Metodi strumentali in chimica analitica - Argomenti essenziali

METODI IFENATI CON MS

L’analisi di miscele complesse generalmente richiede l’accoppiamento tra le tecniche

separative e la Spettrometria di Massa. Si parla pertanto di metodi “ifenati” (dall’inglese

“hyphen”, ovvero “trattino”), cioè di metodi accoppiati.

Le tecniche ifenate più importanti sono la GC-MS, l’LC-MS, la SFC-MS, la CE-MS e la FFF-MS.

A prescindere dal tipo di tecnica separativa, l’accoppiamento aggiunge sempre una

dimensione addizionale alla misura analitica.

CROMATOGRAMMA IONICO

Il cromatogramma ionico è una rappresentazione grafica dei dati ottenuti in un'analisi di

Spettrometria di Massa combinata con una tecnica separativa, come ad esempio la

Cromatografia Liquida (LC-MS). In sostanza, descrive come gli ioni vengono rilevati nel tempo,

mostrando l'intensità del segnale ionico in funzione del tempo di ritenzione (o del volume di

eluizione) durante la separazione cromatografica.

Le tre dimensioni della Cromatografia-Spettrometria di Massa sono il tempo di ritenzione,

l’intensità ed il valore m/z. Ogni composto che eluisce dalla colonna cromatografica è

caratterizzato dal suo spettro di massa. La somma delle intensità dei picchi di uno spettro di

massa a ogni valore di tempo di ritenzione è usata per costruire il cromatogramma ionico.

TECNICA LC-MS

La tecnica che accoppia la Cromatografia Liquida (LC) con la Spettrometria di Massa (MS) è

nota come tecnica LC-MS. Essa accoppia la separazione cromatografica degli analiti di un

campione liquido con l’identificazione quantitativa e qualitativa tramite MS.

Tale tecnica è molto potente e versatile, ma presenta un problema di compatibilità fra le due

tecniche da cui è composta, in quanto:

• La Cromatografia Liquida si applica a campioni liquidi poco volatili sotto pressione

• La Spettrometria di Massa si applica a campioni gassosi ionizzati in condizioni di alto

vuoto

Pertanto, il cuore della tecnica ifenata è costituita dall’interfaccia LC-MS, che ha il compito di

trasferire i composti separati dalla Cromatografia Liquida (che è basata su una fase liquida)

alla Spettrometria di Massa (che opera in condizioni di gas e vuoto). Tecniche comuni

impiegate nell’interfaccia LC-MS includono l’Electrospray Ionization (ESI), l’Atmospheric

Pressure Chemical Ionization (APCI), l’Atmospheric Pressure Photoionization (APPI) e la

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI).

SORGENTI DI IONIZZAZIONE IN MS

Il primo requisito necessario per analizzare campioni tramite MS è che gli analiti devono essere

in fase gassosa e ionizzati. Pertanto, il primo modulo di uno spettrometro di massa è

costituito da una sorgente di ionizzazione, che permette di introdurre il campione, sottoforma

di gas ionizzato, all’interno dell’analizzatore di massa.

Le sorgenti di ionizzazione possono in primo luogo essere classificate in base allo stato fisico

del campione in:

• Sorgenti in fase gassosa: ionizzano analiti in fase gassosa

• Sorgenti a desorbimento: ionizzano analiti in fase condensata (liquida o solida)

Generalmente, gli spettrometri con sorgenti di ionizzazione in fase gassosa sono accoppiati

con un sistema GC (per campioni volatili, a basso PM, termostabili e non polari), mentre quelli

con una sorgente di ionizzazione a desorbimento possono essere accoppiati con un sistema

HPLC (per campioni non volatili e polari).

Un’ulteriore classificazione delle sorgenti di ionizzazione prevede di distinguerle in base

all’energia impartita al campione durante il processo di ionizzazione; in particolare, si

distinguono:

• Sorgenti di ionizzazione hard, che producono tanti piccoli frammenti, corrispondenti

a radicali cationi ad alta energia

• Sorgenti di ionizzazione soft, che producono pochi frammenti grandi, corrispondenti

ad addotti molecolari a bassa energia

Le tecniche hard permettono di ottenere informazioni strutturali sul campione, mentre le

tecniche soft sono adatte per la determinazione dei pesi molecolari; per ottenere le

informazioni strutturali con tecniche soft, è necessario ricorrere alla tecnica MS/MS.

L'analita può venire ionizzato secondo varie tecniche: l'espulsione di elettroni, la

protonazione, la deprotonazione, la cationizzazione. Con l'espulsione di elettroni si genera

uno ione-radicale, specie molto instabile che può subire facilmente frammentazione, mentre

con la protonazione e deprotonazione si genera uno ione pseudo-molecolare. La massa del

composto è semplice da rilevare a partire dal rapporto m/z perché nella maggior parte dei casi

la carica dello ione è unitaria positiva (+1).

Sorgente di Classificazione per Classificazione Tipologia di analiti

ionizzazione stato fisico hard/soft

Ionizzazione Sorgente in fase Analiti a basso PM e

Ionizzazione hard

Elettronica (EI) gassosa volatili

Ionizzazione Sorgente in fase Analiti a PM medio

Ionizzazione soft

Chimica (CI) gassosa termicamente stabili

Ionizzazione Sorgente a Ionizzazione soft Campioni biologici

elettrospray (ESI) desorbimento

Ionizzazione Campioni biologici a

Sorgente in fase

Chimica a Pressione Ionizzazione soft bassa e media

gassosa (ambiente)

Atmosferica (APCI) polarità

Fotoionizzazione a Sorgente in fase Analiti apolari o poco

Pressione Ionizzazione soft

gassosa (ambiente) polari

Atmosferica (APPI)

Desorbimento/

Ionizzazione Laser Sorgente a Campioni biologici

Ionizzazione soft

Assistita da Matrice desorbimento ad alto PM

(MALDI)

Ionizzazione Sorgente a Campioni in fase

Elettrospray per desorbimento Ionizzazione soft condensata

Desorbimento (DESI) (ambiente) Campioni in fase

Sorgente a

Analisi Diretta in solida, liquida o

desorbimento Ionizzazione soft

Tempo Reale (DART) gassosa con poco

(ambiente) pre-trattamento

IONIZZAZIONE ELETTRONICA (EI)

La Ionizzazione Elettronica (EI, “Electronic Ionization”) è la tecnica di ionizzazione più nota.

Si tratta di una tecnica di ionizzazione hard che, grazie all’alta energia, oltre a ionizzare il

campione (come radicale catione) ne provoca anche la frammentazione. Si tratta del metodo

di ionizzazione più diffuso accoppiato alla Gas-Cromatografia (GC), in quanto è una sorgente

di ionizzazione in fase gassosa.

Le molecole in uscita dal gascromatografo, dunque allo stato gassoso, entrano all’interno

della camera di ionizzazione ad alto vuoto. L’energia necessaria per la ionizzazione è fornita

da un fascio di elettroni (accelerato con una tensione di 70 eV) generato da un filamento

incandescente (generalmente, in renio o tungsteno).

IONIZZAZIONE CHIMICA (CI)

La Ionizzazione Chimica (CI, “Chemical Ionization”) è una tecnica di ionizzazione soft che

lavora in fase gassosa. È adatta all’analisi di molecole termicamente stabili, con PM medio.

Poiché produce meno frammentazione rispetto all’EI, preserva meglio la struttura molecolare,

ed è per questo generalmente adatta alla determinazione dei PM.

La tecnica prevede inizialmente di utilizzare la ionizzazione elettronica per generare ioni di gas

reagenti (quali metano, isobutano o ammoniaca). Tali ioni gassosi, a loro volta, permettono di

ionizzare il campione tramite reazioni chimiche di trasferimento di carica, cattura elettronica

e reazioni acido-base.

IONIZZAZIONE ELETTROSPRAY (ESI)

La Ionizzazione Elettrospray (ESI, “Electrospray Ionization”) è la tecnica di ionizzazione più

comunemente impiegata come interfaccia LC-MS, ed è pertanto adatta per l’analisi di

campioni in fase condensata. Si tratta inoltre di una sorgente di ionizzazione soft che lavora

a pressione ambiente. La formazione degli ioni in ESI avviene generalmente tramite

protonazione (singola o multipla) degli analiti.

MECCANISMO DI FUNZIONAMENTO DELL’ESI

La camera di ionizzazione è detta “camera di nebulizzazione”, e si trova a pressione

atmosferica. In essa, il campione viene introdotto tramite un capillare che contiene l’eluato

in uscita dall’HPLC. Il campione condensato viene nebulizzato dalla punta del capillare e

diretto verso il capillare di desolvatazione, che indirizza il campione gassoso ionizzato verso

l’analizzatore ad alto vuoto dello spettrometro di massa.

Spesso, si impiega un’interfaccia ESI pneumaticamente assistita, che sfrutta un flusso

coassiale di un gas inerte attorno al capillare di nebulizzazione per favorire

l’elettronebulizzazione. L’assistenza di un flusso di gas di nebulizzazione consente l’impiego

di flussi di liquido più elevati ed una ridotta dipendenza dalla tensione superficiale del

solvente.

Fra la punta del capillare e l’ingresso del capillare di desolvatazione è applicata un’elevata

tensione, che permette di applicare un intenso campo elettrico al campione in ingresso. Tale

campo elettrico elevato è responsabile della formazione del cono di Taylor, ovvero del

menisco con deformazione conica, la cui generazione è dovuta alla separazione di carica della

soluzione elettrolitica indotta dal campo elettrico, in quanto tale forza di separazione supera

la tensione superficiale dell’eluato.

Dal cono di Taylor fuoriescono dunque piccole goccioline di dimensione uniforme contenenti

ioni. In controcorrente rispetto al campione, fluisce inoltre un gas di desolvatazione

riscaldato (generalmente, azoto), che favorisce la desolvatazione delle goccioline cariche.

La desolvatazione provoca la diminuzione delle dimensioni delle goccioline, finché le forze

elettrostatiche di repulsione fra gli ioni contenuti in esse non superano le forze di coesione

(limite di Rayleigh), provocando la disintegrazione delle goccioline in goccioline sempre più

piccole, fino all’ottenimento di ioni carichi in fase gassosa. Tale processo è noto come

“fissione coulombiana”.

Infine, gli ioni gassosi entrano in una prima zona a pressione ridotta dove vengono raffreddati

per espansione adiabatica e poi focalizzati da uno skimmer, un elettrodo conico con una

piccola apertura centrale che invia soltanto una piccola percentuale di ioni verso la zona ad

alto vuoto dell’analizzatore di massa.

MECCANISMO DI IONIZZAZIONE

Per spiegare come, nella tecnica ESI, le molecole passino dalla fase liquida (in soluzione) alla

fase gassosa (come ioni), sono stati proposti due modelli teorici:

Modello della carica residua (CRM, “Charged Residue Model”): Secondo questo

• modello, la soluzione viene nebulizzata formando piccole gocce cariche. Queste gocce

evaporano gradualmente, riducendosi sempre di più di volume. Alla fine, il solvente

evapora del tutto, lasciando dietro di sé un "residuo" che contiene l'analita con le

ca