. Non sono quindi riscontrabili né perdite né acquisto di materiale.
• Verde: data da una maggiore quantità di DNA tumorale che si lega a quella regione (dove risalta la fluorescenza verde). Nel tumore quella regione cromosomica è stata amplificata.
• Rossa: data dalla presenza di DNA normale.

Rossa: data dalla delezione del DNA tumorale.

In questa immagine vediamo:

• Nel cromosoma 12 il braccio è colorato in verde: in quel punto ho delle duplicazioni.
• Nel cromosoma 9 il braccio corto ha una fluorescenza più rossiccia: si ha una perdita di materiale nel DNA di destra.

Questo metodo è vantaggioso per analizzare il genoma, ma dipende dalla spiralizzazione del cromosoma e ha la stessa risoluzione dell'analisi del cariotipo (svantaggio).

Quindi, nella variazione del nostro genoma, esiste un bottino di alterazioni, che possono essere:

• Alterazioni del singolo nucleotide
• Piccole inserzioni o delezioni (polimorfismi) dei mini e microsatelliti
• Vere e proprie varianti cromosomiche

Ovviamente per poter diagnosticare queste singole variazioni sono necessari meccanismi diversi (FISH e Array-CGH).

La tecnica Array-CGH è stata "superata" dalla tecnica aCGH: Array-Based Comparative Genomic Hybridization.

In questa tecnica non si usano

intensità sia nel test che nel controllo.- Tutte le sonde spostate sulla linea dello 0,5: si ha una regione duplicata.- Tutte le sonde spostate sulla linea dello -0,5: si ha una regione deleta.Questa ibridazione è un'ibridazione di tipo competitivo: c'è un DNA da testare e uno di controllo che competono per legarsi alle sonde.Gli ultimi chip sviluppati si basano sull'ibridazione assoluta: riescono a identificare quante copie di una particolare regione cromosomica sono presenti in un particolare DNA, in base all'intensità della fluorescenza ottenute nelle singole zone del chip.Un ulteriore sviluppo è rappresentato da sonde polimorfe: SNP-Array:- Permettono di evidenziare regioni con particolari alterazioni cromosomiche- Hanno una risoluzione di 0,7 kb.- Su un singolo chip si possono studiare circa 1,8 milioni di SNPs e oligonucleotidi che coprono regioni povere di SNPs combinati insieme.ORGANIZZAZIONE DI UN CHIP CHE PERMETTE

Gli Array-CGH convenzionali sono poco sensibili ai mosaicismi: la condizione di mosaicismo risulta visibile solo se è intorno al 30%, mentre gli SNP Array sono più sensibili al mosaicismo.

Gli SNP Array, a differenza degli Array-CGH tradizionali, riescono ad identificare le zone di omozigosi nel genoma, che nei bambini possono essere legate alla presenza di trisomie.

COSA SI PUO' VEDERE CON QUESTE TECNICHE

Specialmente in ambito prenatale e pediatrico.

L'indagine più frequente, nel caso di pazienti che soffrono di ritardi mentali o malformazioni, è quella del cariotipo. Quando il quadro clinico non è chiaro viene usata la FISH, con la quale si può avere una diagnosi del 5-10% dei casi di ritardo mentale. Se si usa l'Array-CGH si arriva ad una diagnosi del 30% dei casi.

ESEMPI

1) Ragazzo di 11 anni con facies dismorfica:

• sopracciglia folte
• labbra voluminose
• naso bulboso
• orecchie con impianto basso

Presenta:

• Epilessia
lungo- una delezione di 1,5 Mb nella regione subtelomerica del braccio corto.

corto- una delezione di 8 Mb sul braccio lungo4) Bambina di 13 anni; presenta- Autismo- Ritardo mentaleCon gli Array si è definita- una traslocazione bilanciata- una delezione al braccio corto del cromosoma 12:probabile responsabile del fenotipo- microduplicazione di 367 kb nella porzionesottocentromerica del cromosoma 22.5) Ragazzo di 16 anni; presenta- Retinite pigmentosa: deposito di pigmenti sulla retina.- Riduzione progressiva della vista a partire dai 9 anni- Ritardo mentale- Disturbi neurologiciIl cariotipo risulta normale.Attraverso la tecnica Array è stata individuata una delezione di1.7Mb, insorta de novo e localizzata sul braccio corto del cromosoma16.La sindro