Biologia molecolare - lezione

Quindi apparentemente non c’è relazione tra complessità fenotipica e complessità genotipica.

Uno può dire che il fenomeno di splicing alternativo nell’uomo è maggiore rispetto ad un nematode

o ad un microrganismo, dove il numero di introni è minore e quindi il numero di proteine è minore

rispetto all’uomo, ma la complessità fenotipica dell’uomo non è determinata dal numero di geni

codificanti proteine.

Dal penultimo release (numero 37) del genoma umano , appare evidente il numero di paia di basi

in un genoma aploide che è 3,279,005,676. Di queste, circa l’1 % è codificante per proteine. Il

numero di geni invece è intorno ai 21mila. Queste sono statistiche pubblicate dal consorzio per il

sequenziamento del genoma umano (GRC). In questo release abbiamo anche 615 geni nuovi, che

sono stati scoperti. Dopo cominciano le sorprese, per cosi dire, che in qualche modo potrebbero

spiegare il paradosso del valore c da cui ero partito.

Innanzitutto c’è questo dato:ci sono più della metà, rispetto ai geni codificanti per proteine, di

pseudo geni . Quasi 13.400 di geni che non sono funzionanti, quindi pseudo geni. Questi sono

pezzi di gene o geni interi che si sono duplicati ma hanno accumulato un tasso di mutazioni cosi

elevato da non essere più funzionanti. Quindi sono dei relitti che sono presenti all’interno del

genoma e non si capisce perché ci sono, ma se hanno resistito alla selezione evolutiva vuol dire

che hanno una funzione altrimenti si sarebbero persi. E il fatto notevole è che circa della metà di

questi sono espressi e cioè si trovano nel trascrittoma delle cellule. Se sono trascritti, dovrebbero

avere una funzione, ma la situazione è poco chiara.

Un altro elemento notevole, inatteso, è la presenza dei trascritti. Ci sono circa 170mila trascritti

diversi all’interno del genoma umano, anzi all’interno del trascrittoma, contro 35mila tra geni e

pseudo geni. Trascritti diversi, quindi vuol dire che ci sono trascritti che non corrispondono a geni e

se questi ci sono vuol dire che tendenzialmente se ci sono ci sarà una funzione, anche se di questi

trascritti non conosciamo la funzione. Se cosi fosse, il fenotipo non sarebbe determinato solo dai

geni codificanti proteine ma anche da questi altri trascritti non codificanti proteine, che dal punto di

vista quantitativo sono la gran parte all’interno di una cellula.

Poi ci sono molte varianti del genoma che potrebbero, anzi, sono di sicuro, anche se non capiamo

perfettamente perché, alla base delle differenze individuali e che potrebbero incidere anche sul

fenotipo. Quindi l’osservazione di questi numeri potrebbe in qualche modo spiegare il paradosso

del valore c però lo sposta semplicemente perché dice che il fenotipo non dipende soltanto dai

geni ma anche da tutte queste altre regioni genomiche che sono trascritte ma non sono dei geni in

senso classico.

Il problema diventa stabilire la funzione di questi trascritti non codificanti. Con il progetto ENCODE,

che mira a definire un’enciclopedia di tutti gli elementi con attività funzionale. Tutto il genoma viene

trascritto, ogni singolo pezzo di DNA. Ogni locus genico in senso classico genera più di un mRNA,

più di un trascritto in senso più generale e comunque più di un RNA codificante proteine.

Ci sono vari progetti che sono arrivati allo stesso risultato, ad esempio FANTOM 3 che è arrivato

allo stesso risultato attraverso il genoma di topo. Il numero di trascritti indipendenti all’interno delle

cellule murine è lo stesso molto grande relativamente al numero di geni murini, che è molto simile

a quello umano.

Se la trascrizione è pervasiva e avviene dappertutto, sorge il dubbio di come questa trascrizione

venga regolata. Se voi riflettete sul modello con cui avviene la regolazione della trascrizione

(promotore, regioni controllo dove si legano fattori di trascrizione che attivano la trascrizione), chi

regola la trascrizione di queste regioni non codificanti, che magari non hanno un promotore?

Attraverso le tecniche di sequenziamento parallelo si può andare a vedere i siti di binding di fattori

di trascrizioni in tutto il genoma.

Il tipo di quadro che viene fuori è che i siti di binding di fattori di trascrizione (TFBS) non stanno

soltanto nei promotori e negli enhancer e questo è un esempio dei geni p53, cMyc e Sp1, tutti e tre

fattori di trascrizione abbastanza noti. Il 17% di tutti questi siti sta vicino a pseudo geni o in regioni

ambigue, nel senso che sono regioni prossime agli pseudo geni e prossime anche ai geni. Il 24%

di questi siti sono nuovi, completamente non conosciuti prima, quindi vuol dire che non stanno nei

promotori ne vicino a un gene, ma completamente in altre regioni. Mentre un 22% sta in 5’ al

gene,che è il promotore o sta vicino al promotore e un 36% che sta in regioni introniche o in 3’

rispetto a un gene.

Quindi si vede come anche i fattori di trascrizione si trovino in regioni inattese e questo coincide

con il fatto che tutto il genoma viene trascritto.

Se prendiamo come riferimento un locus tipico, quello che si nota è che si, c’è un solo mRNA, ma

è molto più facile trovarne più di uno, più isoforme di mRNA, quindi che codifica per proteine, ma

molto spesso si hanno situazioni molto complicate, nel senso che si hanno punti di inizio della

trascrizione diversi (più di uno), punti di inizio della trascrizione in senso inverso (quindi trascritti

antisenso rispetto all’mRNA) e una pletora di piccoli mRNA , le cui funzioni di alcuni di questi sono

abbastanza conosciute come nel caso dei microRNA.

E poi ci sono locus anche molto grandi che riguardano i cosiddetti “Long non coding RNA” e cioè

RNA non codificanti lunghi, il tipico esempio è HIST, che è un RNA non codificante molto lungo,

implicato nella repressione del cromosoma X nelle femmine di mammifero. Il meccanismo di

repressione è cromatinico, nel senso che si forma una cromatina chiusa, compatta, non

accessibile e quindi non si può trascrivere. Il processo è di regolazione della cromatina è

controllato da questo RNA non codificante lungo quanto quasi tutto il cromosoma X, che lega i

fattori di repressione della cromatina.

Il problema sta nel dare una funzione a questo RNA non codificante, la quale potrebbe spiegare la

relazione tra genotipo e fenotipo.

I microRNA sono dei piccoli RNA, molto corti (21-22 basi), che regolano la traduzione degli mRNA.

L’esempio è del p53: tra le sue funzioni, attiva anche miR-34, che è un fattore di trascrizione che

inibisce la produzione di proteina BCL-2 (fattore per la sopravvivenza cellulare). Quindi i miR-34 si

inseriscono in questi pathway molecolari agendo a livello della traduzione, quindi c’è una

regolazione dell’espressione genica a livello post trascrizionale. Cioè si vanno ad appaiare per

complementarietà con l’mRNA (soprattutto nella regione 3’ UTR), che richiamano il complesso

RISC sull’mRNA, per cui l’ mRNA non viene degradato.

Tipicamente i miRNA hanno qualche base al proprio interno che non si appaia, non è

completamente complementare con l’mRNA. Questo vuol dire che un miRNA non colpisce un solo

mRNA, poiché la sequenza target può essere presente in più mRNA. E un mRNA può avere più

miRNA che possono regolarlo.

In questa diapositiva (numero 16) è anche descritta la via di produzione dei miRNA quindi si parte

dal genoma, perché i miRNA hanno una regione genomica che li produce, cioè sono presenti dei

cluster, delle regioni dove sono raggruppati i miRNA, c’è la formazione di una struttura a forcina e

la struttura di questo mRNA viene riconosciuta DROSC(???) o da un’altra struttura che processa

questi pre-miRNA su cui agisce DICER che rompe la struttura a forcina producendo il miRNA

appaiato con un RNA complementare che è la regione a stelo della struttura a forcina. Questo è

quello che viene caricato sul RISC e il RISC con il proprio miRNA va e “attacca” l’mRNA.

A volte il legame del miRNA al mRNA non produce soltanto un’inibizione della traduzione e quindi

conservazione dell’mRNA ma anche una degradazione di quest’ultimo. Questo avviene soprattutto

quando c’è un completo appaiamento tra la sequenza del miRNA con l’mRNA target, e questo si

ha quando c’è un siRNA.

siRNA sta per short interfering RNA, quindi è un RNA non codificante che agisce in maniera molto

simile al miRNA. L’unica differenza sta nel fatto che la sequenza del siRNA è completamente

complementare, non ci sono basi spaiate.

Quindi viene caricato sempre nel RISC ma i siRNA, a differenza dei miRNA, attivano la

degradazione del mRNA che porta a silenziamento del gene. Con i miRNA l’mRNA è solamente

impedito dal legarsi con il ribosoma.

I siRNA prima erano degli strumenti di laboratorio, poi sono stati scoperti anche nelle cellule.

Questi fattori sono ben conosciuti infatti i siRNA vengono anche studiati per scopi terapeutici,

soprattutto quando hai un gene responsabile della malattia.

Quello che vi ho presentato oggi riguarda questi RNA non codificanti e quindi una parte che

riguarda molto la trascrizione, che è l’argomento principale parlando di macroarray e

sequenziamento parallelo.

Parlando di RNA abbiamo detto che la maggior parte dei trascritti nella cellula sono RNA non

codificanti, in termini di numero di tipi di RNA, in termini quantitativi di trascritti non assoluti, poiché

la maggior parte dell’RNA nella cellula è di tipo ribosomale. Qui con non codificanti si intende

un’altra cosa, non gli rRNA o i tRNA, ma degli RNA che regolano la trascrizione con un

meccanismo del tutto nuovo o comunque non atteso.

In genere questi RNA non codificanti sono molto di più degli mRNA ma a livello quantitativo sono

molto poco espressi, quindi in genere questi RNA non codificanti , che non sono rRNA o tRNA, a

livelli di espressione sono molto bassi.

Quindi RNA non codificanti come regolatori dell’espressione genica. I miRNA sono un esempio

abbastanza ben stabilito e definito perché il meccanismo e la biogenesi sono stati chiariti per bene,

tant’è che si stanno sviluppando per un approccio terapeutico come i siRNA.

Questi RNA sono correlati tra loro. In uno studio fatto tempo fa per RNA sia corti che lunghi, fu

dimostrato come questi RNA non codificanti potessero essere divisi in categorie, relativamente

alla lunghezza dell’RNA stesso e relativamente alla localizzazione cellulare (nucleare o

citoplasmatica). Ovviamente sono sintetizzati nel nucleo, quindi sono tutti nucleari in un certo

punto, ma di quelli piccoli una certa parte diventa anche citoplasmatica. Poi ci sono