Biologia strutturale

BIOLOGIA STRUTTURALE

L’esperimento di Anfinsen ha stabilito

per la prima volta che il ripiegamento

delle catene polipeptidica è reversibile.

Si può indurre una denaturazione in

vitro con perdita di funzionalità legata

alla perdita di struttura, però tale

struttura può essere recuperata

quando si allontanano le cause della

denaturazione.

Per denaturare una proteina si può

usare la temperatura: aumenta

l’energia cinetica degli atomi rompendo

i legami deboli che stabilizzavano la

struttura 3D; oppure con l’aggiunta di

sostanze denaturanti che rompono

chimicamente le interazioni deboli.

Per revertire il processo basta abbassare la temperatura o togliere il

denaturante dalla soluzione,

ristabilendo le condizioni fisiologiche.

Nel caso della ribonucleasi usata nell’esperimento c’è anche

la complicazione dei ponti S-S: per romperli occorre

aggiungere un agente riducente, oltre all’urea che è il

denaturante che rompe le interazioni.

Se si rimuove l’urea e si riporta la soluzione in condizioni

ossidanti, la proteina si ripiega formando i corretti ponti s-s.

Se si inverte l’ordine dei passaggi lasciando l’urea e togliendo

prima il riducente, si formano ponti s-s casuali perché la

proteina viene mantenuta denaturata, togliendo poi l’urea la

proteina non sarà più nello stato nativo.

Il paradosso di Levinthal è una riflessione su come possa avvenire il folding:

considerando una proteina

piccola con numero limitato (es. 3) di stati conformazionali accessibili ad

ognuna delle 100 catene laterali,

anche ipotizzando un tempo molto rapido in cui essa possa esplorare le 3

conformazioni, se il processo è

casuale tramite prova ed errore il tempo per ottenere la struttura 3D corretta

nativa sarebbe maggiore

dell’età dell’Universo. Per cui il folding, che normalmente avviene nell’ordine di

secondi o millisecondi, non

è completamente casuale, non si testa ogni possibile conformazione. Ci deve

essere un meccanismo

specifico che determina la velocità del processo di ripiegamento.

L’esperimento di Anfinsen avviene in provetta in un ambiente controllato in cui

c’è solo una soluzione di

proteina. Quindi il processo di folding dipende solo dall’informazione contenuta

nella struttura primaria

della proteina. In vivo ci possono essere molecole come le chaperonine che

aiutano il processo ma non

sono necessarie.

(Alfa-fold è un predittore di struttura online sulla base di una sequenza ma

bisogna validarlo. Rimane però il

problema del meccanismo di folding, non sappiamo come si arriva a quella

struttura)

Lo stato nativo è lo stato conformazionale più stabile: questa definizione è una

semplificazione perché le

proteine non sono oggetti statici ma si muovono. Anche lo stato nativo ha

sottostati conformazionali

diversi tra loro che permettono la funzione. Ad es. l’emoglobina ha 2 stati con

più sottostati.

Lo stato denaturato è una catena polipeptidica che mantiene la struttura

primaria ma si sono perse tutte le

interazioni deboli tra le catene laterali. In realtà è un insieme eterogeneo di

stati conformazionali tutti

diversi ma che hanno lo stesso livello di energia. È molto meno accessibile a

livello sperimentale rispetto a

quello nativo.

-Legami idrogeno: tra catene principali oppure

tra catene laterali. Quelli della catena

principale stabilizzano le strutture secondarie.

-Ponti S-S: l’unico legame covalente che ha un

ruolo nella stabilizzazione.

-Ponti salini o legami ionici: tra atomi con

carica elettrica opposta (es. Lys-Asp)

-Forze di Van der Waals: interazioni

idrofobiche tra catene laterali di aa apolari.

Stabilizzano la struttura terziaria, si trovano

all’interno della proteina lontano dall’ambiente

acquoso. Singolarmente il loro contributo

entalpico è piccolo ma sono molto numerose.

Le interazioni idrofobiche sono interazioni elettrostatiche fra atomi o gruppi di

atomi che non hanno

cariche nette ma parziali cariche elettriche permanenti o transienti. Dipoli

permanenti come l’acqua o

dipoli istantanei, molecole neutre ma che assumono istante per istante parziali

cariche elettriche dovute al

movimento degli elettroni.

È sempre presente un H nell’atomo donatore e

assume una parziale carica positiva per

interagire con un accettore.

Ha una direzionalità precisa, donatore e

accettore devono avere angolo e distanza ben

definiti, a differenza delle interazioni

elettrostatiche classiche in cui le parziali cariche

interagiscono ovunque nello spazio.

L’equilibrio chimico è un processo dinamico in cui la velocità del processo in

una direzione è uguale a

quella nell’altra direzione. In un processo reversibile questo equilibrio vale lo

stesso. Se non fosse

reversibile le velocità sarebbero diverse e si raggiungerebbe un altro equilibrio.

All’inizio ci sono solo i reagenti.

Quando non c’è più variazione

di concentrazione nei reagenti e

nei prodotti si è raggiunto

l’equilibrio chimico. Si ha la

stessa velocità in entrambi le

direzioni.

Il processo può essere definito da un punto

di vista quantitativo tramite la costante

d’equilibrio data dal rapporto fra

concentrazione dei prodotti e dei reagenti.

Più è elevata e più l’equilibrio è spostato

verso la formazione dei prodotti (verso dx).

Un equilibrio può essere

perturbato variando le

condizioni come pressione,

temperatura e

concentrazione.

La costante d’equilibrio può essere definita da un punto di vista

termodinamico: dipende dalla temperatura e dalla differenza di

stabilità di prodotti e reagenti.

La variazione di energia libera indica la spontaneità di un processo:

ΔG dipende da ΔH e ΔS, per cui il ΔG<0 può essere raggiunto in modo diverso.

Nella fermentazione del

glucosio entrambi sono negativi, nella combustione dell’etanolo il ΔH è molto

negativo nonostante il

termine -T ΔS si opponga poiché positivo. Nel terzo caso la reazione è

trascinata dall’entropia nonostante

sia endotermica (ΔH>0).

Il meccanismo si ricava con

esperimenti di cinetica chimica in

cui entra in gioco il fattore tempo.

Variando dei parametri vedo con

quale velocità avviene la reazione.

Osservo che la reazione avviene in

un meccanismo a due stadi: stadio

lento e stadio veloce, in cui il

prodotto del primo step è il

reagente per il secondo (intermedio

di reazione, una specie che non

compare nella reazione globale).

La cinetica chimica riguarda la velocità

di reazione, ossia la variazione di

concentrazione di un reagente o

prodotto nel tempo. La curva del

grafico è una traccia cinetica: in

ordinata c’è la concentrazione e in

ascissa il tempo.

Man mano che il tempo passa la

velocità diminuisce. Per avere la stessa

variazione di concentrazione

occorrono due diversi intervalli di

tempo in cui il secondo è maggiore

perché la reazione rallenta.

Quello che ci interessa è la velocità

istantanea, che si ricava considerando

un tempo infinitesimo nella traccia

cinetica. Si usa la derivata anziché il

delta.

Non bisogna confondere la velocità che

si osserva Vobs con la costante di

velocità specifica K. Vobs dipende dalla

concentrazione del reagente mentre la K

specifica dipende dalla natura stessa dei

reagenti e dalla temperatura.

Sono due espressioni della velocità ma

Vobs può essere vista e osservata e mi

serve per calcolare poi K.

Esempio: esperimento cinetico di denaturazione. Ho una soluzione di proteina

in buffer a cui poi aggiungo

un denaturante e valuto la variazione di segnale spettroscopico tra stato nativo

N e denaturato D, che

corrisponde alla Vobs. Bisogna notare che è un processo reversibile dominato

dalla denaturazione perché

ho messo denaturante ma c’è sempre una quota di D che ritorna N, per cui la

Vobs nasconde sia la K di

folding che di unfolding. Occorre separare i due contributi, Vobs è la somma

della velocità diretta e del

processo inverso.

L’equazione cinetica

ha sia una forma

logaritmica che una

esponenziale.

La forma esponenziale dipende dal fatto

che esiste uno stato di transizione che va

superato.

Nelle tracce sperimentali vediamo come

varia la concentrazione di un reagente in

funzione del tempo a diverse

concentrazioni. Ottengo curve

esponenziali in cui vedo che minore è la

concentrazione, minore sarà la velocità

osservata.

Es. Soluzioni di emoglobina (Hb) con ligandi

diversi (CO2, O2, CO): seguo la reazione

tramite la variazione di colore allo

spettrofotometro. Vedo spettri di

assorbimento in funzione della lunghezza

d’onda per determinare come varia il segnale

e quindi la velocità. Ad es. prendo Hb senza

O2, aggiugno O2 insufflando e misuro la

variazione del segnale nel tempo. Poco sotto i

500nm c’è una differenza di segnale tra Hb

con e senza O2, quello è il punto corretto per

vedere come cambia l’Hb. La Vobs è maggiore

quando l’O2 è di più.

Profilo di reazione: Energia

libera o potenziale in

funzione di una coordinata di

reazione che descrive il

procedere della reazione (ex.

quanti legami si formano per

ottenere B a partire da A,

NON è il tempo). Guardando

i livelli si può dire che questa

reazione è esotermica e

spontanea, avviene in un

unico stadio passando tra

due stati A e B , con uno

stato di transizione da

superare che ha il max di

energia ma che non è

popolato, è transiente.

L’altezza della barriera è proporzionle alla K di velocità del processo. In questo

caso la velocità maggiore si

ha da A verso B, la barriera è più bassa.

Lo stato di transizione è quello stato in cui si stanno formando i legami che

caratterizzano i prodotti e si

stanno rompendo quelli che caratterizzano i reagenti. Non è mai veramente

popolato.

Però se si vuole capire il meccanismo di reazione bisogna conoscere la struttura

e la stabilità sia di prodotti

e reagenti sia dello stato di transizione, in modo tale da capire quali sono i

primi legami che si formano.

Questo stato è