Metodi Strumentali in Chimica Analitica

TECNICA LC-MS

La Cromatografia Liquida (HPLC/UHPLC) è adatta all’analisi di analiti troppo poco volatili per

essere separati in Gas Cromatografia, mentre la Spettrometria di Massa è applicabile solo ad

analiti volatili. I flussi di liquido tipicamente impiegati in HPLC, se vaporizzati, corrispondono a

flussi di gas assolutamente non gestibili dai sistemi da vuoto degli spettrometri di massa.

Si è reso pertanto necessario sviluppare interfacce in grado di trasferire in fase gassosa

(aerosol) la fase mobile HPLC e gli analiti in essa disciolti e, successivamente, trasferire parte

di tale fase gassosa, arricchita in analita, all’interno dello spettrometro di massa. Le più

comuni interfacce sono le sorgenti ioniche ESI, APCI, APPI e MALDI. In LC-MS, le molecole

neutre possono essere caricate (producendo cationi in modalità ione positivo o anioni in

modalità ione negativo) in diversi modi, a seconda dell'interfaccia di ionizzazione selezionata.

215

SORGENTI DI IONIZZAZIONE

Le miscele complesse, prima di essere analizzate tramite Spettroscopia di Massa, vengono

sottoposte a una procedura di separazione. In particolare:

• Molecole volatili, a basso PM, termostabili e non polari vengono sottoposte alla Gas

Cromatografia (GC)

• Molecole non volatili e polari (quali le biomolecole) vengono sottoposte alla

Cromatografia Liquida (HPLC/UHPLC)

La ionizzazione è il processo mediante il quale gli elettroni vengono rimossi o aggiunti ad atomi

o molecole per produrre ioni. Vi è una grande varietà di tecniche di ionizzazione impiegabili in

MS, che differiscono per le molteplici applicazioni ed il tipo di analiti, che si diversificano nella

loro massa ed il loro stato fisico (molecole, atomi, gas, liquidi, solidi). All’interno del corso,

faremo un’introduzione generale delle sorgenti ioniche e tratteremo solo alcune nel dettaglio,

adatte alla ionizzazione di molecole organiche.

Nella sorgente dello spettrometro di massa, avviene la ionizzazione. Le sorgenti ioniche

possono essere classificate in base allo stato fisico del campione come “sorgenti in fase

gassosa” (se l’analita è in fase gassosa) o “sorgenti a desorbimento” (se in fase condensata).

Le sorgenti in fase gassosa (che ionizzano analiti già in fase gassosa) sono:

• Ionizzazione Elettronica (EI)

• Ionizzazione Chimica (CI)

• Ionizzazione Chimica a Pressione Atmosferica (APCI)

• Fotoionizzazione a Pressione Atmosferica (APPI)

Le sorgenti a desorbimento (che ionizzano analiti in fase condensata) comprendono:

• Ionizzazione Elettrospray (ESI)

• Desorbimento/Ionizzazione Laser Assistito da Matrice (MALDI)

• Ionizzazione Diretta (Ambient MS)

Le sorgenti ioniche possono inoltre essere distinte in base all’energia depositata nello ione, e

si parla pertanto di “ionizzazione di tipo soft” o “ionizzazione di tipo hard”: le tecniche di

ionizzazione soft (quali CI, ESI, APCI e MALDI) producono pochi frammenti nello spettro,

corrispondenti ad addotti molecolari a bassa energia; al contrario, le tecniche di ionizzazione

hard (quali l’EI) producono molti piccoli frammenti, corrispondenti a radicali cationi ad alta

energia. 216

Classe di tecnica di Stato fisico del

Tecniche di ionizzazione

ionizzazione campione

Ionizzazione elettronica EI (Electron Ionization) Gas o vapore

CI (Chemical Ionization)

DCI (Desorption Chemical Ionization)

Ionizzazione chimica Gas o vapore

APCI (Atmospheric Pressure Chemical

Ionization)

FAB (Fast-Atom Bombardment)

SIMS (Secondary-Ion MS)

Ionizzazione per FD (Field Desorption) Liquido o solido

desorbimento PB (Plasma Desorption)

MALDI (Matrix-Assisted Laser

Desorption/Ionization)

Ionizzazione per TSI (Thermospray Ionization) Liquido o solido

nebulizzazione ESI (Electrospray Ionization)

Si comprende dunque che le più comuni sorgenti ioniche in GC-MS sono la Ionizzazione ad

Impatto Elettronico (EI) e la Ionizzazione Chimica (CI), mentre per le sorgenti ioniche in LC-

MS più comuni sono la Ionizzazione Elettrospray (ESI), la Ionizzazione Chimica a Pressione

Atmosferica (APCI) e la Ionizzazione/Desorbimento Laser Assistita da Matrice (MALDI).

Nel diagramma, sono riportate le diverse tecniche di MS per diverse esigenze, organizzate in

base ai principali campi di applicazione e al carattere “hard” o “soft” della ionizzazione. 217

Vediamo in dettaglio quali sono le sorgenti di ionizzazione più adatte l’analisi di campioni in

soluzione a seconda del peso molecolare e della polarità degli analiti presenti nella miscela:

APCI & APPI

ESI (ElectroSpray Ionization) (Atmospheric Pressure CI &

PhotoIonization)

•

• Richiedono una certa volatilità

Volatilità del campione non •

necessaria L’analita dev’essere termicamente

• stabile

Tecnica preferita per gli analiti •

termicamente labili Ioni formati in fase gassosa

• •

Ioni formati in soluzione (es. Adatte a composti con PM e polarità

catecolammine, coniugati di solfati, intermedi (es. PAH, PCB, acidi grassi,

ammine quaternarie) ftalati, alcoli)

• •

Adatta a composti contenenti Adatte a composti contenenti

eteroatomi (quali carbammati e eteroatomi (quali carbammati e

benzodiazepine) benzodiazepine)

• •

Adatta a composti che moltiplicano Adatte a composti troppo poco

la carica in soluzione (es. proteine, polari per una risposta ESI

peptidi, oligonucleotidi) • Formano soltanto ioni a carica

• Può formare ioni a carica multipla singola

Le tipologie di ioni prodotte dai diversi metodi di ionizzazione sono i seguenti:

Fascio di elettroni

− +• − Radicale catione con alta energia – molti

+ → + 2

frammenti nello spettro

Gas: CI

Scarica corona: APCI

Campo elettrico: ESI

+ +

[

+ → + ] Fotoni: MALDI, APPI

+ −

[

− → − ] Addotti molecolari a bassa energia –

nessuno o pochi frammenti nello spettro

+ +

[

+ → + ] Campo elettrico: ESI

+ −

[

− → − ] 218

Ionizzazione Elettrospray (ESI)

La Ionizzazione Elettrospray (elettronebulizzazione), abbreviata “ESI”, è la più diffusa fra le

tecniche di ionizzazione che operano a pressione atmosferica. ESI e MALDI hanno consentito

l’estensione delle procedure analitiche basate sulla Spettrometria di Massa nei settori della

biologia e delle scienze biomediche (analisi di acidi nucleici e proteine) per la possibilità di

analizzare molecole di massa elevata.

ESI è una tecnica di ionizzazione soft che permette il trasferimento di ioni dalla soluzione alla

fase gassosa. In ESI, la soluzione consiste in un solvente volatile contenente l’analita ionico

a concentrazioni molto basse (10 -10 M). Il trasferimento degli ioni dalla fase condensata allo

-6 -4

stato di ioni isolati in fase gassosa inizia a pressione atmosferica e procede gradualmente

verso l’alto vuoto dell’analizzatore. In ESI, la ionizzazione avviene a

temperatura e pressioni atmosferiche, ed

è il metodo di elezione per l’accoppiamento

fra la Cromatografia Liquida e la

Spettrometria di Massa (LC-MS). L'eluato

LC viene nebulizzato in una camera di

nebulizzazione a pressione atmosferica in

presenza di un forte campo elettrostatico

e di un gas di desolvatazione riscaldato. Il

campo elettrostatico si genera tra il

nebulizzatore (a terra, in questa specifica

configurazione) e il capillare di

desolvatazione (ad alta tensione). 219

In ESI possono essere ionizzate molecole di piccole dimensioni polari (che generano spesso

ioni a carica singola), complessi metallici ionici e altri analiti inorganici solubili e

biomolecole di grandi dimensioni, come proteine e oligonucleotidi (che generano spesso

ioni multicarica).

Nella tecnica ESI, la formazione di cariche multiple è il fenomeno che rende possibile l'analisi

di molecole di dimensioni maggiori. La formazione di ioni a carica multipla abbatte la scala di

masse dividendo per il numero di cariche, spostando quindi gli ioni in un intervallo di m/z

accessibile per la maggior parte degli analizzatori.

STRUMENTAZIONE PER ESI

Nella tecnica ESI, la soluzione del campione viene pompata attraverso un ago capillare di

acciaio inossidabile (nebulizzatore) ad una velocità di pochi microlitri al minuto. L’ago viene

mantenuto a vari kV rispetto ad un elettrodo cilindrico che circonda l’ago di nebulizzazione. Lo

spray carico delle goccioline si espande in un flusso controcorrente di azoto riscaldato. Una

piccola frazione del materiale nebulizzato entra nel capillare desolvatante.

Il grosso del gas che si espande dall’aerosol che si desolvata viene allontanato da una pompa

a vuoto all’uscita del capillare. Una piccola frazione attraversa l’orifizio di uno skimmer nella

zona di vuoto successiva, in cui avviene l'evaporazione finale del solvente e la formazione

dello ione in fase gassosa. Gli ioni sono focalizzati verso l’analizzatore di massa. Opportuni

potenziali applicati allo skimmer assicurano il trasferimento degli ioni all’analizzatore. 220

PROCEDIMENTO DI IONIZZAZIONE IN ESI

Il nebulizzatore produce goccioline di dimensioni uniformi. Nel caso della Spettrometria di

Massa di ioni positivi, il nebulizzatore è generalmente mantenuto a 0 V, mentre la camera di

nebulizzazione è posta a -3.500 V. Gli ioni positivi presenti nell’aerosol sono attratti verso il

capillare di vetro, che porta all’interno dello Spettrometro di Massa, da un potenziale ancora

più negativo pari a -4.500 V. Se si determinano ioni negativi, il segno di tutti i potenziali viene

invertito.

Le goccioline cariche prodotte dal nebulizzatore sono attratte verso il capillare di

desolvatazione. Il flusso di azoto riscaldato che avvolge il capillare causa la riduzione delle

dimensioni delle goccioline. Questo processo è noto come “desolvatazione”.

Le dimensioni delle goccioline continuano a diminuire finché le forze elettrostatiche di

repulsione non superano le forze di coesione (limite di Rayleigh), provocando la

disintegrazione delle goccioline in goccioline più piccole (esplosione o fissione

coulombiana). 221

Questo processo si ripete finché non avviene il desorbimento degli ioni degli analiti nella fase

gassosa, ossia fino a quando il solvente non viene rimosso dall'analita, lasciando una

molecola di analita a carica singola o multipla. 222

Formazione delle goccioline cariche

Per comprendere la formazione di una

nebbia di goccioline cariche (pennacchio

di elettronebu