Lezione di Biologia molecolare

DNASI

Tramite uso di aspeci ca possiamo andare ad identi care la zona di contatto con la proteina.

Dopo la digestione con dnasi non possiamo più fare gel elettroforetico poiche il dna sarà digerito a

singoli nucleotidi, i quali sono troppo piccoli ed escono dal gel mentre si fa la corsa e si vanno a

perdere.

Sappiamo che il legame della proteina con il dna lo protegge dall’azione della dnasi, quindi rimarrà solo

la zona dove la proteina si lega al dna, se appunto trattiamo l’ibrido dna/proteina con la dnasi.

fenolo

L’uso di solventi come il permette di staccare la proteina dal dna, cosi che si arrivi ad avere una

soluzione contenente solo i frammenti di dna “salvati” dal legame con la proteina.

footprinting

Attraverso la tecnica di possiamo andare a fare una digestione parziale del frammento di

dna intero dove si lega la proteina.

Ogni lamento viene marcato ad una estremità, cosi facendo la digestione parziale andrà a formare

tutte le possibili combinazioni di frammenti di restrizione.

Facendo correre questi frammenti, essi migreranno in base alla loro lunghezza ed andremo a vedere

solo quelli marcati, quindi andremo ad avere tutte le possibili lunghezze e quindi tutti i siti di restrizione

(saranno visibili solo quelli marcati, ossia quelli dove l’estremità marcata è ancora presente).

Una volta fatto ciò si confrontano i risultati con i tagli parziali con la proteina legata e senza di essa,

confrontando le bande formate.

La zona vuota nel gel che stiamo confrontando è rappresentante la zona dove è attaccata la proteina e

che quindi la dnasi in azione controllata non può tagliare, quindi ci indica dove si trova la proteina

rispetto all’estremità marcata. acrilammide

Questo esperimento non può essere fatto in gel di agarosio, serve gel di poiche appunto

ha delle maglie molto più strette e quindi si riesce a discriminare anche solo per un nucleotide.

Utilizzare concentrazioni diverse della proteina (andando ad aumentare) ci permette di vedere nel gel

che maggiore sarà la presenza della proteina, più marcato sarà il “buco” che si viene a creare per la

presenza di essa a coprire il dna.

La proteina potrebbe non essere legata in modo contiguo, ma potrebbe avere più zone di contatto ma

in mezzo potrebbe essere tagliata, come mostrato in gura. saggio di interferenza

Una quarta metodologia per l’identi cazione della sequenza può essere il per

dimetil solfato.

modi cazione con alchilante, purine

Il dimetil solfato è un agente modi ca le aggiungendo gruppi metilici sopratutto sulle

guanine.

DMS aggiunge gruppi metilici solo dove la proteina NON è presente, una volta che le guanine sono

piperidina

state metilate si usa la per tagliare il dna, essa rompe il legame fosfodiesterico in

corrispondenza delle G metilate, creando così una serie di frammenti.

Quindi è una tecnica di footprinting che si basa su tagli in base alle basi metilate.

La proteina protegge il dna dalla metilazione, ma può succedere che ci siano delle regioni di dna che

sono magari estro esse e quindi accessibili al DMS e quindi metilabili.

Se modi chiamo il dna con DMS prima dell’aggiunta della proteina, essa no si riuscirà a legare per la

presenza delle G metilate.

Trattandando con DMS dopo che la proteina si è legata, il dna sarà protetto tranne possibili punti dove,

come si è già detto, il dna tende a piegarsi o è lasciato scoperto e quindi viene modi cato ugualmente,

oppure possono anche essere maggiormente esposte e quindi più frequentemente metilate le guanine

e quindi maggiormente tagliate rispetto agli stessi punti senza la proteina.

Ci sono molte metodologie per studiare gli e etti delle mutazioni del dna, si è visto ad esempio che la

TT -35

di inizio sequenza a è estremamente importante e conservata, una modi cazione di un

nucleotide può rendere il promotore inutilizzabile oppure debole e quindi che ha bisogno di aiuto per

essere espresso. mutagenesi sito-

Un esempio di queste metodologie è la

diretta: per fare modi cazione di un singolo nucleotide di un

frammento di dna. Possiamo modi care un determinato

nucleotide in una determinata posizione, per farlo logicamente

bisogna sapere già la sequenza.

Prendendo come esempio, la seconda T della sequenza a -35,

la vogliamo trasformare in una G-C.

Quindi usiamo dei plasmidi i quali contengono al loro interno

primer mutagenici,

dei ossia sintetizzati arti cialmente

nucleotide per nucleotide i quali portano quella di erenza di un

singolo nucleotide che vogliamo studiare.

Quindi prendiamo due contenitori contenenti il plasmide con la

sequenza originale del nostro frammento di dna di interesse, li

denaturiamo cosi da staccare i due lamenti e facciamo

attaccare gli inneschi (primer mutagenici) con il singolo

nucleotide diverso.