Domande Microbiologia

Per formulare il terreno di coltura adatto bisogna conoscere la composizione della cellula da

nutrire. Gli elementi principali sono carbonio e azoto, che posso essere forniti in diverse forme in

base alla presenza di determinati enzimi che degradano la fonte. Non tutti i microrganismi hanno

gli stessi enzimi, quindi ci saranno alcuni microrganismi che magari non riescono a degradare

l’amido. Per quanto riguarda ossigeno e idrogeno non vengono fornite fonti apposite, poiché sono

già compresi nelle fonti di azoto e carbonio. Altri ingredienti importanti sono il fosforo per le

membrane cellulari di fosfolipidi e per il DNA, e lo zolfo per gli amminoacidi solforati.

14. Come avviene la mitosi/scissione binaria?

La scissione binaria è il metodo di duplicazione delle cellule procariote, durante la fase di crescita.

Inizialmente si ha una classica cellula, che durante la sua fase di crescita aumenta leggermente le

dimensioni e inizia a duplicare il materiale genetico per prepararsi alla divisione. Quando il

materiale genetico è tutto replicato, la membrana e la parete fanno un’introflessione; quindi, si

forma un setto lungo il quale avviene poi la separazione. Ciascuna delle due parti ha lo stesso

patrimonio genetico e sono identiche. Quindi da una cellula madre ottengo due cellule figlie

identiche. Il tempo che comprende tutti questi passaggi si chiama tempo di generazione. Il numero

di generazioni è descritto da un esponenziale di base 2. Si può rappresentare una curva di crescita

esponenziale o logaritmica del microrganismo e posso calcolare il tempo di generazione.

15. Fasi di crescita di un microrganismo

Un microrganismo ha un ciclo di crescita che comprende quattro fasi. La prima fase è quella di

latenza (lag- fase), dove il microrganismo si adatta all’ambiente e trova gli enzimi giusti per

utilizzare le fonti di crescita. Questa fase può durare pochissimo o durare anche mesi. La fase

successiva è quella di crescita esponenziale, dove il microrganismo adattato inizia la sua

replicazione più o meno velocemente in base alle condizioni in cui si trova. Poi c’è la fase

stazionaria, dove il microrganismo continua a riprodursi ma meno costantemente e inoltre alcune

cellule iniziano a morire; quindi, c’è un equilibrio tra cellule vive e morte, rapporto costante quindi

curva piatta. Questo può succedere perché la fonte si esaurisce o per prodotti finali del

metabolismo tossici. L’ultima fase è la fase di morte o declino, dove le cellule che muoiono sono di

più di quelle vive, la morte diventa esponenziale. Alcuni microrganismi dopo la fase stazionaria

riescono ad avere un'altra fase di crescita, perché magari trovano nuove fonti. In questo caso ho

una curva diauxica.

16. Metodi di misurazione della crescita dei microrganismi

Per disegnare una curva di crescita bisogna contare il numero di microrganismi e questo lo

facciamo con metodi diretti, che consentono di quantificarli direttamente; e indiretti, che utilizzano

altri parametri e non danno un valore preciso. Tra i metodi indiretti c’è la misurazione del peso

totale cellulare, che prevede quindi di misurare il peso secco della biomassa, che aumenta se

aumenta il numero di cellule. Un altro metodo indiretto è l’analisi chimica di un costituente

cellulare, come il DNA, che ci aiuta sempre a capire se sta aumentando la biomassa. Infine, l’ultimo

metodo indiretto è la turbidimetria, che si può applicare quando abbiamo un terreno trasparente,

che diventa torbido quando crescono i microrganismi, quindi possiamo misurare questo parametro.

I metodi diretti invece comprendono la conta al microscopio con la camera Petroff-Hausser,

considerando precisi volumi e aree e quindi ottenere un preciso valore finale di cellule. Un altro

metodo diretto è il contatore Coulter, una citometria a flusso, che conta le cellule con un sistema

idrodinamico e un raggio laser. Infine, la conta vitale, ultimo metodo di misurazione diretto, che

prevede un sistema di diluizioni decimali e inoculo in piastre per generare colonie. Soltanto con la

conta vitale e la citometria a flusso possiamo vedere se le cellule sono vive o morte, poiché la prima

verifica le unità formanti colonia, e il secondo metodo invece usa appositi marcatori fluorescenti.

17. La conta vitale

Questo metodo di conta diretto si basa sulla conta di microrganismi vivi, in grado di generare

colonie una volta inoculati in piastre, quindi unità formanti colonia, UFC (che può partire da una

singola cellula o da una catenella). Si parte da una sospensione con carica microbica non nota, e di

fanno diverse diluizioni decimali del campione a volumi noti. Si preleva poi 1mL di ogni diluizione e

si inocula in piastre Petri, ma saranno contabili solo quelle che possiedono da 30 a 300 colonie. Si

può però poi tornare indietro con i calcoli nelle varie diluizioni e risalire alla carica iniziale, facendo

n colonie*10^n*10. Il risultato viene espresso in UFC/mL. A volte è necessario concentrare la

sospensione, facendo crescere i microrganismi su filtri sterili appoggiati sulle piastre Petri.

18. La turbidimetria

La turbidimetria è un metodo di conta indiretto che non permette di ottenere il numero di cellule

ma si basa su altri parametri, ovvero la densità ottica o assorbanza. Quando una popolazione di

batteri cresce in un terreno limpido, questo diventa torbido. Grazie a uno spettrofotometro è

possibile associare questo aumento di torbidità al numero di microorganismi misurando

l’assorbanza della soluzione. Per le cellule batteriche si guarda a lunghezze d’onda di 600nm ed è

così possibile associare il numero di cellule a un valore di densità ottica, il quale è crescente man

mano che i microorganismi si duplicano. Con questo metodo non è però possibile distinguere le

cellule vive da quelle morte. L’unità di misura è la densità ottica/assorbanza.

19. La citometria a flusso

Il citometro a flusso è uno strumento di conta diretto che si basa su un principio idrodinamico: il

fluido di trascinamento e la sospensione microbica vengono fatti convogliare in un tubo e la

differenza di velocità permette di avere un allineamento delle cellule, le quali vengono fatte

passare in una camera di conta. Un laser permette di contare le cellule presenti e dei

fotomoltiplicatori restituiscono vari valori; si tratta di un’analisi multi-parametrica in quanto sono

presi in considerazione la fluorescenza naturale e anche valori fisici, forward scatter legato alle

dimensioni cellulari e side scatter che riflette la composizione della cellula. L’unità di misura si

chiama evento citometrico. Inoltre, è possibile inserire dei marcatori che permettono di distinguere

le cellule morte da quelle vive: il sito 24 dà una fluorescenza verde e si lega al DNA di tutte le

cellule; lo ioduro di propidio si lega solo a quelle danneggiate, quindi morte, e dà una fluorescenza

rossa. Si tratta di un metodo automatico, efficiente e rapido che non richiede preparazioni del

campione complicate.

20. Riproduzione dei lieviti- ciclo cellulare del S.cerevisiae

Il S.cerevisiae ha due possibilità di crescita, divisione vegetativa (gemmazione) e riproduzione

sessuata tramite spore. La gemmazione è strutturata in diversi stadi. Nella fase G1, pre-sintetica, la

cellula si prepara a formare la gemma; nella fase S si sintetizza il DNA e la gemma; e nella fase M,

mitotica, il materiale genetico migra alla gemma e questa poi si separa. Ottengo quindi due cellule,

una madre e una figlia più piccola. Non ho due cellule identiche, la cellula figlia deve maturare

quindi ho uno sfasamento temporale e non posso applicare la formula del tempo di generazione

dei batteri. I lieviti possono trovarsi in forma aploide o diploide. Due forme aploidi diverse, A e alfa,

possono unirsi a formare una cellula diploide, che in condizioni di stress ambientale può dare

origine a meiosi, creando un asco con dentro quattro cellule aploidi sessuate, ascospore. Queste

possono poi germinare e fare gemmazione o creare un diploide e continuare la riproduzione. La

gemmazione è più veloce, ma la riproduzione sessuata può essere utile per creare ibridi.

21. Effetti delle condizioni ambientali sulla crescita microbica

Un parametro da tenere sotto controllo quando si prepara un terreno di coltura è il pH, poiché i

microrganismi si differenziano in neutrofili, acidofili e alcalofili. Bisogna tenere sottocontrollo il pH

poiché c’è una differenza di pH tra interno ed esterno della cellula, all’interno deve essere più alto e

all’esterno è più basso. La cellula riesce a regolare questo parametro con l’ATP-sintasi che butta

fuori H+, ma quando l’energia finisce se entrano acidi organici e il pH si abbassa troppo, una cellula

neutrofila blocca l’attività metabolica. Un altro parametro da controllare è l’ossigeno, i

microrganismi si distinguono in aerobi obbligati, anaerobi facoltativi, microaerofili e anaerobi

obbligati. I microrganismi aerobi sono protetti dallo sviluppo di radicali dall’ossigeno grazie agli

enzimi catalasi e superossidodismutasi; distinguiamo microrganismi catalasi-positivi e catalasi-

negativi. Anche la temperatura va regolata poiché i microrganismi possono essere termofili (40-80

gradi), mesofili (10-40 gradi) e psicrofili (0-20 gradi). I mesofili hanno due sottocategorie,

termotrofi, cioè mesofili che tollerano però anche temperature più alte e psicotrofi, mesofili che

tollerano anche temperature più basse. Inoltre, ci sono gli ipertermofili che crescono a temperature

prossime all’ebollizione. Ogni microrganismo ha un optimum di crescita, cioè un range di

temperatura e pH dove cresce meglio. Per quanto riguarda invece l’attività dell’acqua i

microrganismi si dividono in alofili, moderatamente alofili e alofili estremi.

22. Concetto di sterilità

Per coltivare microrganismi è necessario lavorare in sterilità, e questo è possibile grazie a fiamme

del fornelletto bunsen o da cappe a flusso laminare per filtrare aria e immetterla sterile. Si tratta di

un concetto di sterilità assoluta, anche i contenitori e i terreni vengono sterilizzati. I terreni si

sterilizzano con pressione di vapore, per la vetreria una stufa ad alte temperature e per i materiali

plastici si possono usare i raggi gamma. I parametri da tenere in considerazione per valutare la

sensibilità termica sono il tempo di riduzione decimale D (log N/N0 = t/D), tempo necessario per

inattivare il 90% delle cellule di una popolazione microbica; e il parametro z, cioè l’aumento di

temperatura che serve per ridurre D di un fattore 10. Si valutano quindi combinazioni di tempo e

temperatura. Si tratta di riduzioni decimali, non si arriva mai allo zero ma si tend