Genetica - Schemi

Genetica

Esperimenti e Scoperte

• Avery, MacLeod e McCarty: ricerca della molecola informazionale (batteri IIR e IIIS)
• Hershey, Chase: ricerca della molecola informazionale (E. Coli e Fago T2)
• Meselson, Stahl: scoperta del modello di replicazione del DNA
• Chambon: scoperta delle sequenze introniche ed esoniche
• Test di fluttuazione (Luria, Delbrück): ricerca dello scenario delle mutazioni
• Test di replica plating (coniugi Lederberg): ricerca dello scenario delle mutazioni
• Cairns: ricerca dello scenario delle mutazioni
• Lederberg, Tatum: scoperta del meccanismo di coniugazione batterica
• Jacob e Monod: scoperta degli enzimi inducibili ed elaborazione del modello dell’operone
• Ingegneria genetica: meccanismo di formazione della “chimera” molecolare

CdL in Scienze Biologiche

Genetica

Esperimenti e Scoperte

• Avery, MacLeod e McCarty: ricerca della molecola informazionale (batteri IIR e IIIS)
• Hershey, Chase: ricerca della molecola informazionale (E. Coli e Fago T2)
• Meselson, Stahl: scoperta del modello di replicazione del DNA
• Chambon: scoperta delle sequenze introniche ed esoniche
• Test di fluttuazione (Luria, Delbrück): ricerca dello scenario delle mutazioni
• Test di replica plating (coniugi Lederberg): ricerca dello scenario delle mutazioni
• Cairns: ricerca dello scenario delle mutazioni
• Lederberg, Tatum: scoperta del meccanismo di coniugazione batterica
• Jacob e Monod: scoperta degli enzimi inducibili ed elaborazione del modello dell'operone
• Ingegneria genetica: meccanismo di formazione della “chimera” molecolare

CdL in Scienze Biologiche

Avery, McCarthy, Leod (1942)

Batteri III_R: ʘ -> si nicnesi nel topoIIIS -> ☠ -> †(experimento di Griscith)

Cercare il p. trasformante

III_S -> ʘ, d.c.:1. -> solo III_S †2. -> III_S + estr. + estr. + esta DNA ☺3. -> III_S + estr. DNA †4. -> III_S + l ipid.5. -> III_S + c e st.dna.6. -> III_S + d.prot.di(enzimi che degradano)

DNA o RNA?

III_S -> 2 ʘ, d.c:1. -> III_S + RNA_se2. -> III_S + DNA_se

N.B.Le proteasi viste non degradano completamente le proteine, di conseguenza questi esperimenti non confermano che fosse il DNA il p. trasf.

Hersey, Chase (1952)

Proteine

• Carbonio (C)
• Ossigeno (O)
• Idrogeno (H)
• Azoto (N)
• Zolfo (S*)

A. Nucleico

• Carbonio (C)
• Ossigeno (O)
• Idrogeno (H)
• Azoto (N)
• Fosforo (P*)

• Uso del Fosforo e dello Zolfo marcati radioattivamente (³²P, ³⁵S)
• Uso del Fago T2

E. Coli. Sensibili al T2

Il P^* si inserisce nel DNA

+T₂

DNA marcato

E. Coli

Ingresso del DNA marcato

+T₂

Progenie fagica radioattiva

Dimostra che il DNA è le molecole informazionali

Lo S^* si inserisce nelle proteine

+T₂

Proteine marcate

E. Coli

Proteine fuori delle cellule

+T₂

Progenie fagica normale

Dimostra che le proteine non sono le molecole informazionali

Meselson, Stahl (1953)

E. Coli

• Azoto 15 (azoto pesante)
• Azoto 14 (azoto stabile)

Ultracentrifugazione → cesura di un gradiente

Esperimento di controllo

E. Coli:

• + Azoto 15 (N*) → DNA* (DNA pesante) → ultra.

E. Coli:

• + Azoto 14 (N) → DNA (DNA normale)

E. Coli + N* → DNA*

L + N → una sola (replicazione → DNA e DNA*)

1. Modello Conservativo
2. Modello Semi-cons.
3. Modello dispersivo

Form. come risultato una sola banda, si può quindi escludere il modello conservativo

E. Coli delle prime fasi del esperimento (DNA + DNA*)

• + Azoto 14 (N) (eteron)

• 2 scenari:

1. Modello semi-cons.
2. Modello dispersivo

Form. come risultato due bande, confermando il modello semi-conservativo come modello di replicazione

A.M.

Chambon

- Dalle osservazioni al microscopio si descrive che l'mRNA citoplasmatico è più corto di quello nel nucleo.

- Parte dal presupposto che nel mRNA nucleare vi siano regioni che non sono presenti nel mRNA citoplasmatico.

- Ottiene il cDNA citoplasmatico tramite la trascrittasi inversa:

mRNA citoplasmatico - TRASC. INVERSA -> cDNA citoplasmatico (identico all'mRNA cit.)

- Dall'appaiamento con il messaggero nucleare si possono ottenere tre scenari:

1. Nessuna regione 'in più'
2. Regioni 'in più' all'inizio e/o alla fine

_{cDNA cit.}

^{mRNA nuc.}

3. Region 'in più' nel mezzo

_{Formazione di una bolla}

^{mRNA nuc.}

^{cDNA cit.}

- Ottiene numerose bolle andando a confermare la presenza di regioni 'in più' posizionate nel filamento dell'mRNA nucleare, che avranno saltoni tra codificanti.

_Introni^Esomi

^{mRNA nuc.cDNA cit.}

A.M.

Test di Fluttuazione (Luria-Delbruck)

• 4.1. da determinare se le mut. sono pre-ad. o post-ad.
• 5. consider. la frequenza di mutanti passa a 1/10⁶

Esperimento di controllo

* schema boccia

Si possono avere due scenari:

• Mut. pre-ad. -> I mutanti sono dovuti apparire nelle piastre -> Stesso numero di mutanti in ogni piastra
• Mut. post-ad. -> Stesso processo adattativo -> Stesso numero di mutanti in ogni piastra

Il confronto di controllo serve solo a determinare il numero di mutanti in ogni piastra

Esperimento di verifica

* schema boccia + stessa boccia

Si possono avere due scenari:

• Mut. post-ad. -> Stesse cond del controllo -> Stesso numero di mut del controllo
• Mut. pre-ad. -> Diverso livello di mut in ogni piastra in quanto le mutazioni sono variabili nel tempo

Dall'esperimento di verifica risultarono numeri diversi di mutanti nelle piasche.

Mutanti precoci: saranno più numerosi dei mutanti tardivi.

L'esperimento suggerisce la selezione per adattamento ma non la dimostra.

A.M.

Test di replica plating (Cairns e Lederberg, 1952)

• Metà di comprendere lo scenario delle mutazioni
• Piastra Madre
• Colonie batteriche sensibili al T₂
• Cilindro con feltrini sterile
• Stessa posizione delle P.M.

Molteplici repliche delle P.M. tramite il cilindro dermano due scenari:

• Si suppone che le colonie controllo si mutano solamente dopo essere al T₂
• Sopravvive sempre solo le colonie controllo
• Possono sopravvivere anche le altre colonie
• Da come risultava sempre la sopravvivenza delle colonie controllo
• Porta alla sola considerazione dello scenario pre-adattamento

A.M.

Esperimento di Luria (1952)

Sospetti: agente selettivo

Aliquota 1

Aliquota 2

(= equivalenti)

Terrore 1

Presenza selettiva

Terrore 2

Nessun agente selettivo

• Se le mutazioni fossero solo di tipo pre-ad. si riscontra lo stesso numero di mutanti in ogni teorema.
• Rams troverebbe sempre che molte delle colture senza rischio selettivo sono di più che meno a quelle dell’altra colture.

Scape maggiore

• Dall’esperienza caleb che i due seni: non si ausestiado a vicendo ma possiero auxilisse nello stesso momento

A.M.

Lederberg - Tatum

• Uso di due ceppi batterici:

Ceppo A

• His-
• Bio-
• Thr+
• Leu+
• Tiù+

Ceppo B

• His+
• Bio+
• Thr-
• Leu-
• Tiù-

(+= prototrofo per...)

TerrenoHis- Leu- Tiù-(t. min.)

Parte I

1. • A
2. • T. min.
   • Nessuna colonia
3. • A + B
4. • T. min.
   • Alcune colonie

L'acquisizione di nuove colonie era dovuta ad uno scambio di DNA fra A e B (ovvio)

Parte II

1. A
2. B

Tubo di Davis

Film poroso

I ceppi A e B possono scambiare nutrienti ma non possono toccarsi

T. min.

Nessuna colonia

Ese. di controllo

A

B

I ceppi A e B possono entrare in contatto

T. min.

Numerose colonie

Scoperta del plus sessuale e del fattore F

Il contatto è necessario.

A. M.

Jacob e Monod (1950-1960)

Scoperta degli enzimi inducibili

1. Escherichia coli: fonte di energia = glucosio
   • In assenza di glucosio: lattosio (presenza delle β-galattosidasi)
2. Semina di E. Coli su terreno minimo e glucosio (HM + glu.)
   • Bassa attività enzimatica delle β-g (stimoli basale)
3. Semina di E. Coli su terreno minimo e lattosio (HM + lat.)
   • Picco dell'attività enzimatica delle β-g
4. Aggiunta del glucosio al terreno minimo con solo lattosio (HM + glu. + lat.)
   • Lieve mantenimento del picco dell'attività enzimatica e successivo decadimento (bisogno di rimozione dell'enzima)

• L'esperimento dimostra che la β-galattosidasi è un enzima inducibile
• Dimostra che il solo lattosio è una condizione necessaria ma non sufficiente, oltre alla regolazione dell'enzima deve essere presente anche il glucosio

Jacob e Monod (1950-1960)

• Sequenza codificante il repressore e seq. d’attivaz

  • Coniugazione fra una cellula F^- ed una cellula F^' per esporre l’ansioso

    • Formazione di un diploide parziale

    EcoI EcoO EcoZ EcoY CapA

    F^{- (x=mutazione)}

  • F^'

• In presenza di lattosio:

  • 2 scenari possibili:
  • → EcoI codifica R_i che si lega a EcoO (R= repressor)
  • → EcoO codifica R_i che si lega a EcoI

EcoI codifica R

EcoI O Z Y A

_latt. X

EcoI O Z Y A

X

Entrambi i sistemi sono aperti

Non si trovano similari unici ai fini dell’esperimento

• In assenza di lattosio:

  • 2 scenari possibili:
  • → EcoI codifica R_i che si lega a EcoO
  • → EcoO codifica R_i che si lega a EcoI

EcoI codifica R

EcoI O Z Y A

X X R

EcoI O Z Y A

X

Solo uno dei due sistemi è aperto

• Si dimostra solamente che Rⁱ si lega a EcoO non si dimostra che sia EcoI a modificare R

Jacob e Monod (1959-1960)

Dimostrazione della codifica di R a carico di Bac I

• Coniugazione tra una cellula F⁺ ed una cellula F⁻
• Formazione di un diploide parziale per rigenerazione batterico

Bac I | Bac O | Bac Z | Bac Y | Bac A

Bac I | Bac O | Bac Z | Bac Y | Bac A

• In presenza di lattosio

• 2 scenari possibili: → Bac I codifica R
• → Bac O codifica R

Bac I codifica R

Bac I | O | Z | Y | A

X X X ↓ ↓ ↓

→ → →

Bac O codifica R

Bac I | O | Z | Y | A

→ → → ↓ ↓ ↓

X X X

Entrambi: I sistemi sono aperti;

Entrambi: I sistemi sono aperti;

Non si trovano risultati utili ai fini dell'esperimento.

• In assenza di lattosio

• 2 scenari possibili: → Bac I codifica R
• → Bac O codifica R

Bac I codifica R

Bac I | O | Z | Y | A

X X X ↓ ↓ ↓

→ → →

Bac O codifica R

Bac I | O | Z | Y | A

→ → → ↓ ↓ ↓

X X X

Nessun enzima prodotto

Prodotti gli enzimi "normali" ed una mutata

Dal segno indietro con vera trovato alcune stimati andati a dimostrare lo schema 1 (+ origini) e dimostrando che Bac I codifica R e aperti.

Ingegneria Genetica, formazione delle "chimere"

1. Taglio del plasmide con gli e. d. restrizione (ad es BamHI)

• Il taglio è volto alla linearizzazione del plasmide
• Il controllo del taglio viene fatto tramite l'elettroforesi su gel di agaroso.
• I plasmidi lineari sono più lenti di plasmidi superavvolti o circolari

2. Taglio del DNA passeggero con l'enzima di restrizione (ad es BamHI)

• Formazione di numerosi frammenti

3. Intervento delle ligasi che saldano i frammenti: ne risulterà uno scambio a caso

4. Separazione mediante cellule competenti dei vettori da plasmidi ricombinanti

5. Separazione mediante antibiotico delle cellule contenenti il vettore dalle cellulecontenenti il plasmide ricombinante

• Semina delle cellule su piastre contenenti ampicillina per isolare cellule contenentiun plasmide o un vettore (5.1)
• Replica plating con ampicillina e tetraciclina per riconoscere le cellule contenenti ilplasmide ricombinante (5.2)

(5.1) -> (5.2)

• O contenenti un vettore
• * p.s.i.c.
• *¹ contenenti p.s.i.c.

T. con ampicillina -> T. con ampicillina e

(S2)

Plasmide Madre

Copia 1

T. con ampl. e tetraciclina

T. con ampl. e tetr.

Dalla piastra madre si:

Coltivo le colonie mancanti antibiotico

Nota

Le cellule ricombinanti vengono uccise perché per produrre l'ingresso del DNA esogeno interrompe il gene responsabile della tetr., ma non quello della amp.

Genetica

Fago λ

Ciclo litico e lisogeno

• Schema del meccanismo di regolazione dell'espressione dei geni necessari all'ingresso in una o l'altra via

CdL in Scienze Biologiche

Anno Accademico 2019-2020

Fago λ, via litica e lisogena

1. Enzima nelle cellule e caratterizzazione
2. Espressione dei geni nella precoce: Cro e N

Vià litica

• ↑[Cro]
• ↓[cAMP] → Le proteasi degradano cII
• → ↑[Cro] → maggior produzione del repressore Cro (∞)

Vià lisogena

• ↓[Cro]
• ↑[cAMP] → cAMP e cIII schermo cII
• → cII promuove la trascrizione di cI → produzione del repressore cI (∞)

A.M.