Biologia Cellulare

OH

Dei due filamenti, quello che corre in direzione 5’-3’ è copiato direttamente, mentre quello

antiparallelo viene copiato in pezzi, detti frammenti di Okazaki, che alla fine del processo vengono

ricollegati.

Dato che la DNA-polimerasi riesce solo ad allungare un filamento pre-esistente, non può fare una

sintesi ex novo del nuovo filamento. Quindi, l’RNA-polimerasi, detta anche primasi, sintetizza un

pezzo di RNA nel punto di origine della duplicazione, a cui si attaccherà la DNA-polimerasi.

Questo pezzo di RNA iniziale verrà sostituito con i nucleotidi del DNA alla fine del processo,

quando i frammenti di Okazaki verranno legati con la DNA-ligasi. Per aprire la doppia elica nella

bolla, l’elicasi scioglie i legami a idrogeno e, man mano che questi si aprono, altre proteine

impediscono a questi legami di riformarsi prima della fine della sintesi. Ogni 10 nucleotidi, un tipo

particolare dell’enzima topoisomerasi, detto girasi, taglia uno dei due filamenti, gli fa fare un giro

sull’altro e lo rilega, in modo che il filamento, con l’allargarsi della bolla, non si attorcigli

ulteriormente impedendo la duplicazione.

Il problema delle estremità

Nel filamento lento, un pezzo di elica, alla fine, non viene mai trascritto perché la RNA-polimerasi

non trova un primer (sequenza di riconoscimento per l’RNA-polimerasi) a cui attaccarsi; quindi,

questo filamento tenderà ad accorciarsi sempre di più. Questo problema si può risolvere con la

telomerasi, un enzima che aggiunge all’estremità lenta delle sequenze ripetute di nucleotidi in modo

che i geni funzionali non vengano intaccati. Questo DNA ripetuto viene ripiegato e si associa a

proteine che lo compattano, formando il telomero. L’enzima telomerasi è espresso nell’adulto solo

nelle cellule staminali, mentre le cellule già specializzate hanno un numero limitato di replicazioni

prima di intaccare il DNA codificante, provocando la morte della cellula. Le cellule tumorali, ad

esempio, sono in grado di attivare la telomerasi, per cui compiono infiniti cicli vitali.

Ma quale conseguenza può avere un accorciamento del telomero tale da non poter produrre le

proteine per ripiegarsi su se stesso, anche senza andare ad intaccare l’informazione genetica? Dato

che i due filamenti dell’elica sono complementari, anche i telomeri lo saranno e, se non sono

ripiegati, diventano estremità appiccicose e possono saldarsi. La chiusura della doppia elica viene

identificata dalla cellula come un danno, per cui viene bloccato il ciclo cellulare.

Considerando che il DNA si duplica con una velocità compresa tra 0,3 e 4,7 kb (kilo basi) al

minuto, quanto tempo ci vorrebbe se esistesse una sola polimerasi per tutti i cromosomi? Allora,

sappiamo che la velocità è di 300/4700 coppie di basi al minuto e che in totale, nell’uomo, ci sono

÷

6,4 miliardi di paia di basi. Quindi, se ci fosse una sola polimerasi, ci vorrebbe (6’400’000’000

4’700) = 1’361’702,128 minuti, cioè (1'361'702,128 ÷ 60) = 22’695,035 ore, cioè (22'695,035 ÷ 24)

= 945,626 giorni, ovvero (945,626 ÷ 365) = 2,59 anni, praticamente due anni e mezzo per una sola

duplicazione. Questo vuol dire necessariamente che sono esistono e sono attive più polimerasi per

ogni cromosoma. In particolare, abbiamo in media 2960 DNA-polimerasi attive al minuto per ogni

cromosoma. 63  

Giorgia Palladino

La riparazione del DNA

La riparazione del DNA è un processo diversificato a seconda del tipo di danno ed è diverso tra

procarioti ed eucarioti; in questi ultimi coinvolge enzimi utilizzati anche per altri fini, il DNA è più

lungo e il sistema di regolazione è integrato con delle proteine, per cui il processo di riparazione è

più complicato. La cellula che non riesce a riparare il danno del DNA va incontro a morte per

apoptosi o senescenza.

In generale, la cellula riesce a riparare il danno se questo non è troppo esteso. In caso contrario o la

cellula non lo ripara e muore, oppure lo ripara ma in una modalità che può portare a degli errori; di

solito, però, la cellula preferisce la morte piuttosto che una riparazione errata, perché questa può

portare ad una mutazione cancerogena. Lo stesso agente, inoltre, può causare più modalità di danno

al filamento di DNA. Gli enzimi di riparazione percorrono il filamento per controllare eventuali

errori dato che per la riparazione bisogna sintetizzare più enzimi.

Ad esempio, il danno da radiazione ultravioletta lega due timine adiacenti anziché alla base azotata

corrispondente. Il tipo di riparazione va a rimuovere tutta le regione intorno alle due timine (circa

12 nucleotidi) e poi la ricostruisce, sintetizzando nuovo DNA.

Malattie molto gravi, invece, sono dovute a mutazioni ereditarie dei geni della riparazione, perché

tale mutazione va a colpire anche i geni coinvolti nella regolazione genica e nella produzione di

DNA.

Origine dei danni al DNA

Abbiamo visto che, durante la duplicazione, si incorre in circa un errore ogni miliardo di paia di

basi. È una percentuale molto bassa ma, considerando che il genoma umano conta 6,4 miliardi di

basi, le mutazioni sono comunque una realtà piuttosto concreta. Abbiamo due tipi di possibile

origine dei danno al DNA:

Danni spontanei:

• Errori nella replicazione; questi errori sono dovuti al fatto che le basi azotate hanno forme

- tautometriche (cioè molto simili), quindi la DNA-polimerasi può legare ad una base azotata

un’altra che non è la sua complementare. La stessa polimerasi, però, può correggere subito

l’errore perché i nucleotidi devono passare attraverso un’apertura della polimerasi su misura

per ogni base azotata, per cui se la base è quella sbagliata la polimerasi torna indietro e la

corregge.

Deaminazione; determina la formazione di uracile con rilascio di ione ammonio a partire

- dalla citosina, che si trasforma in 5-metilcitosina. L’appaiamento errato può essere

riconosciuto e riparato da particolari sistemi di riparazione; in particolare, specifiche

glicosilasi riconoscono questo nucleotide che non è comune nel DNA e lo sostituiscono con

la citosina. Se l'errore non viene riparato entro la successiva replicazione del DNA le nuove

molecole di DNA sintetizzate avranno inserite una mutazione non più eliminabile.

Depurinazione o, comunque, perdita di una base;

- Danno ossidativo

-

Agenti mutageni:

• Analoghi delle basi

- Ossidanti

- Alchilanti

- Intercalanti

- Radiazione ultravioletta

- Radiazioni ionizzanti

-

Tutti questi agenti mutageni son usati nelle terapie contro il cancro, come radioterapia e

chemioterapia, perché danneggiano la duplicazione delle cellule cancerose, ma anche di quelle

sane.

Vediamo ora i complessi, e ridondanti, sistemi di rilevazione del danno al DNA: 64  

Giorgia Palladino

1. I sensori attivano le molecole di segnalazione

2. Le molecole di segnalazione attivano i sistemi di riparazione

3. I sistemi di riparazione localizzano le proteine nella zona da riparare

4. I sistemi di riparazione attivano la proteina p53, che può anche legarsi in maniera autonoma al

DNA danneggiato

5. p35 è responsabile del blocco della progressione del ciclo cellulare, dell’attivazione di sistemi di

riparazione e dell’attivazione del meccanismo di apoptosi in caso di mancata riparazione

La trascrizione del DNA

La trascrizione è la modalità con cui l’informazione passa dal DNA all’RNA e, nei procarioti, è

relativamente semplice. Sul filamento di DNA troviamo un promotore, cioè una sequenza di basi

che fungono da attacco all’RNA-polimerasi in una direzione precisa. Un fattore σ riconosce parte

del promotore e richiama l’RNA-polimerasi, che apre il filamento (allo stesso modo dell’elicasi) e

trascrive uno dei due filamenti. Alla fine del gene, abbiamo una sequenza di stop (o si forma

un’ansa, o si richiede la presenza di un fattore di terminazione) e la trascrizione finisce.

Negli eucarioti il meccanismo è più complesso perché aumenta il numero di fattori di trascrizione e

perché il promotore ha una regione centrale molto più ampia. A questo promotore si lega l’RNA-

polimerasi grazie a diversi fattori basali caratteristici del promotore (nell’immagine, in blu). Altri

fattori riconoscono la regione che deve essere trascritta aumentando la frequenza della trascrizione.

Altri fattori (in rosso) sono invece attivatori che si legano in maniera specifica e che si possono

legare vicino alla zona del promotore o anche molto lontani. Negli eucarioti, ci sono tre diverse

RNA-polimerasi: una per l’RNA ribosomiale, una per l’RNA messaggero e una per l’RNA di

trasporto (o transfer). Quasi tutti gli RNA di regolazione son tradotti dalla polimerasi del tRNA,

pochi dalla polimerasi dell’rRNA. La differenza tra le varie polimerasi dipende dalle subunità

(molecole complesse) e da diversi fattori basali che riconoscono il promotore, che a sua volta è

diverso a seconda della polimerasi. I fattori specifici, invece, riconoscono brevi sequenze dette

elementi risposta. I fattori di trascrizione agiscono in combinazione, quindi ne basta un numero

limitato. Inoltre, nella trascrizione entra in gioco come fattore anche lo stato della cromatina, cioè il

suo grado di compattazione.

La mutazione dell’RNA

I geni per la trascrizione dell’RNA sono moderatamente ripetuti, ovvero presenti in qualche

centinaia di copie; infatti, se ce ne fosse solo uno, avvenuta una mutazione il gene non sarebbe più

in grado di codificare per l’RNA e, dunque, la cellula non sarebbe più in grado di sintetizzare

proteine.

L’RNA precursore viene tagliato da processi nel nucleo composti da RNA e proteine e, inoltre,

compie un processo autocatalitico di autosplicing, per cui delle regioni vengono tagliate e il resto

viene saldato.

Vediamo in particolare le fasi del tRNA:

i geni che codificano per l’RNA sono moderatamente ripetuti e disposti a tandem, cioè uno dietro

• l’altro, separati da tratti di collegamento non codificante

il livello di trascrizione dipende dalle necessità della cellula

• dopo la sintesi, il precursore viene processato da un complesso costituito da proteine e piccoli

• RNA (processosoma)

il precursore viene tagliato in più parti

• alcuni tratti vengono rimossi

• alcune basi vengono metilate

• gli RNA si ripiegano assumendo una struttura secondaria con tratti a doppia elica

• seguono ulteriori modificazioni di basi e/o ulteriori tagli, ecc

•

Per quanto riguarda l’rRNA