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La coda della miosina riconosce molecole diverse che devono essere trasportate e sono specifiche:

per questo avremo diversi tipi di code in base al tipo di molecola, anche se le code di trasporto per

le molecole sono in genere corte. Il movimento muscolare, invece, richiede una catena lunga, che

consenta lo scorrimento dell’actina e della miosina che sono vincolate tra loro, ovvero uno

scorrimento reciproco con la contrazione di tutta l’unità.

Il muscolo striato scheletrico

Le cellule muscolari sono cellule multinucleate perché si fondono durante lo sviluppo embrionale in

un sincizio, ovvero mettono in comune il citoplasma anche se ogni nucleo continua a controllare la

sua porzione di citoplasma. Ogni singola fibra muscolare, che andrà a formare un fascio di fibre, è

composta da più miofibrille avvolte da una membrana. La miofibrilla, quindi, è la singola cellula

striata. Questa striatura è dovuta alla sovrapposizione di due filamenti di actina e miosina, le cui

teste sporgono lateralmente e le cui code sono intrecciate tra loro. Le teste si dispongono, come

abbiamo detto, nelle tre dimensioni, a formare un’elica tridimensionale, e ogni testa è in grado di

contattare un filamento di actina. Durante la contrazione, come vedremo più precisamente in

seguito, il collo della miosina si flette, avvicinando l’actina. Viene detto sarcomero la singola e

minima unità contrattile della miofibrilla, delimitata da due linee Z. Lo stimolo nervoso arriva

contemporaneamente a tutti i sarcomeri, che si contraggono in modo sincrono avvicinando le loro

estremità (linee Z).

Perpendicolarmente ai filamenti di actina e miosina, ci sono delle proteine che le vincolano. La

miosina si sposta sempre verso l’estremità meno e, dopo aver fatto un movimento, si stacca

dall’actina e si riattacca per fare quello successivo, in modo da accorciare progressivamente il

sarcomero. Sono quindi le estremità - della miosina ad essere vincolate a proteine perpendicolari.

Chiamiamo banda A la zona di sovrapposizione di actina e miosina, interrotta al centro da una zona

più chiara, la zona H, dove la miosina è vincolata alla mionesina, ad essa perpendicolare: la zona H

è dunque divisa a metà dalla linea M di mionesina. Altra regione ancora più chiara è la banda I

(isotopica), in cui troviamo solo l’actina intramezzata dalle linee Z, in cui troviamo la proteina

CAPZ che vincola l’actina. Durante la contrazione muscolare, le bande I e le zone H si riducono

notevolmente a causa dell’espansione dell’area di sovrapposizione di actina e miosina, cioè la banda

A.

Ma come è scatenato il movimento? La tropomiosina è appoggiata all’actina e ne tocca ogni

monomero, coprendo il sito di interazione actina-miosina. Lungo il filamento sottile, cioè quello di

actina, ogni 38,5 nm troviamo il complesso della troponina, formato da tre molecole: la troponina I,

la troponina T e la troponina C, che lega il calcio. Quando arriva l’impulso nervoso, come abbiamo

2+

visto, la concentrazione di calcio aumenta e ogni ione Ca si lega alla troponina C (TnC) che si

solleva, distaccando la tropomiosina dall’actina e lasciando scoperto il sito di legame actina-

miosina. Quando l’actina e la miosina si legano e scorrono l’una sull’altra, ci sarà l’ATP che

fornisce l’energia necessaria al movimento. La titina unisce il filamento di miosina alla linea Z e la

nebulina fa da ponte al collegamento actina-miosina, rendendo più solida la struttura del sarcomero.

Vediamo ora il ciclo dell’ATP nella contrazione muscolare:

1. Nel momento iniziale, la troponina si lega all’actina, chiudendo i siti di legame tra actina e

miosina (ponte traverso). L’actina è ora legata all’ADP.

2. L’ADP si stacca dall’actina (colpo di forza) nel momento in cui aumenta la concentrazione di

2+

ioni Ca : la troponina si solleva e le teste miosiniche si legano all’actina, portando il filamento

sottile verso il centro del sarcomero (configurazione a bassa energia).

3. L’ATP consente il distacco del ponte traverso, ovvero della miosina dall’actina (configurazione a

bassa energia).

4. La testa della miosina si flette, provocando l’idrolisi dell’ATP in ADP + P . l’ADP rimane legato

i

al filamento di actina (configurazione ad alta energia).

Il segnale nervoso 57  

Giorgia Palladino

L’assone termina sulla membrana plasmatica delle cellule muscolari: quindi, quando arriva il

segnale nervoso che rilascia neurotrasmettitori, questi vengono riconosciuti dai recettori delle

cellule muscolari.

La membrana plasmatica delle cellule muscolari è caratterizzata da una struttura con introflessioni, i

tubuli T, cavi all’interno. Ogni tubulo T penetra per un po’ nello spessore della cellula ed entra in

contatto con il reticolo endoplasmatico liscio. Questo, a sua volta, forma dei tubi paralleli che

affiancano i tubuli T. I due elementi del reticolo endoplasmatico liscio (REL) e il tubulo T formano

una struttura detta triade.

All’arrivo del segnale nervoso, si ha una depolarizzazione della membrana plasmatica e, quindi,

anche del tubulo T; questa depolarizzazione si trasmette al REL e va a determinare una variazione

ionica e, di conseguenza, un cambiamento di polarità (la membrana si ritrova con cariche positive

all’esterno e cariche negative all’interno). Quando gli ioni sodio entrano nella cellula, gli ioni calcio

escono dal REL e si innesta il ciclo di contrazione. Alla fine del processo, però gli ioni calcio

devono tornare all’interno del REL e lo fanno grazie ad alcune pompe (la più importante la pompa

SERCA, Sarco/Endoplasmatic Reticulum Calcium ATPasi), che richiamano ioni calcio; il REL,

infatti, ha anche una funzione di serbatoio di calcio. Quando il calcio è nel REL, si associa a

proteine che legano diverse centinaia di ioni, le cosiddette proteine spugna. Questo avviene per un

problema di pressione osmotica: dato che nel determinare la pressione osmotica non conta la

dimensione delle molecole ma il loro numero, se il calcio catturato in vescicole rimanesse nel REL

in unità singole, la pressione osmotica sarebbe troppo alta e le vescicole scoppierebbero. Invece,

legando centinaia di ioni ad un’unica proteina, questa conta come singola unità nella regolazione

della pressione osmotica.

Diversi tipi di fibre muscolari

Esistono diversi tipi di fibre muscolari, che differiscono per il tipo di miosina (sono sette nei

mammiferi). Queste variazioni fanno sì che i muscoli possano avere un metabolismo più ossidativo

(aerobi) o più glicolitico (anaerobi). Un muscolo più ossidativo richiede più ossigeno, quindi avrà

bisogno di un numero più alto di mitocondri e di una maggiore vascolarizzazione, per un maggior

apporto di sangue. Nella glicolisi anaerobia dei muscoli glicolitici, invece, l’acido piruvico si

trasforma in acido lattico, con un minor rendimento energetico in termini di ATP.

I muscoli posturali sono ossidativi, poiché sono in grado di compiere uno sforzo molto prolungato

nel tempo; sono quindi muscoli rossi, per la maggiore vascolarizzazione, presenza di più ferro e più

mitocondri. I muscoli dello sprint, invece, devono sostenere uno sforzo breve ma molto intenso.

Gli organismi predisposti ad un maggior metabolismo ossidativo sono in grado di rispondere meglio

ai cambiamenti del glucosio e, quindi, si proteggono meglio dal diabete di tipo 2.

Il muscolo cardiaco è molto particolare in quanto è striato, come i muscoli scheletrici, ma

involontario, come i muscoli viscerali. È costituito da cellule più piccole, con solo uno o due nuclei,

è ricco di mitocondri e le cellule sono connesse da giunzioni comunicanti, per sincronizzare la

contrazione. Troviamo però, come nei muscoli scheletrici, una sovrapposizione regolare di actina e

miosina.

Nel muscolo licio (o viscerale), invece, l’actina e la miosina non sono sovrapposte ordinatamente,

ma si organizzano nel momento in cui devono svolgere una funzione. Si organizzano quindi a zone,

in regioni diverse: la contrazione diventa meno efficace e i filamenti di actina e miosina sono

collegati alla membrana plasmatica.

I cambiamenti di forma

I cambiamenti di forma di una cellula per il movimento cellulare o per l’emissione di pseudopodi o

strutture simili sono dovuti a movimenti legati all’actina. Come abbiamo visto, una funzione

fondamentale della regolazione della forma della cellula è data dagli ioni calcio, che regolano la

fosforilazione delle teste miosiniche. Il movimento, infatti, è sempre soggetto alla regolazione di

ioni calcio e altre proteine G che regolano la polimerizzazione del filamento di actina. Alcune

proteine di tipo G sono coinvolte nell’emissione di prolungamenti e emissioni ameboidi, altre

58  

Giorgia Palladino

invece nel traffico di vescicole. Tali proteine G si attivano quando legano al GTP, mentre sono

inattive quando il GTP si scinde il GDP. Quando sono attive, vanno ad agire su altre proteine grazie

alla defosforilazione del GTP. Una volta defosforilato, però, il GDP non viene rifosforilato, ma è

sostituito con un nuovo GTP grazie ad un fattore di scambio detto GEF:

GTP

GDP

Quindi, i segnali extracellulari influenzano la motilità agendo su piccole G-proteins. In generale, i

segnali mediati da fosfoinositidi aumentano la motilità, quelli mediati da cAMP favoriscono

l’ancoraggio.

Ad esempio, l’azione delle G-proteins Cdc42, Rac e Rho serve all’emissione di filipodi, pseudopodi

o fibre di stress (stiramento), che sono degli ancoraggi. In questi casi, la cellula polimerizza l’actina

formando strutture solide tipo gemme, molto concentrate; questa actina spinge in avanti la

membrana, mentre i filamenti di depolarizzano nella parte più interna. L’actina così polimerizzata si

aggancia alla membrana e forma filamenti esplorativi di diverse forme, che dopo devono rientrare

nella cellula. Così, grazie ad una contrazione, tutta la cellula può spingersi in avanti. Man mano che

avanza, la cellula lascia pezzi di citoplasma dietro di sé, quelli che erano i siti di adesione ed erano

molto ancorati al piano (ad esempio se si analizza tale cellula in un vetrino). Ogni volta che si forma

un sito di adesione, se ne formano di nuovi grazie alla catalizzazione delle proteine G.

Alcuni batteri endocellulari, ad esempio, possono polimerizzare l’actina per avere una spinta

propulsiva: l’actina spinge in avanti il batterio in modo che possa uscire dalla cellula che lo ha

fagocitato oppure perché possa passare da una cellula all’altra.

Miosine non convenzionali

Le miosine non convenzionali, come abbiamo detto, trasportano, delle proteine sull’actina. Mentre

sui microtubuli si spostano vescicole e organuli più grandi, sui filamenti di actina si spostano

soprattutto molecole, come proteine e RNA. Queste si spostano perché nella cellula le regioni sono

localizzate, quindi i prodotti devono essere portati nei siti appositi.

Filamenti intermedi

Alcuni tipi di filamenti intermedi sono confinati in alcune cellule, come quelli di cheratina o i

neurofilamenti, che danno il diametro all’assone. Altri, invece, sono presenti in tutte le cellule,

come le lamine che sostengono l’involucro nucleare e si legano dalla membrana nucleare alla

cromatina. I filamenti intermedi si rapportano con la membrana, cioè hanno funzioni di sostegno

perché sono collegati a proteine di membrana. Sono molto stabili, non si polarizzano o

depolarizzano se non per avvenimenti cruciali, come la divisione cellulare. Non sono polari, quindi

non hanno un’estremità + e una -. Su di essi non troviamo proteine motrici e, a volte, polimerizzano

sia in lunghezza che in spessore. Ad esempio, in questa immagine dell’assone, i filamenti intermedi

sono colorati in verde, i microtubuli in giallo e le proteine che fanno da ponte in rosso. 59  

Giorgia Palladino

Il nucleo e il DNA

Questo organulo è tipico esclusivamente degli organismi eucarioti. È circondato da una membrana

nucleare a doppio strato che presenta dei pori attraverso cui avvengono gli scambi con la cellula. Il

nucleo contiene il DNA, che è condensato su proteine strutturali, gli istoni, a formare la cromatina.

Il nucleolo, che può essere uno o più di uno, è una struttura spugnosa di ammassi di cromatina.

Osservando il nucleo al microscopio, si notano alcune zone più scure e altre più chiare: sono i

territori cromosomici, ovvero i cromosomi occupano delle zone precise nel nucleo a seconda della

loro funzione e delle proteine che li codificano.

La cromatina si può dividere in due tipi: l’eterocromatina è quello più addensata, mentre

l’eucromatina è quella meno condensata, cioè quella che deve essere letta. Dunque, i cromosomi

hanno una posizione determinante nel nucleo anche perché l’eterocromatina di tutti i cromosomi è

agganciata alla membrana nucleare grazie ad una lamina. Nel nucleo si trovano anche proteine

particolari, come i corpi PML, siti di accumulo di fattori di trascrizione e proteine che modificano la

cromatina, e i corpi di Cajal, che contengono coilina e fattori per la maturazione dell’mRNA. Il

nucleo tende ad essere rotondeggiante, ma segue anche la forma della cellula; di solito ha posizione

centrale, a meno che il citoplasma non sia occupato da altro materiale.

In genere, ogni cellula ha il suo nucleo. Può essere, però, che una cellula abbia più nuclei o non ne

abbia affatto. Gli eritrociti dei mammiferi, ad esempio, non hanno nuclei; le cellule del muscolo

scheletrico, invece, vengono da un sincizio quindi sono plurinucleate. Anche i megacariociti, che

vivono nel midollo osseo e producono piastrine, sono plurinucleati perché queste cellule sono molto

grandi, quindi il nucleo si divide per controllare meglio tutte le porzioni di citoplasma. Il nucleo si

può spostare grazie al citoscheletro, ad esempio le cellule che si spostano con movimento ameboide

lo posizionano nella parte posteriore. In particolare i microtubuli, che partono dal centrosoma

(molto vicino al nucleo) si attaccano alla membrana nucleare e permettono lo spostamento del

nucleo con l’aiuto dei filamenti intermedi.

L’involucro nucleare è in continuità con il reticolo endoplasmatico rugoso, deputato alla sintesi

delle proteine. Infatti, troviamo i ribosomi anche sulla membrana nucleare esterna. La sintesi

dell’RNA ribosomiale è compito del nucleolo, che dunque è particolarmente evidente nelle fasi di

intensa sintesi proteica.

Addensate all’involucro nucleare ci sono, come abbiamo detto, masserelle di eterocromatina; se la

quantità di eterocromatina è minore di quella di eucromatina, è detta costitutiva e si parla di nucleo

eucromatico.

I pori nucleari hanno una struttura molto complicata: sono formati da otto proteine globulari sia

all’interno che all’esterno legate con elementi di raccordo o proteine di ancoraggio alla membrana.

Verso l’interno, queste proteine formano una struttura detta canestro e, sempre internamente, si

trova una proteina adibita al passaggio delle molecole più grandi, come proteine e RNA. Adibite al

passaggio di sostanze dentro e fuori dal nucleo, troviamo due tipologie di proteine: le importine

fanno passare le sostanze nel poro dall’esterno verso l’interno, le esportine fanno passare le

sostanze nel poro dall’interno verso l’esterno. La sequenza di localizzazione nucleare (NLS) è una

sequenza necessaria che la sostanza in entrata nel nucleo deve avere, in quanto controllata dalle

importine. La sequenza di esportazione nucleare (NES), analogamente, è una sequenza necessaria

che la sostanza in uscita dal nucleo deve avere, in quanto controllata dalle esportine. Le importine e

le esportine sono sempre associate alle G-proteins.

La matrice del nucleo è data da proteine filamentose che vanno a costituire una specie di

citoscheletro del nucleo (il nucleoscheletro) che ordinano la cromatina. La lamina nucleare, formata

da filamenti intermedi, si appoggia alla parte interna della membrana nucleare e si connette con la

cromatina. Durante la mitosi, l’involucro nucleare si deve disgregare, quindi i filamenti intermedi

della lamina vengono depolimerizzati. Nell’immagine che segue, la figura A è un’immagine al

microscopio ottico di cellule con nuclei a cromatina finemente dispersa; le figure B e C, invece,

sono immagini al microscopio elettronico a trasmissione di un nucleo rotondeggiante e poco

eterocromatico di un linfocita (B) e di un nucleo segmentato e poco eterocromatico di un

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Giorgia Palladino

granulocita (C). In particolare, la cromatina è molto più condensata nelle cellule più specializzate,

che condensano sotto forma di eterocromatina i geni che non serviranno più.

L’eterocromatina comprende regioni di DNA che non sono più, o non sono state mai, trascritte. Le

parti non più trascritte derivano da una differenziazione della cellula, perché quando si differenzia

inattiva i geni non specifici; per questo è detta eterocromatina facoltativa. Quella, invece, che non è

mai stata letta è l’eterocromatina costitutiva, cioè regioni di DNA che la cellula non trascrive perché

non contengono geni codificanti e presentano anche DNA altamente ripetuto; ad esempio, fanno

parte dell’eterocromatina costitutiva i telomeri, il centromero e le zone non codificanti con funzione

strutturale.

I cromosomi sono visibili solo in mitosi perché di solito non sono condensati; nell’uomo, ad

esempio, sono 46 molecole di DNA a doppia elica formate da un unico cromatidio. Durante la

mitosi, invece, il DNA si duplica prima della divisione per cui ogni cromosoma è formato da due

cromatidi.

Abbiamo visto che, per formare la cromatina, il filamento di DNA viene associato agli istoni.

Queste proteine sono di cinque tipi: H1, H2A, H2B, H3 e H4; tutte tranne l’H1 (con H = istone)

sono presenti nel nucleosoma. Il nucleosoma, dunque, è costituito da un istone attorno a cui il DNA

si avvolge per quasi due giri (la parte centrale degli istoni viene detto ottamero). Con l’aggiunta

dell’H1, i vari nucleosomi si collegano tra loro e si addensano in una struttura molto compatta a

forma di solenoide. Gli istoni sono molecole molto piccole perché devono occupare il minor spazio

possibile e basiche; dunque organizzano il DNA nel nucleo (diametro DNA = 2 nm, lunghezza del

filamento = 198 cm nell’uomo). La cromatina si può addensare ulteriormente ma in questa

condizione non può essere trascritta (ad esempio negli spermatozoi, dove deve solo veicolare

l’informazione). In questo caso, si compatta ancora di più sulla lisina e sull’arginina, due

amminoacidi più piccoli e più basici degli istoni, che si associano con legame ionico all’acido

deossiribonucleico. Per ogni nucleosoma e filamento di collegamento, abbiamo 200 nucleotidi, di

cui 50/54 nel tratto di collegamento a cui si associa l’istone H1 e 150/146 sul nucleosoma. I

filamenti di cromatina formano poi delle anse, che si impacchettano ancora di più quando si

spiralizzano i cromosomi.

Il nucleolo, che come abbiamo visto è il responsabile della sintesi dell’rRNa e della sua

maturazione, è formato da tre componenti: il centro fibrillare, la componente fibrillare densa e la

componente granulare. Quindi, il volume che occupa il nucleolo ci dà un’idea di quanta sintesi

proteica stia compiendo la cellula in un determinato momento.

Attività del nucleo

Abbiamo detto che il nucleo è alla base del flusso di informazioni; qui, infatti, abbiamo la

trascrizione dei vari RNA: l’mRNA, che porta il messaggio per la sintesi proteica, il tRNA e

l’rRNA, che regolano la sintesi delle proteine, e il snRNA (small nuclear RNA), che traduce DNA

non codificante con funzioni varie, ad esempio la regolazione.

Nei procarioti, la sintesi dell’mRNA è subito seguita dal suo utilizzo, perché questo entra subito in

contatto con i ribosomi. Negli eucarioti, invece, tutti gli RNA subiscono una modificazione nel

nucleo prima di essere utilizzati.

Il dogma centrale della biologia molecolare dice che:

1. Il DNA mantiene l’informazione genetica e la trasmette alle generazioni successive (quindi è

anche una molecola in grado di autoripararsi)

2. L’informazione viene trascritta nell’RNA

3. L’RNA viene tradotto in proteina

4. Le proteine eseguono e controllano le funzioni cellulari

Con la trascrittasi inversa, si va contro quest’ordine perché si passa dall’RNA al DNA; inoltre,

esistono rari casi in cui è lo stesso RNA a duplicarsi.

Possiamo quindi definire il prodotto di un gene come un RNA funzionale.

Il DNA è un polimero di molti monomeri detti nucleotidi, che sono posti in una catena filamentosa

con le estremità diversificate. L’informazione è dalla sequenza di quattro basi azotate che

61  

Giorgia Palladino

caratterizzato quattro diversi nucleotidi; l’accrescimento della catena avviene solo in una direzione

e senza ramificazioni. L’informazione genetica è contenuta nella doppia elica in doppia copia, in

quanto le due eliche sono complementari; così, se una delle due viene danneggiata, la molecola può

essere riparata e l’informazione trasmessa.

Le basi azotate si dividono in puriniche, costituite da un doppio anello eterociclico e sono adenina e

guanina, e pirimidiniche, costituite da un singolo anello eterociclico e sono timina e citosina. Il

legame tra le basi può avvenire solo tra una purina e una pirimidina e, in particolare, solo tra

adenina e timina e tra guanina e citosina. Le due eliche sono antriparallele.

Watson e Crick hanno descritto per primi la struttura del DNA nel 1953, grazie alle cristallografie

in lastra della scienziata Rosalind Franklin, a cui le sottrassero di nascosto e che non ricevette alcun

riconoscimento, per cui cadde in depressione e morì giovane di cancro. La doppia elica ha

implicazioni importanti per quanto riguarda il mantenimento nella riparazione e nella trascrizione di

un RNA a singolo filamento.

La duplicazione del DNA

Al momento della duplicazione della doppia elica, si formano delle bolle di duplicazione in più

punti detti punti di origine della duplicazione (nella fase S), ovvero dove si comincia la

duplicazione del DNA. Quando tutte le bolle si saranno ampliate fino ad unirsi, il DNA sarà stato

duplicato. Si dice che la duplicazione del DNA è semiconservativa perché, in ogni nuova doppia

elica, troviamo un filamento di nuova sintesi e un filamento vecchio; la duplicazione è un processo

con un tasso di mutazioni bassissimo, circa una ogni miliardo di nucleotidi. Questa sintesi aggiunge

nucleotidi in modo che il filamento nuovo sia complementare a quello vecchio e avviene sempre in

direzione 5’-3’. I due gruppi

P

P P fosfati più

Base azotata esterni vengono

persi insieme

all’idrogeno del

gruppo ossidrile,

in modo da

OH ricavare

l’energia per il

P legame tra

P P Base azotata l’ossigeno del

gruppo ossidrile

e il gruppo

fosfato rimasto

OH 62  

Giorgia Palladino P P P Base azotata

O P Base azotata

OH

Dei due filamenti, quello che corre in direzione 5’-3’ è copiato direttamente, mentre quello

antiparallelo viene copiato in pezzi, detti frammenti di Okazaki, che alla fine del processo vengono

ricollegati.

Dato che la DNA-polimerasi riesce solo ad allungare un filamento pre-esistente, non può fare una

sintesi ex novo del nuovo filamento. Quindi, l’RNA-polimerasi, detta anche primasi, sintetizza un

pezzo di RNA nel punto di origine della duplicazione, a cui si attaccherà la DNA-polimerasi.

Questo pezzo di RNA iniziale verrà sostituito con i nucleotidi del DNA alla fine del processo,

quando i frammenti di Okazaki verranno legati con la DNA-ligasi. Per aprire la doppia elica nella

bolla, l’elicasi scioglie i legami a idrogeno e, man mano che questi si aprono, altre proteine

impediscono a questi legami di riformarsi prima della fine della sintesi. Ogni 10 nucleotidi, un tipo

particolare dell’enzima topoisomerasi, detto girasi, taglia uno dei due filamenti, gli fa fare un giro

sull’altro e lo rilega, in modo che il filamento, con l’allargarsi della bolla, non si attorcigli

ulteriormente impedendo la duplicazione.

Il problema delle estremità

Nel filamento lento, un pezzo di elica, alla fine, non viene mai trascritto perché la RNA-polimerasi

non trova un primer (sequenza di riconoscimento per l’RNA-polimerasi) a cui attaccarsi; quindi,

questo filamento tenderà ad accorciarsi sempre di più. Questo problema si può risolvere con la

telomerasi, un enzima che aggiunge all’estremità lenta delle sequenze ripetute di nucleotidi in modo

che i geni funzionali non vengano intaccati. Questo DNA ripetuto viene ripiegato e si associa a

proteine che lo compattano, formando il telomero. L’enzima telomerasi è espresso nell’adulto solo

nelle cellule staminali, mentre le cellule già specializzate hanno un numero limitato di replicazioni

prima di intaccare il DNA codificante, provocando la morte della cellula. Le cellule tumorali, ad

esempio, sono in grado di attivare la telomerasi, per cui compiono infiniti cicli vitali.

Ma quale conseguenza può avere un accorciamento del telomero tale da non poter produrre le

proteine per ripiegarsi su se stesso, anche senza andare ad intaccare l’informazione genetica? Dato

che i due filamenti dell’elica sono complementari, anche i telomeri lo saranno e, se non sono

ripiegati, diventano estremità appiccicose e possono saldarsi. La chiusura della doppia elica viene

identificata dalla cellula come un danno, per cui viene bloccato il ciclo cellulare.

Considerando che il DNA si duplica con una velocità compresa tra 0,3 e 4,7 kb (kilo basi) al

minuto, quanto tempo ci vorrebbe se esistesse una sola polimerasi per tutti i cromosomi? Allora,

sappiamo che la velocità è di 300/4700 coppie di basi al minuto e che in totale, nell’uomo, ci sono

÷

6,4 miliardi di paia di basi. Quindi, se ci fosse una sola polimerasi, ci vorrebbe (6’400’000’000

4’700) = 1’361’702,128 minuti, cioè (1'361'702,128 ÷ 60) = 22’695,035 ore, cioè (22'695,035 ÷ 24)

= 945,626 giorni, ovvero (945,626 ÷ 365) = 2,59 anni, praticamente due anni e mezzo per una sola

duplicazione. Questo vuol dire necessariamente che sono esistono e sono attive più polimerasi per

ogni cromosoma. In particolare, abbiamo in media 2960 DNA-polimerasi attive al minuto per ogni

cromosoma. 63  

Giorgia Palladino

La riparazione del DNA

La riparazione del DNA è un processo diversificato a seconda del tipo di danno ed è diverso tra

procarioti ed eucarioti; in questi ultimi coinvolge enzimi utilizzati anche per altri fini, il DNA è più

lungo e il sistema di regolazione è integrato con delle proteine, per cui il processo di riparazione è

più complicato. La cellula che non riesce a riparare il danno del DNA va incontro a morte per

apoptosi o senescenza.

In generale, la cellula riesce a riparare il danno se questo non è troppo esteso. In caso contrario o la

cellula non lo ripara e muore, oppure lo ripara ma in una modalità che può portare a degli errori; di

solito, però, la cellula preferisce la morte piuttosto che una riparazione errata, perché questa può

portare ad una mutazione cancerogena. Lo stesso agente, inoltre, può causare più modalità di danno

al filamento di DNA. Gli enzimi di riparazione percorrono il filamento per controllare eventuali

errori dato che per la riparazione bisogna sintetizzare più enzimi.

Ad esempio, il danno da radiazione ultravioletta lega due timine adiacenti anziché alla base azotata

corrispondente. Il tipo di riparazione va a rimuovere tutta le regione intorno alle due timine (circa

12 nucleotidi) e poi la ricostruisce, sintetizzando nuovo DNA.

Malattie molto gravi, invece, sono dovute a mutazioni ereditarie dei geni della riparazione, perché

tale mutazione va a colpire anche i geni coinvolti nella regolazione genica e nella produzione di

DNA.

Origine dei danni al DNA

Abbiamo visto che, durante la duplicazione, si incorre in circa un errore ogni miliardo di paia di

basi. È una percentuale molto bassa ma, considerando che il genoma umano conta 6,4 miliardi di

basi, le mutazioni sono comunque una realtà piuttosto concreta. Abbiamo due tipi di possibile

origine dei danno al DNA:

Danni spontanei:

• Errori nella replicazione; questi errori sono dovuti al fatto che le basi azotate hanno forme

- tautometriche (cioè molto simili), quindi la DNA-polimerasi può legare ad una base azotata

un’altra che non è la sua complementare. La stessa polimerasi, però, può correggere subito

l’errore perché i nucleotidi devono passare attraverso un’apertura della polimerasi su misura

per ogni base azotata, per cui se la base è quella sbagliata la polimerasi torna indietro e la

corregge.

Deaminazione; determina la formazione di uracile con rilascio di ione ammonio a partire

- dalla citosina, che si trasforma in 5-metilcitosina. L’appaiamento errato può essere

riconosciuto e riparato da particolari sistemi di riparazione; in particolare, specifiche

glicosilasi riconoscono questo nucleotide che non è comune nel DNA e lo sostituiscono con

la citosina. Se l'errore non viene riparato entro la successiva replicazione del DNA le nuove

molecole di DNA sintetizzate avranno inserite una mutazione non più eliminabile.

Depurinazione o, comunque, perdita di una base;

- Danno ossidativo

-

Agenti mutageni:

• Analoghi delle basi

- Ossidanti

- Alchilanti

- Intercalanti

- Radiazione ultravioletta

- Radiazioni ionizzanti

-

Tutti questi agenti mutageni son usati nelle terapie contro il cancro, come radioterapia e

chemioterapia, perché danneggiano la duplicazione delle cellule cancerose, ma anche di quelle

sane.

Vediamo ora i complessi, e ridondanti, sistemi di rilevazione del danno al DNA: 64  

Giorgia Palladino

1. I sensori attivano le molecole di segnalazione

2. Le molecole di segnalazione attivano i sistemi di riparazione

3. I sistemi di riparazione localizzano le proteine nella zona da riparare

4. I sistemi di riparazione attivano la proteina p53, che può anche legarsi in maniera autonoma al

DNA danneggiato

5. p35 è responsabile del blocco della progressione del ciclo cellulare, dell’attivazione di sistemi di

riparazione e dell’attivazione del meccanismo di apoptosi in caso di mancata riparazione

La trascrizione del DNA

La trascrizione è la modalità con cui l’informazione passa dal DNA all’RNA e, nei procarioti, è

relativamente semplice. Sul filamento di DNA troviamo un promotore, cioè una sequenza di basi

che fungono da attacco all’RNA-polimerasi in una direzione precisa. Un fattore σ riconosce parte

del promotore e richiama l’RNA-polimerasi, che apre il filamento (allo stesso modo dell’elicasi) e

trascrive uno dei due filamenti. Alla fine del gene, abbiamo una sequenza di stop (o si forma

un’ansa, o si richiede la presenza di un fattore di terminazione) e la trascrizione finisce.

Negli eucarioti il meccanismo è più complesso perché aumenta il numero di fattori di trascrizione e

perché il promotore ha una regione centrale molto più ampia. A questo promotore si lega l’RNA-

polimerasi grazie a diversi fattori basali caratteristici del promotore (nell’immagine, in blu). Altri

fattori riconoscono la regione che deve essere trascritta aumentando la frequenza della trascrizione.

Altri fattori (in rosso) sono invece attivatori che si legano in maniera specifica e che si possono

legare vicino alla zona del promotore o anche molto lontani. Negli eucarioti, ci sono tre diverse

RNA-polimerasi: una per l’RNA ribosomiale, una per l’RNA messaggero e una per l’RNA di

trasporto (o transfer). Quasi tutti gli RNA di regolazione son tradotti dalla polimerasi del tRNA,

pochi dalla polimerasi dell’rRNA. La differenza tra le varie polimerasi dipende dalle subunità

(molecole complesse) e da diversi fattori basali che riconoscono il promotore, che a sua volta è

diverso a seconda della polimerasi. I fattori specifici, invece, riconoscono brevi sequenze dette

elementi risposta. I fattori di trascrizione agiscono in combinazione, quindi ne basta un numero

limitato. Inoltre, nella trascrizione entra in gioco come fattore anche lo stato della cromatina, cioè il

suo grado di compattazione.

La mutazione dell’RNA

I geni per la trascrizione dell’RNA sono moderatamente ripetuti, ovvero presenti in qualche

centinaia di copie; infatti, se ce ne fosse solo uno, avvenuta una mutazione il gene non sarebbe più

in grado di codificare per l’RNA e, dunque, la cellula non sarebbe più in grado di sintetizzare

proteine.

L’RNA precursore viene tagliato da processi nel nucleo composti da RNA e proteine e, inoltre,

compie un processo autocatalitico di autosplicing, per cui delle regioni vengono tagliate e il resto

viene saldato.

Vediamo in particolare le fasi del tRNA:

i geni che codificano per l’RNA sono moderatamente ripetuti e disposti a tandem, cioè uno dietro

• l’altro, separati da tratti di collegamento non codificante

il livello di trascrizione dipende dalle necessità della cellula

• dopo la sintesi, il precursore viene processato da un complesso costituito da proteine e piccoli

• RNA (processosoma)

il precursore viene tagliato in più parti

• alcuni tratti vengono rimossi

• alcune basi vengono metilate

• gli RNA si ripiegano assumendo una struttura secondaria con tratti a doppia elica

• seguono ulteriori modificazioni di basi e/o ulteriori tagli, ecc

Per quanto riguarda l’rRNA il procedimento è lo stesso, ma alla fine le proteine ribosomiali si

assemblano spontaneamente in un preciso ordine, associandosi tra loro e con gli rRNA. 65  

Giorgia Palladino

La trascrizione, come abbiamo detto, è effettuata dalla RNA-polimerasi e possiamo vedere questo

processo al microscopio come la forma di un albero di natale: il filamento di DNA costituisce il

tronco, gli ingrossamenti del filamento sono le unità di RNA-polimerasi 1 e sui rami le proteine si

associano all’RNA in caso di sintesi per organizzarlo.

L’mRNA, invece, subisce la maturazione solo negli eucarioti. Questo viene trascritto a partire dal

DNA ma è più lungo del necessario, perché il filamento originale contiene anche parti non

codificanti. Quindi, l’RNA viene tagliato e alle due estremità vengono aggiunte delle modificazioni

per renderlo più stabile: all’estremità 5’ viene messo il cosiddetto Cap, una guanina rovesciata in

modo che dal filamento non sporgano gruppi fosforici reattivi; all’estremità 3’, invece, vengono

aggiunti circa 200 nucleotidi di adenina, a formare la coda poli-A. Le sequenze che corrispondono

agli introni vengono tagliate e gli esoni saldati tra loro in un processo detto splicing. All’estremità

5’, inoltre, viene aggiunta una regione UTR (untraslated region) di regolazione, che controlla la

facilità con cui il ribosoma riconosce il messaggero per iniziare la traduzione.; ad esempio, ci

possono essere dei fattori che bloccano temporaneamente la traduzione se non necessaria. La coda

poli-A, invece, si lega a proteine che favoriscono il mantenimento della coda, che regola il numero

di volte in cui l’mRNA può essere tradotto.

La traduzione dell’RNA

Gli eucarioti, rispetto ai procarioti, hanno ribosomi più grandi; inoltre la traduzione ha un tasso di

errore maggiore che la duplicazione del DNA in quanto, se si modifica un amminoacido in una

proteina, questa non sarà funzionale, ma comunque si ha la possibilità di tradurne altre; se, invece,

viene mutato un filamento di DNA, tutte le proteine di quel gene non potranno più essere codificate.

4

Tale tasso di errore rimane comunque piuttosto basso, circa un errore ogni diecimila (10 )

amminoacidi. La velocità della traduzione è paragonabile a quella della trascrizione: circa 3

amminoacidi per secondo negli eucarioti, circa 20 per secondo nei procarioti.

L’RNA messaggero, costituito dalla sequenza nucleotidica, si lega al ribosoma con l’estremità 5’ e

poi le due subunità ribosomiali si chiudono sul filamento stesso; questa è la fase di inizio. In

seguito, il ribosoma comincia a catalizzare l’unione degli amminoacidi: ognuno è aggiunto alla

catena preesistente perché il suo gruppo amminico (N) si lega al gruppo carbossilico (C) dell’ultimo

à à

amminoacido della catena (N C corrisponde, sul filamento, 5’ 3’). La sequenza primaria di

amminoacidi che si forma determina la struttura della proteina e, come abbiamo visto, dipende dalla

sequenza di basi dell’mRNA. Il filamento, infatti, viene letto a triplette, ovvero tre nucleotidi

codificano per un amminoacido (dato che gli amminoacidi sono 20, se ogni nucleotide codificasse

per un amminoacido ne dovremmo avere solo 4, se due nucleotidi codificassero per un

2

amminoacido dovremmo avere 4 , cioè 16, amminoacidi; quindi, per forza, avremo tre nucleotidi

3

che codificano per un amminoacido ma con sovrabbondanza, perché abbiamo 4 , cioè 64,

combinazioni possibili).

Questo processo si chiama traduzione perché si passa dal linguaggio dei nucleotidi a quello degli

amminoacidi. Sul tRNA troviamo una zona detta anticodone che è complementare alla tripletta di

nucleotidi sull’mRNA, detta codone; a questo anticodone corrisponde l’amminoacido specifico per

il codone; tale amminoacido si lega al tRNA e il tRNA, a sua volta, lega il suo anticodone al codone

specifico nel sito catalitico per il legame peptidico, che è il ribosoma. Questo organulo, che ha un

diametro che va da 200 a 450 nm, è costituito da due subunità, una maggiore e una minore e, al suo

interno, è organizzato in modo da presentare tre siti specifici: il sito P, peptidico o donatore, in

mezzo, il sito A, amminoacidico o accettore, a destra, e il sito E, exit, a sinistra. La prima tripletta

dell’mRNA, che corrisponde sempre all’amminoacido metionina (che verrà rimosso alla fine la

maggioranza delle volte), si posiziona nel sito P e il transfer corrispondente si lega al codone e porta

l’amminoacido metionina. Il secondo codone, invece, si lega al sito A e aspetta che il transfer

corrispondente porti il secondo amminoacido. Una volta effettuato questo processo, il primo e il

secondo amminoacido si legano: il transfer del sito A, che ora porta l’inizio della catena peptidica,

si sposta nel sito P, e il transfer del sito P, ora vuoto, si sposta nel sito E e viene espulso dal

ribosoma. Questo procedimento si ripete fino alla lettura completa dell’mRNA, per cui si

66  

Giorgia Palladino

troveranno alla fine del filamento uno o più codoni di stop a cui corrispondono, anziché un transfer,

dei fattori di rilascio. In tutto il processo troveremo sempre la catena peptidica in formazione nel

sito P, il nuovo amminoacido nel sito A e il transfer che deve uscire nel sito E.

Il tRNA ha una forma ripiegata a quadrifoglio, per cui l’anticodone riconosce la tripletta

sull’mRNA, mentre l’estremità 3’ porta l’amminoacido.

Vediamo come avviene il legame peptidico tra i due amminoacidi adiacenti:

H R H R H R O H R

1 2 1 2

O O O

N C C N C C N C C N C C

OH OH OH

H H H H H H H H

Quando, invece, l’amminoacido si lega con il transfer all’estremità 3’, il gruppo ossidrile si lega al

tRNA in un legame ad alta energia. Nel momento il cui il transfer deve lasciare l’amminoacido

perché questo si deve legare a quello adiacente, viene liberata l’energia di legame tra

l’amminoacido e il transfer e verrà utilizzata per legare i due amminoacidi.

La fase di inizio è un po’ diversa da quella di allungamento perché il primo amminoacido, la

metionina, non è, da sola, una catena peptidica, ma comunque si va a legare al sito P. Ogni

passaggio da un sito all’altro, essendo un movimento meccanico, richiede energia, che è fornita dal

GTP; ci vorranno quindi dei fattori che permettano lo scorrimento scindendo il GTP in GDP per

ricavare energia.

Il codice genetico

Il primo passo verso la decodificazione è stato compiuto nel 1961 dai biochimici Marshall W.

Nirenberg e J. Heinrich Matthaei. Delle 64 triplette possibili, tre sono codoni di stop, mentre 61

sono quelli a cui corrisponde un amminoacido. Gli amminoacidi più frequenti, quindi, saranno

codificati da più codoni. Vediamo le caratteristiche del codice genetico:

È un codice a tre lettere, ovvero si legge a gruppi ordinati di tre nucleotidi

• È senza sovrapposizione, cioè non esistono due amminoacidi codificati dalla stessa tripletta

• Senza interpunzioni, cioè non ci sono segnali di stacco tra una tripletta e l’altra

• Non ambiguo, cioè ogni tripletta codifica per un solo amminoacido

• Ridondante e degenerato, cioè più triplette codificano per lo stesso amminoacido

• Universale, cioè le stesse triplette codificano per gli stessi amminoacidi in tutti gli organismi, se

• non per alcune eccezioni come nei mitocondrio dei vertebrati

Le mutazioni della porzione codificante dell’mRNA

Esistono vari tipi di mutazioni che interessano il filamento di mRNA, che alterano la sequenza della

proteina che dev’essere sintetizzata:

Sostituzione di una base azotata; cioè al posto di una base l’RNA-polimerasi ne pone una

• sbagliata. Questa sostituzione può dare origine a tre tipi di mutazione:

à

mutazione senza effetti sulla sequenza amminoacidica ad esempio nel codone GGC, che

- codifica per la glicina (Gly), la citosina viene sostituita con l’uracile e il codone diventa

GGU; grazie alla degenerazione del codice genetico, però, anche il codone GGU codifica

per la glicina, quindi non si avranno mutazioni significative nella catena peptidica

à

mutazione “missense” ad esempio nel codone GGC, che codifica per la glicina (Gly), la

- prima guanina viene sostituita con l’adenina e il codone diventa AGU; questo nuovo

codone, però, codifica per la serina (Ser), modificando l’organizzazione della catena

67  

Giorgia Palladino

peptidica. La gravità di questa mutazione dipende dal tipo di proteina su cui avviene e in

che posizione à

mutazione “nonsense” ad esempio nel codone AAG, che codifica per la lisina (Lys), la

- prima adenina viene sostituita con l’uracile e il codone diventa UAG; questo nuovo

codone, però, è un codone di stop, quindi la sintesi della proteina verrà interrotta prima che

giunga al termine, creando una catena polipeptidica non funzionale

Inserimento o delezione; cioè vengono inserite o eliminate una o più basi all’interno del filamento.

• Queste mutazioni possono dare origine a tre diverse situazioni:

à

delezione o inserimento di una base la lettura a triplette viene scombinata, cambiando la

- sequenza amminoacidica lungo l’intera catena à

delezione o inserimento di una base formando un codone di stop se la base aggiunta o

- eliminata fa si che si formi un codone di stop, la traduzione della proteina sarà interrotta

prima del suo completamento, formando una catena polipeptidica non funzionale

à

delezione o inserimento di tre nucleotidi se vengono aggiunti o eliminati tre nucleotidi,

- la lettura a codoni sarà sfasata solo per il tratto che li comprende

La sintesi proteica

Abbiamo visto che, una volta trascritto e dopo la sua maturazione, il filamento di mRNA si attacca

con l’estremità 5’ al ribosoma incaricato a tradurlo in proteina. Però, una volta che questo ha

iniziato la sua traduzione, molti altri ribosomi si attaccano allo stesso filamento di mRNA e

cominciano simultaneamente la sua traduzione; man mano che ogni ribosoma completa il tratto da

tradurre, le due subunità si staccano. Questa struttura viene detta sintesi proteica a livello di

poliribosomi.

Negli eucarioti, durante la traduzione l’mRNA si chiude ad anello grazie alla coda poli-A: ogni 12

adenine si lega una proteina, detta PAB, che prende contatto con dei fattori d’inizio, come eIF4E e

eIF4G, che sono legati alla testa incappucciata dell’mRNA. Questa struttura ad anello protegge

l’mRNA dalla degradazione perché la coda poli-A si accorcia gradualmente e, quando diventa

troppo corta, non riesce più a legare la PAB e il filamento viene degradato.

Compartimenti cellulari

All’interno dei compartimenti cellulare si localizzano e completano le biogenesi. Ad esempio le

proteine, una volta sintetizzate, devono assumere la loro forma definitiva: alcune lo fanno da sole,

altre necessitano di proteine di sostegno dette chaperon. Le modificazioni post-traduzionali della

proteina sono fondamentali perché questa assuma la sua forma definitiva; ad esempio, i ponti

solfuro si devono formare in un ambiente ossidante, che si trova esternamente alla cellula,

nell’apparato di Golgi e nel reticolo endoplasmatico, perché l’ambiente citoplasmatico è riducente.

Vediamo quali processi sono coinvolti nella regolazione della proteina:

Modificazioni post-traduzionali irreversibili; sono effettuate prima del raggiungimento della forma

• definitiva e servono a rendere la proteina funzionale

Modificazioni reversibili che ne regolano l’attività; ad esempio la scissione del GTP in GDP, sono

• cambiamenti non permanenti

Sede di sintesi; dove avviene la biogenesi della proteina

• Localizzazione finale; le sequenze di localizzazione e smistamento presenti su ogni proteina

• indicano la sede finale della proteina stessa

Degradazione; può essere mirata ad eliminare alcune proteine perché la cellula, in quel

• determinato stadio, non ne ha bisogno

Tutti i compartimenti cellulari sono legati tra loro dal traffico di vescicole; vediamo in particolare il

nucleo, il reticolo endoplasmatico (ER), i perossisomi, l’apparato di Golgi e i lisosomi.

Il reticolo endoplasmatico 68  

Giorgia Palladino

Il reticolo endoplasmatico ruvido o rugoso (RER) è costituito da sacche fitte e organizzate sulla cui

superficie si trovano i ribosomi che sintetizzano le proteine. Il reticolo endoplasmatico liscio (REL),

invece, è formato da tubuli sottili non organizzati ed è implicato in attività specifiche, ad esempio la

lipogenesi. È anche impiegato, ad esempio, nella regolazione del metabolismo (flusso) del calcio

assieme ai mitocondri (abbiamo già visto il reticolo sarcoplasmatico nella contrazione muscolare).

Dei simporti, degli antiporti (col sodio) e dei canali controllati dal voltaggio del calcio lo

trasportano dal citoplasma all’interno del reticolo, perché la concentrazione citoplasmatico di questo

ione deve essere molto più bassa che all’esterno della cellula ; infatti, nel citoplasma, ci sono

proteine che si legano al calcio e sono regolate da esso.

Il ER presenta, al centro, un canale del calcio che lo rilascia quando arriva lo stimolo nervoso; un

altro canale è invece regolato da segnali che arrivano sulla superficie cellulare, per cui ad esempio

la pompa del calcio richiama lo ione all’interno del reticolo. Una volta all’interno, sono gli

chaperon che legano più ioni calcio insieme.

Il REL è anche coinvolto nel metabolismo del glicogeno, soprattutto nella cellula epatica, perché

quando il livello di glucosio è troppo alto questo viene segnalato dall’insulina e il reticolo lega e

accumula glicogeno (che è organizzato sotto forma di agglomerati di forma irregolare).

Il REL è implicato anche nella sintesi dei lipidi, dagli ormoni steroidei ai lipidi di membrana, che

sono portati sul versante citoplasmatico e, una volta aggiunti, vengono ribaltati dagli enzimi flippasi

e floppasi; questo fa si che i lipidi non si accumulino solo da una parte della membrana e che la

distribuzione non sia omogenea. Mentre le code possono essere associate a qualsiasi teste, le teste

fosfolipidiche son sintetizzate in compartimenti specifici; inoltre, la composizione dei lipidi non è la

stessa in tutte le membrane.

Ma come si è scoperto in che modo le proteine vengono inserite nella membrana? Si sapeva che la

loro sintesi avveniva sui ribosomi, polimerizzando amminoacidi. Allora, alla cellula veniva dato,

per un breve periodo, un amminoacido radioattivo, e subito dopo dosi abbondanti di

quell’amminoacido normale. In questo caso, fu inserita la leucina, molto comune, che si integrava

nella sua forma radioattiva con gli altri amminoacidi, e poi dosi di leucina normale. Si è osservato

che, inizialmente, la radioattività era a livello dei ribosomi associati al RER, poi lasciava tracce nel

Golgi, poi nelle vescicole di secrezione e, infine, sulla membrana o fuori dalla cellula. Dunque,

questo era l’ordine in cui si dovevano muovere le proteine intermembrana o quelle di secrezione.

L’apparato di Golgi

L’apparato di Golgi è un insieme di vescicole appiattite organizzate e si divide in tre regioni: quella

convessa, più vicina al nucleo, è la zona cis, quella di transizione è la regione intermedia e quella

concava, più lontana dal nucleo e da cui si staccano le vescicole è la zona trans. Queste vescicole

possono avere due destinazioni:

Membrana; le proteine intermembrana vengono trasportate sulla membrana plasmatica, mentre

• quelle di secrezione sono portate al di fuori della cellula a possono essere secrete in due modi.

Quelle a secrezione continua sono prodotte e secrete senza interruzioni e costituiscono le

componenti fondamentali della cellula, ad esempio il citoscheletro; l’esocitosi di quelle a

secrezione regolata è controllata da fattori esterni, da uno stimolo, a seconda della necessità

Vescicole che andranno a formare i lisosomi; queste vescicole contengono enzimi litici, con pH

• acido, che formeranno i futuri lisosomi

Il traffico di membrane

Dal RER si staccano delle vescicole che portano le proteine sintetizzate al Golgi cis, portandosi con

sé proteine navetta del reticolo che poi dovranno essere recuperate (movimento detto flusso

retrogrado dal Golgi al RER). Queste proteine navetta vengono riconosciute grazie a sequenze

specifiche e vengono rimandate dal Golgi al RER. Una volta nel Golgi, le proteine sintetizzate sui

ribosomi del RER vengono modificate definitivamente (la maggior parte viene glicosilata). Dal

Golgi cis passano alla regione trans, e questo passaggio è stato ipotizzato dagli studiosi in due modi

diversi ma, comunque, entrambi plausibili e che possono convivere: 69  

Giorgia Palladino

Secondo un’idea di Golgi statico, esso accoglie le membrane del reticolo, acquisendo membrana

• che perderà, a sua volta, sotto forma di vescicole che partono dal trans per le specifiche

destinazioni

Secondo un’idea di Golgi dinamico, a seconda del grado di maturazione delle proteine, ogni volta

• è l’ultimo comparto del reticolo rugoso che si trasforma in Golgi cis e poi, a sua volta, in trans,

che si sfalderà nelle vescicole che devono essere smistate

In ogni caso, una volta arrivate al Golgi trans, c’è un sistema che coordina la destinazione delle

proteine sia per la secrezione regolata o continua che per i lisosomi (essi possono compiere

endocitosi per digerire materiali all’interno della cellula oppure effettuare un’endocitosi per una

digestione esterna alla cellula, come fanno gli osteoclasti).

Ma come fa una vescicola a staccarsi dal suo compartimento? Si forma un esoscheletro provvisorio

che allunga una parte della membrana a formare un compartimento separato, che poi verrà tagliato.

Come abbiamo già visto, il trasporto di queste vescicole sui microtubuli è permesso dalle dineine in

direzione del centrosoma e dalle chinesine in direzione periferica. Le proteine G si occupano del

riconoscimento e della destinazione delle vescicole; queste, una volta giunte a destinazione, devono

riconoscere se sono arrivate al compartimento giusto e devono fondersi con esso.

Vari tipi di fusione delle membrane

Abbiamo sostanzialmente tre tipologie di formazione di vescicole per la digestione:

Fagocitosi; la membrana si ripiega su grosse particelle o detriti nucleari a formare una vescicola

• grande da portare all’interno del citoplasma. Questo comporta un rimaneggiamento del

citoscheletro da parte della cellula, fino a quando la vescicola non si fonderà con un lisosoma

primario il cui contenuto effettuerà una digestione

Endocitosi; è una specie di fagocitosi a livello microscopico; il citoscheletro si ripiega per formare

• una vescicola che conterrà piccole molecole o ioni. Questa è sempre mediata a recettori che si

trovano sulla membrana e che devono riconoscere la sostanza da portare dentro la cellula. La

vescicola neoformata si fonderà, poi, con più lisosomi primari, che formando un lisosoma

secondario

Autofagia; serve ad eliminare organuli, ad esempio mitocondri, danneggiati o non necessari. In

• questo caso, il REL forma una membrana attorno all’organulo che, poi, si fonderà ad un lisosoma.

Non è ancora chiaro come faccia il lisosoma a degradare la membrana dell’organulo e non quella

del reticolo, che separa il contenuto acido dal citoplasma. L’autofagia è un altro modo con cui la

cellula risponde alle richieste energetiche dell’organismo; al limite questo processo può portare

alla morte cellulare

Sede di sintesi delle proteine

Ci sono varie sedi di sintesi delle proteine, oltre al reticolo endoplasmatico, e ad ogni sede di sintesi

corrispondono una o più specifiche destinazioni delle proteine stesse:

Proteine sintetizzate nel citosol:

• solubili del citosol

- del citoscheletro

- legate al versante citosolico delle membrane con ancore lipidiche

- dei mitocondri e dei cloroplasti codificate dal gemoma nucleare

- dei perossisomi e dei gliossisomi

- del nucleo

-

Proteine sintetizzate nel reticolo endoplasmatico:

• integrali di membrana per la membrana plasmatica, il reticolo endoplasmatico, l’apparato

- di Golgi e i lisosomi

di secrezione, tra cui quelle della matrice extracellulare

- solubili residenti nel reticolo endoplasmatico

- enzimi lisosomiali

- 70  

Giorgia Palladino

Proteine sintetizzate nei mitocondri:

• codificate dal genoma mitocondriale

-

Proteine sintetizzate nei cloroplasti:

• codificate dal genoma del cloroplasto

-

Aspetti da considerare. Riassunto

Modificazioni post- e co-traduzionali hanno luogo in sedi specifiche

• Alle proteine sono associati segnali di localizzazione e smistamento

• Le proteine da introdurre nei mitocondri e nei cloroplasti necessitano di chaperon

• Per le proteine non sintetizzate nel RER, vi sono:

• segnali di ritenzione nello spessore della membrana, che determinano anche

- l’orientamento finale della proteina

complesse modalità di attuare e regolare la gemmazione delle vescicole

- segnali di indirizzo, spostamento, riconoscimento vescicola-membrana bersaglio, fusione

-

L’esocitosi può essere costitutiva o regolata

• Endocitosi, fagocitosi, formazione e attività dei lisosomi sono coordinate

• Degradazione delle proteine

Segnali di indirizzo e smistamento

Esistono vari segnali responsabili dello smistamento delle vescicole. Per quelle indirizzate al Golgi,

il segnale è ancora sconosciuto, così come quelli responsabili della secrezione continua o regolata.

Nei lisosomi, il segnale è il fosfo-mannosio. Nel RER, sono il KDEL e HDEL. Nel nucleo sono

sequenze interne riconosciute dalle importine e dalle esportine e sono l’NLS (per le importine) e

l’NES (per le esportine). Per le proteine che vanno nel nucleo, abbiamo anche la funzione di

regolazione della trascrizione (enhouncer e silencer). Tali proteine hanno le NLS coperte da un

inibitore o dalla struttura stessa della proteina e vengono esposte solo quando è necessaria la

trascrizione.

Chaperon, chaperonine e co-chaperon

Gli chaperon sono importanti nel ripiegamento delle proteine ma anche in altri ruoli:

Proteggere le proteine dai danni; entro certi limiti, i danni dovuti all’incapacità di ripiegare

• correttamente, al calore o allo stress ossidativo possono essere riparati dagli chaperon

Localizzazione di una proteina nei mitocondri; se la proteina è ripiegata, essa non riesce a

• penetrare la doppia membrana. Gli chaperon la mantengono in forma lineare per farla passare

nella matrice e ripiegarla una vota dentro. La proteina entra, quindi, prima nella matrice e, se è

destinata allo spazio intermembrana, torna indietro. Le proteine dette TIM e TOM sono chaperon

che collaborano per far passare altre proteine nei mitocondri.

Il mitocondrio, inizialmente, codificava per migliaia di proteine diverse; molti di questi geni

mitocondriali, però, sono poi stati trasferiti ai geni nucleari, infatti la maggioranza delle proteine

mitocondriali sono codificate dal nucleo. Comunque, il mitocondrio codifica per 13 proteine e, tra

l’altro, in modo instabile perché produce anche specie radicali dell’ossigeno che danneggiano il

DNA mitocondriale e provocano l’invecchiamento. Ma perché non cede anche questi geni? Perché

queste 13 proteine sono tutte proteine della membrana interna e non possono essere inserite se non

dall’interno, per cui non possono essere sintetizzate nel nucleo.

La sintesi proteica

Una volta sintetizzate le proteine del reticolo endoplasmatico, queste vanno in diverse direzioni.

La proteina nascente sporge dal ribosoma ed espone all’estremità amminica una sequenza

idrofobica segnale (SR). Questa è riconosciuta dalla particella che riconosce il segnale (SRP) a cui

si lega, impedendo il proseguimento della traduzione. Così, il ribosoma e la proteina vengono

spostate sul RER, dove si legano ad un traslocone; attraverso questo traslocone, la proteina entra

71  

Giorgia Palladino

nel reticolo man mano che si compie la sintesi. Una volta che la catena è completata, la sequenza

segnale viene tagliata.

Ma come vengono inserite le proteine integrali nello spessore della membrana?

L’inserzione delle proteine nella membrana del RER è, come abbiamo detto, mediata da una SRP

e dal suo recettore SR, che guida la formazione di un poro. Se la proteina deve passare solo una

volta all’interno della membrana, la sequenza segnale (in verde) è posta all’inizio della catena e si

ancora all’interno del poro. All’interno della catena si trova invece una sequenza di stop del

trasferimento (in rosso): la catena polipeptidica si inserisce all’interno del RER passando

attraverso la membrana fin quando il segnale di stop si trova alla stessa altezza della sequenza

segnale, all’interno del poro. Giunti a questo punto, la peptidasi del segnale taglia la sequenza

segnale per il RE e la catena si trova inserita nella membrana. Per quanto riguarda le proteine

multipasso, si susseguono in esse più sequenze segnale e più sequenza di stop trasferimento. Solo

la sequenza segnale localizzata all’estremità amminica viene tagliata dalla peptidasi.

Modificazioni post-traduzionali

Vediamo l’importanza delle modificazioni post-traduzionali:

Le proteine devono assumere un corretto ripiegamento per poter svolgere le loro funzioni; a volte

• tale ripiegamento è dilazionato per agevolare il trasporto in alcuni sub-compartimenti

Molte proteine subiscono modificazioni post-traduzionali; formano ponti di solfuro, proteolisi,

• assemblaggio in complessi polipeptidici, legami con àncore lipidiche…

Alcune modificazioni avvengono solo in sedi specifiche (ed esempio il RER e l’apparto del Golgi)

• Le proteine possono essere mal conformate a causa di un ripiegamento scorretto, a causa di un

• amminoacido scambiato oppure a causa di un gene mutato. Se non si riesce ad aggiustare l’errore,

la proteina viene eliminata grazie all’autofagia o ad altri mezzi. La risposta delle proteine non

piegate, detta UPR, cerca di aiutare il reticolo a liberarsi di queste proteine ma, se la cellula si

riempie di proteine mal conformate che non riesce ad eliminare, l’UPR attiva la morte cellulare

Vediamo un paio di esempi.

L’insulina matura è costituita da due catene legate da ponti disolfuro. In realtà, però, nasce come

catena unica e subisce una modificazione post-traduzionale irreversibile nel lume del RER. Qui,

infatti, si ripiega in modo che le due estremità avvicinino i siti in cui si formeranno i ponti disolfuro;

il resto della catena verrà quindi tagliato ed eliminato.

Per quanto riguarda le modificazioni post-traduzionali reversibili, invece, prendiamo come esempio

il gruppo fosforico aggiunto da una chinasi (fosforilazione) e che può essere rimosso da una

fosfatasi; queste modificazioni regolano l’attività di numerose proteine come il GTP o l’ATP.

I gruppi prostetici, invece, sono aggiunti alla proteina subito dopo la sintesi della proteina stessa, ad

esempio il gruppo eme dell’emoglobina e della mioglobina. I gruppi prostetici possono essere

inorganici (ioni metallici) o organici (biotina, eme, citocromi, cofattori).

Un altro esempio è la glicosilazione, con cui si intende una modificazione post-traduzionale di una

proteina che vede l'aggiunta di zuccheri (una catena o singoli carboidrati) alla catena peptidica. Ne

distinguiamo due tipologie in base al tipo di residui amminoacidici su cui può avvenire. La N-

glicosilazione vede l'aggiunta di una catena glucidica standard a livello dell'atomo di azoto di una

catena laterale di asparagina La N-glicosilazione ha inizio nel reticolo endoplasmatico rugoso a

.

carico di una catena peptidica ancora in corso di traduzione, con il trasferimento di un polisaccaride

dal dolicolo, e si completa nel Golgi. Qui, il mannosio di un residuo di Asn può essere fosforilato,

la glicosilazione completata diversamente e la proteina avviata verso il lisosoma.

La O-glicosilazione, invece, è un processo altamente specifico, che si svolge completamente

nell'apparato di Golgi (cisterna cis), dove degli zuccheri vengono legati al peptide a livello

dell'atomo di ossigeno delle catene laterali di serina (Ser) e treonina (Thr). L'aggiunta riguarda un

singolo carboidrato alla volta; solitamente il numero di zuccheri legati durante questo processo è

limitato a pochi residui.

La sintesi del collagene e le sue modificazioni post-traduzionali 72  

Giorgia Palladino

Il collagene è la principale molecola del tessuto connettivo. Il suo assemblaggio finale avviene nello

spazio extracellulare: le sue code vengono tagliate per permettere l’unione delle molecole sia in

orizzontale che in verticale. Le striature che si osservano al microscopio, infatti, sono dovute agli

spazi vuoti tra le molecole.

La biogenesi del collagene del tipo I è un esempio valido di modificazioni post-traduzionali:

1. La sintesi delle catene del collagene avviene da parte dei ribosomi associati al RER e vengono

tagliate dal peptide segnale; i geni del collagene sono 23 e sono note più di 1000 mutazioni, che

portano a vari tipi di difetti dei connettivi

2. Modificazioni di amminoacidi; le caratteristiche dell’elica del collagene richiedono che alcuni

residui di prolina e di lisina siano idrossilati. L’acido ascorbico funge da catalizzatore in questa

reazione. Inoltre, ogni tre amminoacidi viene posta una glicina (amminoacido)

3. Aggiunta di oligosaccaridi N-linked

4. Aggiunta di galattosio ai residui di idrossilisina

5. Allineamento delle eliche, formazione dei legami disolfuro e di legami tra catene laterali

catalizzati dalla deaminazione di alcuni residui di lisina ad opera della LOX; formazione della

tripla elica a partire dall’estremità carbossilica. Nell’ambiente ossidante del RER si formano

legami disolfuro tra i residui di cisteina. Se questi non sono ben allineati si formano dei legami in

posizione sbagliata; per questo, le chaperon disolfuroisomerasi li scinde per permettere alla

cisteina di legarsi in modo corretto

6. Completamento della glicosilazione nell’apparato del Golgi con aggiunta di glucosio O-linked ai

residui di Lys.

7. Solfatazione:

8. Trasporto del procollagene dal Golgi alla membrana via vescicole rivestite da COP1

9. Esocitosi

Le seguenti fasi, invece, avvengono nello spazio extracellulare: 2+

10. Rimozione dei propeptidi N- e C- terminali ad opera di proteasi e in presenza di Ca

11. Associazione laterale delle molecole di collagene, con sfasamento di ¼ della loro lunghezza

12. Formazione di legami trasversali covalenti

13. Aggregazione delle fibrille polimeriche, in modo differente da tessuto a tessuto

Processi che coinvolgono il traffico di membrane

Il traffico di membrane, in generale, non coinvolge i mitocondri, i cloroplasti e, in parte, i

perossisomi, che hanno bisogno di segnali specifici.

Il traffico di membrane è coinvolto in vari processi:

Formazione dei lisosomi; le proteine trasportate nelle vescicole che si staccano dal Golgi per

• formare i lisosomi hanno un segnale specifico di mannosio-6-fosfato

Segnali cellula-cellula

• Secrezione/esocitosi costitutiva e regolata

• Transcitosi

• Fagocitosi

• Endocitosi

• Endofagocitosi

Come abbiamo visto, le proteine destinate ai lisosomi sono marcate con mannosio-6-fosfato,

riconosciuto da un recettore che unisce queste proteine in una regione del Golgi trans, da dove far

dipartire poi le vescicole. Anche le cellule del pancreas esocrino, che producono enzimi digestivi, li

accumulano in vescicole dette granuli di zimogeno.

La fagocitosi richiede movimento di citoplasma: gli pseudopodi inglobano batteri e detriti cellulari,

che si fondono con gli endosomi, cioè lisosomi con enzimi litici inattivi, e che si attivano al

momento della fusione con la vescicola per scindere il materiale inglobato. Anche la fagocitosi,

come l’endocitosi, si attiva grazie a recettori che riconoscono i materiali che devono essere

fagocitati. Le vescicole adibite all’endocitosi sono dette vescicole rivestite, perché sono, per

73  

Giorgia Palladino

l’appunto, rivestite da una specie di esoscheletro che le richiami all’interno. Le vescicole più

piccole sono dette caveolae: non hanno rivestimento, ma sono caratterizzate da lipidi che

favoriscono l’inglobamento, che è comunque mediato da recettori. Infatti, i lipidi della membrana

possono muoversi spostandosi all’interno della membrana e si possono unire in zattere lipidiche.

Degradazione mediata dai lisosomi

Alcune digestioni avvengono nella zona extracellulare, per cui i lisosomi vengono esocitati (ed

esempio, gli osteoclasti). Per le digestioni interne alla cellula, invece, le pompe protoniche che

regolano il pH all’interno dei lisosomi si attivano quando l’endosoma tardivo si fonde con la

vescicola. Se il lisosoma si rompe, in quantità contenute, il pH cellulare, più basico rispetto a quello

lisosomiale, fa si che gli enzimi digestivi vengano inattivati.

Le vescicole autofagiche, invece, sono una doppia membrana di reticolo endoplasmatico liscio che

avvolge la struttura con una doppia membrana. Quando questa si unisce al lisosoma, il contenuto e

la membrana interna vengono digeriti, ma non quella esterna. L’autofagia si ha anche quando la

cellula è in estrema carenza di energia: per ricavarne di nuova, comincia a degradare i mitocondri e

poi parti dello stesso citoplasma. L’autofagia è molto importante perché è regolata da meccanismi

che si oppongono all’accrescimento cellulare (anabolismo), favorendo il catabolismo.

La transcitosi, invece, è un’endocitosi che non è seguita da digestione, ma la vescicola attraversa

tutta la cellula ed esce dalla parte opposta (ad esempio nei microvilli intestinali). Questo passaggio

porta al fatto che la membrana basale continua ad aggiungere materiale, mentre quella apicale

continua a perderne. Le giunzioni occludenti, però, impediscono una ridistribuzione dei lipidi

all’interno della membrana, per cui si avrà una nuova endocitosi nella zona basale per riportare

materiale nella zona apicale.

Vediamo qualche esempio di endocitosi.

Il ferro è un atomo molto reattivo e la cellula lo tiene associato a molecole di trasporto (la

transferina, che lega due atomi alla volta) perché non reagisca. Se la cellula necessita di ferro e lo

deve inglobare dall’esterno, espone una molecola di apotransferina che con dei recettori lega la

transferina, a cui a sua volta si lega il ferro. La vescicola viene poi inglobata, si unisce ad un

endosoma e si attivano le pompe protoniche che acidificano l’ambiente lisosomiale. Questa acidità

permette il distacco del ferro dalla transferina e la sua uscita dal lisosoma attraverso canali specifici

per andare nel citoplasma, dove è nuovamente legato a molecole che ne impediscano la reazione.

Un altro esempio è quello del colesterolo. Questo lipide viene trasportato in una grossa particella e

legato ad una proteina di trasporto detta LDL (Low Density Lipoprotein), cioè una lipoproteina a

bassa densità. Anche in questo caso, i recettori del lisosoma riconoscono la LDL e, quando il pH si

abbassa, la particella viene digerita e il colesterolo viene fatto uscire dalla cellula; dopo di che, i

recettori per la LDL tornano sulla membrana.

Degradazione mediata dal sistema ubiquitina-proteosoma

Abbiamo visto che i lisosomi portano alla digestione di una singola o di più proteine. Il proteosoma,

invece, può accogliere singole proteine e, oltre a quelle danneggiate, può degradare anche le

proteine sane che, però, non servono alla cellula in quello stadio della sua vita. La degradazione,

come per il lisosoma, comporta innanzitutto un riconoscimento del bersaglio. Quindi, tre enzimi

detti E1, E2 ed E3 (E1 e E2 non specifici, E3 specifico) attaccano alla proteina bersaglio una

piccola molecola di ubiquitina, che dà il segnale per la distruzione della proteina. Una volta che

l’ubiquitina ha agganciato la proteina, infatti, questa viene inviata al proteosoma: entra da una parte,

viene scissa, e dall’estremità opposta escono bipeptidi, tripeptidi e amminoacidi, più l’ubiquitina

pronta ad essere riutilizzata.

Rivestimenti delle vescicole

Le vescicole che si dipartono dal RER sono rivestite dal COP2, mentre quelle del Golgi dal COP1

(dove COP = coat protein, cioè di rivestimento). La clatrina, invece, riveste le vescicole che vanno

dal Golgi agli endosomi e le vescicole di endocitosi; al contrario delle COP1 e 2, forma una

74  

Giorgia Palladino

superficie regolare a volte cristallizzata. Questi rivestimenti si rapportano con trasportatori specifici

che collegano i recettori per le vescicole alle vescicole stesse. Anche il trasporto lungo i microtubuli

richiede proteine motrici che riconoscano i rivestimenti, mentre a destinazione ci deve essere un

riconoscimento reciproco tra le vescicole e la loro sede specifica, attuato dai recettori t-SNARE

(sulla membrana) e dalle v-SNARE (sulla vescicola). La SNAP, infine, fa avvenire la fusione.

Biogenesi e funzioni dei perossisomi

Perché un perossisoma si duplichi, occorre prima duplicare la catalasi attiva che si trova al suo

interno, per poi poterla dividere nei due perossisomi figli. Quindi, si inseriscono nel perossisoma

delle proteine di membrana e dei fosfolipidi. Dopo di che, i ribosomi del citosol sintetizzano i

polipeptidi della catalasi, che entrano all’interno del perossisoma. Qui, le subunità della catalasi

vengono ripiegate grazie all’aggiunta dei gruppi eme, provenienti dal citosol. Infine, il perossisoma

si divide.

I perossisomi hanno diverse importanti funzioni, tra cui:

Metabolizzare il perossido di idrogeno (perossidasi e catalasi)

• Detossificare varie sostanze organiche

• Ossidare gli acidi grassi a catena lunga (>16 C) e ramificata, tra cui le prostaglandine

• Metabolizzare i composti azotati

• Catabolizzare le sostanze insolite (ad esempio D-amminoacidi)

I segnali cellulari

Le cellule ricevono segnali per rendersi conto del contesto che le circonda; questo succede sia tra le

cellule degli organismi pluricellulari animali, sia tra i vegetali che tra gli organismi unicellulari. Tali

segnali cellula-cellula determinano la regolazione dei canali ionici, la regolazione delle attività

enzimatiche e la regolazione delle attività dei geni. Inoltre, i segnali regolano:

la reattività

• l’esocitosi delle vescicole

• i segnali elettrici

• il differenziamento

• la proliferazione

• la migrazione

• l’apoptosi

• altre interazioni cellula-cellula

I segnali cellula-cellula, ovvero quelli che richiedono il contatto tra due cellule, sono di tre tipi:

quelli nervosi; quelli endocrini, per cui una ghiandola emette nel circolo sanguigno delle molecole

(ormoni) che vengono riconosciute solo dalle cellule che possiedono i recettori appositi per quel

segnale; quelli iuxtacrini, per cui il segnale consiste nel passaggio di piccole molecole tra cellule

adiacenti oppure nel contatto tra queste cellule, in quanto un segnale si trova sulla membrana

esterna di una cellula mentre l’altra possiede, sempre sulla membrana, i recettori per quel segnale.

Negli embrioni, invece, è molto frequente la segnalazione paracrina, per cui le molecole emesse da

una ghiandola o da altre cellule colpiscono le cellule vicine. Un altro tipo di segnalazione è quella

autocrina (o autostimolazione), per cui la cellula che emette un determinato segnale fa anche da

cellula ricevitrice; questo viene sfruttato soprattutto in ambito immunologico.

In ogni caso, ci sono dei punti prefissati che valgono per ogni tipo di segnalazione:

Se il segnale è liposolubile può attraversare la membrana plasmatica, per cui il recettore si trova

• sulla faccia interna della membrana; in caso contrario, il recettore è esterno ad essa. Anche nel

caso in cui il segnale sia di origine gassosa i suoi recettori si trovano all’interno della membrana,

poiché essa è permeabile ai gas

Se il segnale è arrivato sulla superficie esterna della membrana, deve essere portato all’interno

• della cellula; quindi, il recettore si modifica in modo che una molecola si allontani dalla

membrana e porti il segnale all’interno della cellula. Questo processo si chiama di trasduzione del

75  

Giorgia Palladino

segnale e le molecole che si allontanano dalla membrana sono dette secondi messaggeri, poiché il

primo messaggero è il ligando (la molecola segnale)

Un segnale tende a legarsi in maniera più o meno frequente al suo recettore in base alla

• concentrazione del ligando e della sua affinità con il rispettivo recettore

Un certo segnale non può legarsi al suo recettore oltre un certo limite, secondo il concetto di

• concentrazione-soglia

I recettori sono altamente specifici per il proprio ligando

• Il segnale, se deve arrivare a cellule più distanti, viene amplificato da quelle che l’hanno ricevuto

• Un segnale può considerarsi tale se è intermittente, ovvero se può attivarsi e disattivarsi in base

• alle necessità dell’organismo

I ligandi possono essere di varia natura. Tra essi possiamo avere amminoacidi, peptidi, proteine,

ormoni tiroidei (con recettore intracellulare), cetacolammine (con recettore di membrana) e acido

arachidonico (con recettore di membrana).

I legami recettore-ligando sono deboli, non covalenti: in qualunque momento si possono legare o

separare. Si dice quindi che il legame e reversibile e ci saranno sempre dei ligandi attaccati ai

recettori e dei ligandi separati, in base alla concentrazione del ligando e all’affinità del recettore con

esso. Questo determina la cinetica della reazione. Quindi, un segnale solubile raggiunge il flusso

sanguigno (segnale endocrino) o solo le cellule circostanti (segnale paracrino) in funzione della sua

reattività chimica e della sua emivita (tempo di dimezzamento). I segnali possono raggiungere tutti i

tipi di cellula, ma avranno effetto solo su quelle dotate dei recettori specifici. Come abbiamo già

visto, la localizzazione dei recettori nella cellula bersaglio dipende dal carattere chimico del ligando

(ossia se è in grado o meno di penetrare la membrana).

Lo stesso ligando può avere recettori diversi, che differiscono per la loro affinità con esso. Anche la

stessa cellula può avere più tipi di recettori per lo stesso ligando, che produrranno risposte diverse.

Le cellule più vicine alla secernente, ad esempio, essendo esposte a concentrazioni maggiori di

segnale, possono avere recettori meno affini perché la concentrazione del ligando è più alta. Al

contrario, più bassa è la concentrazione del ligando, più i recettori devono essere affini per poterlo

legare. Un segnale paracrino può creare un gradiente di concentrazione al quale le cellule bersaglio

rispondono in maniera diversa a seconda della distanza dalla fonte, proprio in base alla capacità dei

propri recettori di legare un ligando a una data concentrazione; un effetto soglia, quindi, può creare

risposte tutto-o-nulla.

Lo stesso ligando può avere effetti diversi in cellule diverse, in funzione del recettore e delle

molecole diverse di trasduzione del segnale da esso attivate. Ad esempio, l’adrenalina, o cosiddetto

ormone della paura (fight or flight, combatti o scappa), produce una vasodilatazione della

muscolatura scheletrica e una maggior glicogenolisi, mentre blocca la digestione e provoca la

costrizione dei vasi sanguigni periferici.

In modo inverso, lo stesso recettore può riconoscere più ligandi, in base alla sua specificità. Ad

esempio, il ligando per l’adrenalina si lega al suo recettore; in presenza di isoproterenolo, che ha la

stessa funzione dell’adrenalina ma è suo agonista, questo si lega agli stessi recettori per

l’adrenalina. Oppure, gli agonisti dell’adrenalina si legano ai suoi stessi recettori, così che questa

non abbia effetto. Come esempio di agonisti, possiamo vedere gli oppiacei nei confronti delle

endorfine: uno degli effetti dell’eroina è abbassare la frequenza respiratoria e, per contrastarne gli

effetti, occorre somministrare qualcosa che abbia un effetto antagonista e si leghi ai suoi stessi

recettori.

Sulla membrana plasmatica troviamo anche dei recettori che hanno anche la funzione di fattori di

trascrizione; ad esempio, nel caso sia riscontrata una quantità di fosforo non sufficiente, il recettore

stimola la produzione di nuovo fosforo. In questo caso, quando è inattivo, il recettore è legato a dei

gruppi fosfato; nel caso in cui il fosforo sia insufficiente, i gruppi fosfati si staccano e il recettore si

attiva, regolando l’espressione genica per la produzione di una maggiore quantità di fosforo. Ci

sono però anche altri modi in cui i recettori possono modificare l’espressione genica; vediamone

qualche esempio: 76  

Giorgia Palladino

Un segnale extracellulare può attivare un fattore di trascrizione. In questo esempio, l’ormone

• glucocorticoide (GR), che è liposolubile, si lega ad un recettore citoplasmatico composto da due

parti, di cui una è detta LBD (dominio che lega il ligando). L’ormone GR si attacca all’LBD,

spostando due proteine chaperon (Hsp90) che coprivano NLS (segnale di localizzazione del

nucleo) del recettore. Una volta scoperta la NLS, questa si rende visibile alle importine, in modo

che il recettore e il ligando siano trasportati nel nucleo. Qui, il recettore lega gli elementi di

risposta (GRE): infatti, il DNA-binding domain risponde ai glucocorticoidi e localizza il recettore,

che è così diventato un fattore di trascrizione. Poi, il dominio di attivazione attiva la trascrizione:

in questo caso, il segnale altera il pattern di trascrizione dei geni

Un altro esempio di segnale che altera il pattern di trascrizione è l’interferone, una molecola di

• natura proteica prodotta dai linfociti quando si viene attaccati da un virus. L’interferone ha un

recettore di membrana composto da due parti, che si uniscono con l’arrivo di questa molecola.

Unendo le due parti, il recettore attiva l’attività fosfochinasica e la proteina Stat1α fosforilata entra

nel nucleo, attivando la trascrizione. In questo modo l’interferone, senza materialmente entrare

nella cellula bersaglio, dà inizio ad una breve catena di trasduzione del segnale che va ad attivare

un fattore di trascrizione.

Un altro esempio è quello in cui il recettore è associato ad una proteina G. Ad esempio, il recettore

• per l’adrenalina è una proteina di membrana che attraversa sette volte la membrana. Sulla parte

esterna della membrana si trova la parte del recettore che lega l’adrenalina, mentre all’interno si

trova la parte che lega la proteina G, in questo caso formata da tre subunità α, β e γ. Quando il

recettore si attiva, le porzioni β e γ della G-protein si staccano dalla subunità α (che è la subunità

effettrice, che lega il GTP). In questo modo, la subunità α si attiva e si va a legare all’adenilato

ciclasi, formando cAMP. Il cAMP è una piccola molecola solubile in grado di diffondere (secondo

messaggero) e di attivare altre molecole, come la chinasi PKA. Il cAMP viene scisso in ATP e

AMP-ciclico dalla fosfodiesterasi e questo passaggio termina l’effetto della segnalazione, anche se

occorre ricordare che la subunità α, intanto, si disattiva scindendo il GTP in GDP. L’attivazione

della PKA (protein-chinasi A) da parte del cAMP è reversibile; quando la PKA viene attiva, va a

fosforilare altre proteine. Quindi, il cAMP, secondo messaggero, dà inizio a una via di trasduzione

del segnale che attiva una cascata di chinasi e porta, alla fine, alla regolazione dell’attività

enzimatica. Ogni passaggio comporta un’amplificazione del segnale (ovvero un coinvolgimento di

un numero sempre maggiore di molecole) ed è passibile di regolazione da parte di altre vie di

segnalazione, anche contrastanti. Nel nostro esempio, alla fine del processo si ottiene la scissione

del glicogeno in glucosio

Senza l’intervento dell’adrenalina, la sintesi e la lisi del glicogeno sono normalmente regolate

dall’insulina, che favorisce la glicogeno sintesi, e dal glucagone, che favorisce la glicogeno lisi. Con

l’arrivo dell’adrenalina, la cellula deve decidere quale passaggio favorire (sintesi o lisi), anche

quando il livello di glucosio è già alto. Al contrario, con l’interferone non si ha una risposta così

fine perché è più rapida, in modo che il virus non riesca ad intromettersi nei meccanismi antivirali.

Vediamo ora, invece, la regolazione della concentrazione intracitoplasmatica di calcio, che in

-4

condizioni standard è di circa 10 mM. Tale concentrazione deve essere regolata in modo preciso:

il calcio, infatti, può entrare nella cellula secondo gradiente attraverso i canali del calcio, ma ci

voglio delle pompe e dei cotrasporti per mantenere dentro la cellula una bassa concentrazione. I

canali del calcio possono essere sensibili a vari recettori. Ad esempio, quando uno spermatozoo

penetra nella cellula uovo, si attiva una fosfolipasi che attiva i canali del calcio, per farlo entrare

nella cellula. Questo processo stimola ulteriormente l’uscita di calcio dal reticolo endoplasmatico

che ne contiene delle riserve, prima che si riattivino le pompe per ristabilire la concentrazione

normale. Quindi, si forma un’onda di calcio che percorre tutta la cellula uovo e che ha tre funzioni:

Attiva dei sistemi che impediscono l’ingresso di altri spermatozoi

• Attiva la meiosi nella cellula uovo

• Attiva il nucleo dello spermatozoo, i cui cromosomi si devono decompattare

• 77  

Giorgia Palladino

Inoltre, l’aumento della concentrazione citoplasmatica di calcio regola l’esocitosi di vescicole da

parte dell’ovocita fecondato. Infatti, lo spermatozoo attivato si lega alla superficie della cellula uovo

nella parte in cui la membrana vitellina circonda l’uovo, mentre nella sottostante membrana

plasmatica si trovano dei granuli corticali che rilasciano il loro contenuto. Tale rilascio induce la

formazione della membrana di fecondazione, mentre lo spermatozoo si fonde con la cellula uovo.

Un altro processo dipendente dalla concentrazione di calcio è la coagulazione; infatti, il contatto

delle piastrine con i vasi che presentano lesioni attiva una segnalazione basata sul rilascio di calcio,

che porta all’esocitosi di sostanze pro-coagulanti. Dunque, se un vaso si lede, il recettore per il

collagene si attiva e provoca la fuoriuscita di calcio dal reticolo endoplasmatico. Questo fa si che le

piastrine si concentrino nella zona lesa, andando a formare una sorta di tappo sulla ferita.

Recettori con attività fosfochinasica

Tali recettori sono quelli più tipici dei fattori di crescita, glicoproteine che si possono diffondere

attraverso la circolazione o per via paracrina. Tali fattori di crescita sono prodotti dai tessuti che

svolgono anche altre funzioni e il primo ad essere scoperto fu il Nerve Growth Factor (NGF) da

Rita Levi Montalcini. I fattori di crescita sono tutti fattori di sopravvivenza, vanno a favorire la

proliferazione dei tessuti e il loro differenziamento e hanno recettori per lo più con attività

forfochinasica che si esplica sul recettore stesso. Questo vuol dire che metà del recettore fosforila

l’altra metà, modificandone la forma per l’attacco di altre proteine. Quando tali proteine si

assemblano, l’assemblaggio porta alla loro attivazione. I fattori di crescita possono indurre la

trascrizione di geni che attivano la proliferazione cellulare, innescando una cascata di chinasi;

questo succede, ad esempio, con la trasduzione del segnale dell’NGF via Trk, ovvero attraverso un

recettore con attività tirosin chinasica.

Altri esempi di ligandi e recettori segnificativi

L’ossido di azoto è un importante primo messaggero, quindi ligando, che agisce solo per via

paracrina in quanto è molto reattivo. Questa è una segnalazione molto importante per il controllo

della vasodilatazione. Questi segnali, infatti, attraverso il rilascio di calcio attivano la NO sintetasi

(dell’ossido nitrico), che diffonde nelle cellule della muscolatura liscia del vaso che possiedono gli

appositi recettori. Si forma la solita cascata di chinasi che va a rilassare la muscolatura del vaso e

determina, quindi, la vasodilatazione.

Oppure, le chinasi associate alle proteine di adesione cellula-cellula e cellula-matrice regolano

molteplici attività, dalla sopravvivenza alla proliferazione, dalla motilità ai cambiamenti di forma

all’adesione stessa. Infatti, la mancata aderenza al substrato oppure ad altre cellule può essere un

segnale di apoptosi.

Ancora, i segnali che i leucociti e le cellule endoteliali si scambiano quando vengono a contatto

determinano in entrambe le cellule delle modificazioni di comportamento, che alla fine porteranno

all’estravasione.

Un altro esempio è quando a livello delle giunzioni aderenti si localizza la β-catenina; la sua

quantità e la sua liberazione dai complessi giunzionali sono regolate dall’espressione genica, dalla

sua degradazione, dalle giunzioni stesse e da segnali solubili. La β-catenina libera nel citoplasma

può migrare nel nucleo e attivare la via della proliferazione.

Infine, un tipo di segnalazione iuxtacrina è il recettore Notch, che viene tagliato dopo l’interazione

con il ligando e diventa esso stesso un fattore di trascrizione.

Il ciclo cellulare

Il ciclo cellulare è un insieme di fasi che la cellula attraversa da quando nasce dalla divisione di una

cellula preesistente a quando si divide a sua volta. La mitosi (M) occupa solo una breve fase

dell’intero ciclo cellulare. Il resto del ciclo prende il nome di interfase. Le cellule eucariotiche sono

le uniche a compiere il ciclo cellulare, in quanto i batteri hanno un diverso tipo di regolazione e si

dividono ogni 20/30 minuti. Per quanto riguarda gli organismi eucarioti unicellulari, il ciclo

78  

Giorgia Palladino

cellulare necessariamente coincide con il ciclo vitale della cellula, mentre negli organismi

pluricellulari le cellule si scambiano informazioni per controllare le divisioni di ogni cellula e,

quindi, il loro numero complessivo. Nella maggior parte degli insetti, ad esempio, dopo le fasi

larvali, quindi nella vita adulta, le cellule non si dividono più; si dividono solo quelle che devono

originare i gameti. Gli eucarioti più complessi, invece, hanno un ricambio continuo delle cellule.

La maggior parte delle cellule di un metazoo adulto non è sempre in ciclo, ma trascorre periodi più

o meno lunghi di quiescenza (G ). L’interfase è costituita da una fase (G ) durante la quale viene

0 1

presa la decisione di dividersi ed è la fase più lunga: nei mammiferi, ad esempio, dura un minimo di

dieci ore. La cellula rimane in G quando non riceve stimoli mitotici, ma torna in G con l’arrivo di

0 1

tali stimoli. La fase G si divide in tre sottofasi: G precoce, intermedio e tardivo. Una volta presa la

1 1

decisione di dividersi, la cellula si deve preparare alla divisione; quindi, passano circa due ore, nei

mammiferi, dal punto di restrizione (cioè il momento in cui la cellula decide di dividersi) alla fase

S, cioè la fase di sintesi (duplicazione) del DNA. La fase S scivola, ancora prima di finire tutta la

sintesi, nella fase G , una fase di controllo finale e di preparazione alla mitosi. Una volta superati i

2

controlli, si passa dalla fase G alla mitosi.

2

La fase G , nei mammiferi, dura circa 10-11 ore, mentre la mitosi (M) solo un’ora. Anche la fase S

1

è molto lunga, perché il DNA è abbondante e ci vuole del tempo a duplicarlo completamente.

Esistono anche delle cellule, come quelle nervose, altamente differenziate, per cui escono dal ciclo

cellulare e si trovano nella fase G , per cui non rispondono agli stimoli mitotici.

z

Interfase

In seguito agli stimoli mitotici, la cellula abbandona la fase G ed entra in fase S. il DNA si duplica

1

e i cromosomi vengono ad essere così costituiti da due cromatidi identici, uniti a livello del

centromero. Con la duplicazione del DNA, devono anche essere sintetizzate molecole di istoni di

quantità opportuna; inoltre, si duplicano i centrioli che restano vicini tra loro a livello del

centrosoma. Prima di entrare in mitosi, la cellula controlla che il DNA sia stato duplicato

completamente e non sia danneggiato (in G ). Dato che la duplicazione del DNA ha luogo in

2

interfase, quando il DNA non è compattato, i cromosomi non si vedono. Tuttavia, occorre tener

presente che ogni cromatidio è sempre costituito da una sola molecola di DNA a doppia elica. Dopo

la fase S, invece, ogni cromosoma viene ad essere costituito da due cromatidi identici, i cromatidi

fratelli.

Il fattore che promuove la maturazione, abbreviato spesso in MPF (dall'inglese Maturation

promoting factor), è una proteina eterodimerica formata da ciclina B e da chinasi ciclina dipendenti

(CDK, anche note come Cdc2 o p34 chinasi) che stimola la fase della mitosi e della meiosi nel ciclo

cellulare. L'MPF promuove il passaggio dalla fase G2 alla fase M fosforilando diverse proteine

necessarie durante la mitosi.

Descrizione della mitosi

La mitosi, o fase M, è costituita a sua volta da quattro fasi: profase, metafase, anafase e telofase.

Vediamo qualche immagine di cellula in mitosi e poi vediamo le quattro fasi della mitosi nel

dettaglio.

Profase

In questa fase, il DNA si condensa grazie alla proteina condensina, che si attiva con una

fosforilazione: questa proteina è in grado di prendere delle regioni di DNA e avvicinarle. I

cromosomi, quindi, diventano visibili e si forma il cinetocore a livello dei centromeri. Dato che i

cromosomi si possono condensare solo se sono staccati dalla lamina nucleare, a cui di solito la

cromatina è attaccata attraverso i filamenti intermedi, tale lamina si deve disgregare grazie alla

fosforilazione delle proteine che la compongono, che si depolimerizzano. Anche molte proteine del

poro si fosforilano e il poro si disaggrega: in tal modo l’involucro nucleare può essere allontanato

ad opera dei microtubuli (fosforilazione di MAP) e, inoltre, si perde la connessione DNA-lamine. I

frammenti rimasti dell’involucro nucleare vanno a costituire un prolungamento del reticolo

endoplasmatico. La lamina, infatti, è costituita da tre parti, la lamina a, b e c; la lamina b possiede

79  

Giorgia Palladino

un’ancora lipidica che, nella disgregazione dei monomeri, rimane attaccata al reticolo

endoplasmatico; la lamina, quindi, non viene distrutta, ma solo disgregata. Il centriolo, inoltre, si

duplica, e i due centrioli iniziano ad allontanarsi verso i poli; il citoscheletro di actina si riorganizza

(fosforilazione della miosina e di altre proteine associate all’actina). Con la disgregazione della

lamina, i cromosomi sono a contatto col citoplasma, quindi possono essere associati al fuso mitotico

(microtubuli), dovuto a una riorganizzazione del citoscheletro; la cellula, quindi, cambia forma e si

stacca da quelle vicine e dalla matrice, perché viene meno il sostegno del citoscheletro di actina alla

membrana cellulare e l’interazione con la miosina.

La coesina è una proteina con caratteristiche comuni alla condensina che unisce i due cromatidi

fratelli che si sono formati nella fase S; la coesina dovrà, poi, essere degradata per la separazione

dei cromatidi fratelli.

Come abbiamo visto, nel corso della profase le due coppie di centrioli iniziano a separarsi. Mentre il

reticolo dei microtubuli periferici collassa, dai due centrosomi si irradiano dei complessi di

microtubuli altamente instabili, gli aster.

Prometafase

In questa fase di passaggio da profase a metafase, sul centromero si localizzano delle proteine che

lo trasformano in cinetocore; il centromero richiama queste proteine che consentono l’aggancio dei

microtubuli al cinetocore da entrambi i lati del centromero. I microtubuli si allungano dal

centrosoma al cinetocore ma l’aggancio deve essere corretto: poiché il fuso si lega ad ogni

cromosoma con 28 fibre per ogni cromatidio, i legami sbagliati devono essere corretti in questa fase

della mitosi. La prometafase, dunque, finisce quando i cromosomi sono tutti allineati e tutti i siti di

attacco per le 28 fibre sono occupati. Col tempo, dunque, ogni cinetocore acquisisce dei fasci di

microtubuli, le fibre del cinetocore, che costituiscono il supporto per il movimento dei cromatidi

fratelli verso i poli opposti. I microtubuli, quindi, posizionano i cromosomi in piastra equatoriale,

detta anche piastra metafasica.

I cromosomi prometafasici e metafasici sono soggetti a due forze opposte:

il vento polare si esercita sui bracci dei cromosomi, spingendoli lontano dai poli del fuso; è una

• forza generata dalla polimerizzazione dei microtubuli all’estremità (+) e forse dalle chinesine

posizionate sui microtubuli stessi

le fibre del cinetocore tirano il cinetocore verso i poli e determinano una tensione che costituisce

• un segnale. Infatti, solo in caso di attacco bipolare dei due cinetocori fratelli la tensione sarà

bilanciata.

Metafase

Questa fase è molto corta: inizia quando tutti i cromosomi sono in piastra metafasica, cioè sono

allineati sul piano equatoriale. Finché non tutti i cromosomi sono in piastra, la cellula manda un

segnale di “attendi anafase”; quando questo segnale cessa, inizia l’anafase. Quindi, in metafase si

controlla il perfetto allineamento e l’attivazione del complesso che promuove l’anafase.

Anafase

L’APC consente l’allontanamento dei cromatidi fratelli quando i cromosomi sono in piastra

metafasica; l’APC, infatti, attivato dal cinetocore, è in grado di tagliare la coesina localizzata ai

centromeri, che si disaggrega. Infatti, l’MPF fosforila le subunità di coesina, che si staccano, ma al

livello del centromero la coesina non si rompe finché non si attiva l’APC, che da il segnale per cui i

cromatidi fratelli si possono staccare. A questo punto, una proteasi attivata dall’attivazione di APC

va a degradare la coesina a livello del cinetocore. Questa proteasi, infatti, è bloccata dalla securina

finché non deve agire: quando l’APC degrada la securina, la proteasi agisce.

I microtubuli cromosomici si accorciano all’estremità (+), tirando i cromosomi verso i poli (motori

di dineina). I microtubuli polari si respingono nella zona di sovrapposizione (motori di kinesina) e si

allungano, determinando un allungamento dell’intera cellula. I microtubuli dell’aster trattengono

l’aster vicino alla membrana, ancorandolo, e, per effetto di queste azioni, la cellula si allunga

mentre i cromosomi si allontanano verso i poli.

Nella regione equatoriale, dopo l’allontanamento dei cromatidi fratelli, rimangono le fibre polari

che vanno a costituire il corpo centrale. In questa regione, si localizzano alcune proteine passeggere

80  

Giorgia Palladino

che indicano il punto in cui si trovavano i cromosomi, cioè la piastra metafasica, che è il punto in

cui si deve formare il solco di clivaggio (il punto idi divisione della cellula), dato dall’interazione

tra actina e miosina.

Tali proteine sono dette passeggere perché, inizialmente, si trovano sul cinetocore e si fanno

trasportare da esso nella zona equatoriale; una volta che i cromatidi si sono allontanati, le proteine

rimangono nella zona equatoriale e indicano il punto in cui dovrà formarsi il piano di clivaggio.

Tale piano, quindi, è predefinito, cioè il punto in cui avviene la divisione non è casuale.

Telofase

In quest'ultima fase della mitosi, i cromosomi si despiralizzano (decondensano). Intorno ai due

nuovi complessi cromosomici ricompaiono le membrane nucleari e gli organelli si ricompongono.

La telofase si conclude con una sottofase: la citodieresi, in cui si separa il citoplasma in modo

equivalente in entrambe le nuove cellule. La cellula si divide al centro formando due cellule figlie,

esattamente identiche alla cellula madre ma più piccole. Questo avviene grazie ad un anello di

actina creatosi al centro della cellula madre che, contraendosi, stringe la cellula al centro. A tal

punto le proteine specializzate operano la fusione e la separazione della membrana in punti specifici

e le due cellule si separano.

La regolazione del ciclo mitotico

Abbiamo visto che la cellula esce da una divisione con cromatidi monocromatidici, diploidi, e

comincia ad accrescersi. Entra in fase G se non riceve segnali per la divisione, altrimenti percorre

0

la fase G sospinta da segnali mitotici. Superato il punto di restrizione, dopo una fase di

1

preparazione alla duplicazione del DNA, la cellula entra in fase S.

Prima di entrare in mitosi, la cellula si assicura di:

avere un DNA integro

• aver raggiunto un preciso rapporto nucleo/citoplasma (accrescimento)

• negli organismi pluricellulari, la cellula si assicura che l’organismo necessiti di quella data mitosi

• (fattori di crescita e altri stimoli mitotici)

Inoltre, le fasi del ciclo cellulare si susseguono ordinatamente in modo da assicurare che:

il ciclo cellulare prosegua in una sola direzione, cioè non torni indietro

• ogni fase sia stata completata prima che la successiva abbia inizio

• non si siano create situazioni di danno al DNA

• i cromosomi siano ripartiti nel modo giusto tra le cellule figlie

Vari esperimenti di fusione cellulare hanno dimostrato l’esistenza di fattori citoplasmatici che

regolano la mitosi: infatti, si vede che ogni fase del ciclo e della mitosi è caratterizzata dalla

presenza di specifiche attività chinasiche, la cui presenza ha un andamento ciclico.

I segnali mitotici, infatti, con la traduzione del segnale alterano l’espressione genica perché attivano

fattori di trascrizione che favoriscono, appunto, la trascrizione di molecole che compongono un

altro tipo di chinasi specifiche della fase G . Vi sono altri complessi ciclina-CDK, ognuno dei quali

1

controlla una data fase; nel loro insieme, essi determinano la progressione del ciclo cellulare. Infatti,

le chinasi sono costituite da due parti: la chinasi vera e propria (CDK) e la parte di regolazione che

attiva la CDK, cioè la chinasi dipendente da ciclina, che segnala i bersagli che la chinasi deve

fosforilare. Questa regolazione è data da una proteina abbastanza labile e presente solo in fase G 1

sintetizzata a partire da segnali mitogenici, la cosiddetta ciclina. Finché i segnali sono presenti, la

ciclina si continua a formare, altrimenti si degrada e non provoca la fosforilazione. La degradazione

delle cicline è un evento irreversibile e, quindi, assicura che il ciclo cellulare prosegua in una sola

direzione. Una volta superato il punto di restrizione, invece, i segnali non sono più necessari e la

cellula si concentra solo sulla preparazione di ciò che è necessario alla duplicazione.

Per una cellula di un organismo pluricellulare (metazoo), la decisione di entrare in mitosi è

strettamente regolata dalle necessità globali dell’organismo. Quindi, le cellule ricevono dei segnali

mitotici, tra cui i fattori di crescita, che attivano delle cascate di chinasi; così, vengono indotti dei

fattori di trascrizione che promuovono la sintesi delle cicline in fase G .

1 81  

Giorgia Palladino

Il controllo della fase G 1

Sia il passaggio dalla quiescenza (se presente) alla fase G , sia la progressione in G , sono indotte

1 1

dalla presenza di situazioni favorevoli all’accrescimento (es. sostanze nutrienti) e, nei metazoi, da

segnali mitotici. A loro volta, tali segnali inducono la sintesi di cicline in fase G . I complessi di

1

ciclina di fase G -CDK fosforilano una proteina nucleare, Rb. La fase G è caratterizzata da un

1 1

aumento progressivo della quantità di cicline di fase G e, quindi, dell’attività chinasica delle CDK

1

da esse controllate. Il principale bersaglio dei complessi ciclina-CDK è Rb, inibitore del fattore di

trascrizione E2F. La progressiva fosforilazione di Rb scandisce la progressione in G . Quindi, la

1

progressiva fosforilazione di Rb, che si attua a mano a mano che la cellula progredisce in G ,

1

consente l’attività trascrizionale di E2F. La completa fosforilazione di Rb porta al superamento del

punto di restrizione.

Il punto di restrizione rappresenta la decisione cruciale della cellula ed è un punto di controllo, per

vedere se il DNA deve essere riparato o se è integro. Al superamento del controllo dell’integrità del

DNA, la cellula non necessita più di ricevere segnali mitotici e inizierà a sintetizzare tutto quello

che serve per la duplicazione del DNA; solo un evento dannoso potrà fermarla.

Regolazione della fase S

Abbiamo visto che con la fase S comincia la duplicazione del DNA, che ha inizio nei siti di origine

della duplicazione, dove sono localizzate proteine che segnalano i siti di origine per l’attacco di

enzimi come la primasi e la ligasi. Quando alcune di queste proteine vengono fosforilate, si

staccano dai siti di origine e questo distacco consente l’inizio della duplicazione. In questo modo, la

cellula riesce a regolare il fatto che la duplicazione del DNA avvenga soltanto una volta per ogni

ciclo cellulare.

Le proteine di cui abbiamo parlato sono mantenute fosforilate fino a che la cellula non entra in

anafase e finché rimarranno staccate non potrà iniziare una nuova sintesi. Quindi, i complessi

ciclina-CDK di fase S fosforilano il complesso di pre-replicazione posti alle origini della

replicazione.

Come abbiamo visto, il passaggio da G a S porta all’attivazione del complesso ciclina-CDK, anche

1

se la ciclina viene sintetizzata quando la cellula passa il punto di decisione cruciale. Durante il

tempo che passa dalla fase G alla fase S, i complessi ciclina-CDK maturano e poi si attivano in

1

fase S. In anafase, le cicline rimanenti vengono degradate e le proteine dei siti di origine si

riattaccano ad essi, impedendo una nuova duplicazione fino al successivo ciclo cellulare.

La fase M

Le cicline della fase G sono due e vengono sintetizzate durante la stessa fase G e, man mano che

1 1

hanno svolto il loro compito, vengono degradate.

La ciclina della fase S viene sintetizzata a partire dal superamento del punto R (di restrizione) e non

vengono degradate fino all’anafase.

La ciclina della fase M, invece, è l’MPF, la cui attività chinasica regola tutti gli eventi della profase

e della metafase:

controlla, in metafase, che tutti i cromosomi siano allineati sulla piastra equatoriale

• controlla le proteine passeggere, ovvero controlla che non ci siano più cromosomi sulla piastra

• mitocondriale e che, quindi, la cellula si possa dividere (fine anafase)

Inoltre, l’MPF attiva l’APC, che controlla l’anafase e la telofase.

L’MPF viene regolato da due attività chinasiche, una attivatoria e l’altra inibitoria. L’MPF viene

fosforilato su entrambi i siti a mano a mano che si forma dell’associazione tra le cicline mitotiche e

la CDK1. I fosfati inibitori vengono rimossi dalla fosfatasi Cdc25 al momento del passaggio da G a

2

M.

Abbiamo già parlato di come i primi esperimenti di fusione tra cellule in fasi diverse abbia

permesso di trovare le associazioni tra cicline e CDK: 82  

Giorgia Palladino

Fondendo il citoplasma di una cellula in S e una in G , la cellula in G comincerà a duplicare il

• 1 1

suo DNA perché il complesso ciclina-CDK della fase S attivo permette la duplicazione

Fondendo una cellula in S e una in G , invece, la cellula in G non si duplica nuovamente, perché

• 2 2

la cellula può compiere il ciclo in un’unica direzione e le proteine dei siti d’origine impediscono

una nuova duplicazione del DNA

Fondendo una cellula in fase M con una cellula in qualsiasi altra fase, l’altra cellula entrerà subito

• in fase M, perché la cellula in M contiene MPF che induce alla condensazione dei cromosomi.

Quando la ciclina mitotica, che regola MPF, è nel picco, comincia l’attività di MPF (regolazione

della chinasi). Anche per l’attività dell’MPF, però, non basterà un complesso ciclina-CDK, poiché

servirà anche un attivatore prodotto tra fase G e fase M

2

L’uscita dalla mitosi è consentita dalla degradazione della ciclina mitotica, operata anch’essa da

APC.

Le cicline nel dettaglio

All’inizio della fase G , i segnali mitotici attivano la ciclina D che si attacca a una chinasi (4 o 6);

1

questo complesso ciclina-CDK fa procedere la cellula in G .

1

In fase tardiva si attiva la ciclina F, che si attacca alla sua chinasi e fa superare il punto R; facendo

questo, attiva la ciclina A, caratteristica della fase S.

La ciclina A non viene degradata durante o alla fine della fase S e, quando la cellula entra in mitosi,

la ciclina A e la ciclina B vanno a formare, con le due chinasi, l’MPF, composto quindi da CDK1 e

ciclina A e B; queste portano alla condensazione dei cromosomi, alla disgregazione della lamina e a

tutti i processi della mitosi e si degraderanno solo in anafase.

Spiegato il meccanismo in generale, vediamolo nel dettaglio.

La ciclina del G va a fosforilare la molecola di Rb, che ha 15 siti di fosforilazione; questo vuol dire

1

che ci vorrà una grande quantità di ciclina del G per fosforilare tutto Rb. Finché arrivano alla

1

cellula segnali mitogenici, Rb verrà fosforilata; se i segnali diminuiscono, il processo si interrompe.

Una volta che tutto Rb è fosforilato, la cellula non ha più bisogno di segnali mitogenici e, quinid,

passa il punto di restrizione.

Rb blocca il fattore di trascrizione E2F, che controlla la sintesi della ciclina E che contribuisce, a

sua volta, a fosforilare Rb. Finché Rb non è del tutto fosforilato, E2F non può cominciare la

trascrizione, quindi la cellula non può entrare in fase S.

Questo meccanismo è necessario perché la cellula si deve accertare di avere abbastanza fattori

mitogenici per continuare nel ciclo.

Come abbiamo detto, le cicline mitotiche A e B si uniscono alla loro CDK1 a formare MPF.

Durante l’interfase, l’attività dell’MPF è molto bassa e vengono ancora sintetizzate le cicline. Nel

passaggio da G a M, invece, il complesso MPF è attivo.

2

Alla fine dell’anafase, le cicline mitotiche vengono degradate via ubiquitina-proteasoma: è l’APC

che va ad attaccare l’ubiquitina alle cicline, lo stesso APC che porta alla degradazione della

securina e, quindi, a quella della coesina. L’APC degrada prima la ciclina A poi la B, ma

quest’ultima solo quando le molecole passeggere segnalano che non ci sono più cromosomi in

piastra metafasica.

Le degradazioni successive fanno si che i cromosomi si mantengano condensati.

I complessi ciclina-CDK

I complessi ciclina-CDK sono fondamentali per la regolazione del ciclo cellulare; tali complessi

sono due in fase G1, uno in fase S e due in fase M. Oltre ad attivare le chinasi, infatti, sono fattori di

specificità e, in momenti specifici, sono regolati dalla sintesi e dalla degradazione, via ubiquitina-

proteasoma, delle cicline. La fosforilazione delle chinasi può essere inibitoria, cioè avviene quando

si rimuove un inibitore, o attivatoria, cioè avviene quando un attivatore viene sintetizzato in una

particolare condizione.

La fase G1 comincia grazie a segnali mitogenici che attivano una catena di trascrizione del segnale,

che porta alla sintesi di fattori di trascrizione che, a loro volta, portano alla sintesi delle cicline della

83  

Giorgia Palladino

fase G1. Tali cicline fosforilano Rb, che lascia libero il fattore di trascrizione E2F e che porta ad

una progressione in G1. Quando tutto Rb viene fosforilato, E2F è attivo e non servono più segnali

mitogenici, per cui si passa il punto di restrizione. Le due cicline della fase G1 sono la D (all’inizio)

e la E (alla fine); compito della ciclina E è far attivare il passaggio della cellula in fase S, visto che

la ciclina E degrada l’inibitore della ciclina della fase S. per prepararsi a questa fase, la cellula

sintetizza sia gli enzimi che le cicline della fase S. dal punto di restrizione alla fase S passano circa

un paio di ore: la ciclina della fase S è la ciclina A ma non si attiva subito perché, prima, occorre

aspettare che la cellula sia pronta e controllare che il DNA non sia danneggiato.

Abbiamo detto che il passaggio dalla fase G1 alla S dipende dalla degradazione dell’inibitore della

ciclina A, che dipende dalla ciclina E che, associata al suo GDK, fosforila tale inibitore,

riconosciuto dalla specifica ubiquitina-proteasoma.

Quando la cellula entra in fase S, la ciclina A va a fosforilare le proteine localizzate nei punti di

origine della duplicazione (ORC); alcune di queste, allontanandosi, permettono agli enzimi

responsabili della duplicazione del DNA di attaccarsi ai siti di origine della duplicazione. Finché la

ciclina A è attiva, i complessi fosforilati allontanati dai siti di origine non possono essere

riassemblati, quindi non può iniziare una nuova duplicazione. Questa caratteristica assicura che il

DNA venga replicato (duplicato) una sola volta in una sola fase S; per questo la ciclina A rimane

attiva fino all’anafase. Alla fine della mitosi, si riassembla il complesso dell’origine perché nel

corso dell’anafase tutte le cicline vengono degradate.

Dopo la fase S, abbiamo visto che c’è il controllo della fase G2, in modo da controllare la corretta

duplicazione del DNA.

Dopo la fase G2 si passa alla fase M, che è soggetta, come la fase S, ad un passaggio brusco. I

cromosomi, in questa fase, vengono condensati con l’attivazione dei complessi ciclina-CDK della

fase M, che sono la ciclina A e la ciclina B (molto simili). Le cicline mitotiche e le CDK mitotiche

si uniscono e vengono fosforilate da una chinasi inibitoria, per poi ricevere in un altro sito una

fosforilazione da una chinasi attivatoria.

Il passaggio dalla G2 a M è dato da una fosfatasi che stacca due gruppi fosforici da un complesso

ciclina-CDK inattivo. Po, in anafase, MPF attiva APC, un processo che promuove l’anafase: l’APC,

infatti, è un’ubiquitina ligasi che degrada la securina, che a sua volta controlla la separasi (cioè una

proteasi). Una volta degradata, la separasi taglia la subunità Scc1 della coesina, in modo che i due

cromatidi fratelli si possano staccare. La coesina, infatti, era presente inizialmente su tutto il braccio

dei cromatidi, ma era già stata degradata ovunque oltre che sul centromero. L’APC, inoltre, degrada

anche la ciclina A, quindi si riduce la concentrazione di MPF.

Quando i cromatidi fratelli si sono staccati e allontanati, le proteine passeggere inviano un segnale:

l’APC si lega ad un altro fattore di specificità che va a degradare anche la ciclina B (alla fine

dell’anafase).

La degradazione delle cicline porta alla defosforilazione di tutto ciò che era stato fosforilato da

MPF. In questo modo, l’actina e la miosina possono di nuovo interagire, formando il solco di

divisione (solco di clivaggio) delle due cellule figlie nel punto segnato dalle proteine passeggere.

Il ruolo di p53

I punti di controllo del ciclo cellulare servono a verificare che il DNA non sia danneggiato, sia

completamente replicato prima della fase mitotica e che i cromatidi fratelli si distribuiscano

esattamente tra le cellule figlie. In caso di danno al DNA, la proteina p53 (“il guardiano del

genoma”) blocca la prosecuzione del ciclo cellulare, in attesa che il danno sia riparato. Se il DNA è

troppo danneggiato, la cellula viene indotta all’apoptosi (morte cellulare programmata).

Abbiamo detto che se il DNA è danneggiato, i danni sono segnalati e gli enzimi per la riparazione

vengono attivati, in modo da riparare il danno. Se sono molto estesi, si attiva un sistema per cui le

chinasi fosforilano p53 (guardiano del genoma) che, una volta fosforilata, si stabilizza. Così, p53

induce gli enzimi della rigenerazione, blocca il ciclo cellulare e, se la riparazione non avviene, porta

all’apoptosi della cellula. Ma com’è possibile bloccare il ciclo cellulare? Vengono sintetizzati degli

inibitori, che prima non erano presenti, sotto il controllo di p53, che è anche un fattore di

84  

Giorgia Palladino

trascrizione. Ad esempio, se viene sintetizzata p21, questa blocca la sintesi della ciclina E. nel caso

il ciclo venga bloccato in fase S, deve essere fermata la sintesi della ciclina A; in G2, invece, viene

bloccata la fosfatasi che stacca dei gruppi fosforici che inibiscono MPF. Si chiama mdm2 il

degradatore di p53, attivato se non ci sono danni da riparare.

La meiosi

Il concetto di trasmissione dei geni per la riproduzione della specie, in biologia, è ancora un

concetto molto instabile. Ci chiediamo, infatti, se i geni sono il mezzo con cui una specie si

trasmette da una generazione all’altra o viceversa, ovvero se non potrebbe essere l’individuo il

veicolo che consente ai geni di riprodursi. Questa domanda, ancora non ha trovato risposta, ma ce

ne possiamo porre un’altra a cui i biologi hanno già risposo. Riproduzione e sessualità sono

inscindibili? Secondo la biologia no, perché la riproduzione è la formazione di nuovi organismi da

organismi pre-esistenti da cui questi ereditano i geni, mentre la sessualità è lo scambio o il

mescolamento di geni tra individui diversi. Infatti, riproduzione e sessualità si sono evolute in

maniera indipendente e si sono incontrate nella riproduzione sessuata. I batteri, ad esempio, si

riproducono per riproduzione asessuata (scissione), ma hanno evoluto alcuni adattamenti

parasessuali, cioè lo scambio di geni tra organismi, per scambiarsi geni e aumentare la loro

variabilità; infatti, occorre ricordare che l’evoluzione necessita della variabilità dei caratteri di una

popolazione per il suo lavoro di selezione.

La meiosi è una fonte di variabilità genetica perché l’assortimento dei cromosomi è casuale e la

variabilità aumenta esponenzialmente man mano che aumenta il numero di cromosomi di una

specie. La meiosi è costituita da due divisioni cellulari, ma è preceduta da una sola duplicazione del

DNA: i gameti avranno la metà dei cromosomi rispetto alle cellule somatiche; quindi, la prima

divisione è già riduzionale. Ma in che cosa differisce la meiosi dalla mitosi? Che problemi deve

risolvere la cellula nella regolazione della meiosi?

Scambio (crossover), chiasmi e separazione dei cromatidi che hanno subito lo scambio

• (risoluzione dei chiasmi);

Nella fase iniziale della profase della prima divisione meiotica, c’è la necessità che i cromatidi

• fratelli stiano insieme fino alla fine della prima divisione meiotica, per cui rimangono uniti nei

punti di scambio (detti chiasmi). Vengono poi separati in meiosi II come se si trattasse di una

normale mitosi;

Mancanza di interfase tra la meiosi I e la meiosi II;

• Interruzioni anche lunghissime (anni) nel processo di meiosi della femmina. Nel gamete

• femminile, infatti, la meiosi ha due blocchi e due riprese, e la divisione avviene con una

distribuzione molto asimmetrica del citoplasma dell’ovocita I e II;

Una sola fase S, due divisioni cellulari;

• Uno degli svantaggi della riproduzione sessuata è che occorre incontrare un partner per riprodursi;

Quindi, la meiosi introduce due fonti di variabilità, cioè l’assortimento dei cromosomi e il crossing

over, che rendono ogni gamete unico. Inoltre, l’unione casuale del gameti introduce una terza fonte

di variabilità, derivante dall’unione di due diversi patrimoni genetici. Questo rende la riproduzione

sessuata un meccanismo che genera individui tutti diversi tra loro, un grande vantaggio per la

sopravvivenza della specie.

Lo scambio, o crossing over

Prima che inizi la prima divisione meiotica, i cromosomi omologhi si scambiano dei tratti omologi;

questo determina delle differenze tra i cromatidi fratelli di ciascun cromosoma. Di conseguenza,

anche se ci fosse una sola coppia di cromosomi, i quattro gameti risultanti sarebbero tutti diversi tra

loro.

C’è una sostanziale differenza tra la gametogenesi maschile e quella femminile: la meiosi maschile

produce quattro gameti, spermatozoi, mentre quella femminile produce un solo gamete,

l’ovocellula, e tre glubuli polari. 85  

Giorgia Palladino

Le due funzioni principali del crossover sono l’aumento della variabilità genetica e il mantenimento

dell’accoppiamento dei cromosomi omologhi fino all’anafase I.

Varie proteine dirigono la formazione del complesso sinaptinemale, che si forma all’inizio della

profase I e guida il processo di scambio. I cromosomi omologhi restano uniti nei punti di scambio

fino al momento in cui si dispongono, a coppie, sul piano equatoriale e i microtubuli del fuso si

collegano ai centromeri.

In una prima fase, detta leptonema o leptotene, i cromosomi cominciano a condensare; nella

seconda fase, zygonema o zygotene, lungo la parete centrale dei due omologhi si localizzano le

proteine per lo scambio.

I primi tagli al filamento sono effettuati da Spo11, un’endonucleasi; poi, MRX, una 5’-

endonucleasi, accorcia il filamento tagliato e, in seguito, Rad51 e Dmc1 stirano il filamento di DNA

per avvicinarlo al cromosoma omologo e formare un D-loop. In base a come sono stati tagliati i

filamenti, avremo il crossover oppure no.

La regione in cui avviene la ricombinazione è detta heteroduplex, ed è la zona in cui i due filamenti

di DNA nello stesso cromosoma non sono necessariamente complementari. Poiché questa

ricombinazione è vista dalla cellula come un errore, come un cattivo accoppiamento, la cellula va a

correggere questo errore. Vi sono prove che vi sia sintesi de novo di DNA per riparare le regioni in

cui si è formato un heteroduplex oltre che per gli eventi di legatura. Se non si ha la completa

riparazione del DNA, si attiva il check point che impedisce il passaggio in fase M (fosforilazione

inibente della CDK1, attivazione di ATM che porta alla degradazione di Cdc25A e inibizione della

sintesi di CDK1).

Il compito delle proteine coinvolte nella ricombinazione meiotica è estremamente arduo. Ogni

taglio a singolo filamento (SSB) genera un tratto di circa 1 Kb, che deve riconoscere il tratto

omologo a doppio filamento al quale accoppiarsi. Si è detto che questo equivale, nelle cellule

umane, a trovare un tratto di 20 cm su 2500 km. Inoltre, alcune centinaia di scambi hanno luogo in

contemporanea in ogni cellula in meiosi, e non ci possono essere errori.

La ricombinazione mitotica avviene a scopo di riparazione tra cromatidi fratelli durante la fase S

(tra l’altro, il filamento tagliato trova con facilità il cromatidio fratello mentre, nella ricombinazione

meiotica, bisogna che trovi il cromatidio del cromosoma omologo). Nei batteri l’enzima chiave per

la ricombinazione mitotica è RecA. L’omologo eucariote è la proteina Rad51, così denominata

perché svolge un ruolo nella riparazione dei danni da radiazione (è infatti coinvolta anche nella

riparazione mitotica).

La fase di diplotene richiede l’attivazione di MPF. A tale scopo, è necessario che le rotture a doppio

filamento (DBS) introdotte dalla nucleasi Spo11 all’inizio dello zigotene siano state riparate. Il

controllo della riparazione è lo stesso che consente l’avvio della fase M in mitosi: finché la

riparazione non è avvenuta, la chinasi ATM attiva p53, che a sua volta inibisce l’attivazione della

fosfatasi cdc25, l’enzima necessario per rimuovere i fosfati inibitori della Cdk1.

Un diverso blocco di MPF viene esercitato nella femmina in modo da completare la meiosi I solo al

momento dell’ovulazione.

Vi sono altri controlli che sono finora meno noti. Il più importante riguarda il controllo che tutte le

coppie di cromosomi abbiano avuto almeno un crossing over, che consente loro di formare i

chiasmi e di posizionarsi correttamente in metafase. È noto che i cromosomi in cui non vi sono stati

scambi (e quindi non hanno formato chiasmi) non si condensano e ciò ritarda il completamento

della profase I. Tuttavia, quale sia il meccanismo di controllo non è ancora chiaro.

Lo shugoshin

I cromatidi omologhi non devono separarsi nell’anafase I della meiosi. È stata identificata una

nuova famiglia proteica, detta shugoshin, che protegge le proteine di coesione nei centromeri dei

cromatidi fratelli durante la meiosi I. Inoltre, è stato stabilito che la stessa shugoshin svolge un ruolo

fondamentale per il cinetocore, evitando l’instabilità cromosomica anche durante la mitosi. Le

coesine presenti in mitosi e in meiosi differiscono per alcune componenti (Rad21 e Rec8), che

determinano a loro volta la sensibilità alla separasi e il legame con shugoshin. 86  

Giorgia Palladino

La regolazione della meiosi nell’oocita, o ovocita

Nella vita intrauterina di una femmina, gli ovogoni si differenziano in ovociti, ancora diploidi.

Durante la vita mestruale, si ha la divisione di questi ovociti primari diploidi. Con l’ovulazione si ha

la prima divisione meiotica dell’ovocita primario in ovocita secondario e un primo globulo polare.

Se l’ovocita secondario viene fecondato, si ha una seconda divisione meiotica e l’ovocita

secondario si differenzia in ovocita e secondo globulo polare.

La meiosi dell’ovocita, quindi, è interrotta due volte: in profase I (dal periodo prenatale

all’ovulazione) e in metafase II (in attesa della fecondazione). L’attività di MPF è indispensabile

per la ripresa della meiosi. L’andamento di MPF nella regolazione della meiosi nell’oocita è

correlato alle due fasi di ripresa del ciclo. Viceversa, il blocco in metafase II è causato dalla

mancata attivazione di APC, per cui né le coesine né le cicline vengono degradate.

Ma che cosa regola l’andamento dell’MPF nella meiosi?

à

Arresto in G2 può durare molti anni. L’attività MPF è bloccata prima dell’ovulazione con due

• meccanismi principali, entrambi dipendenti da un elevato livello di cAMP (che determina, a sua

volta, un alto livello di PKA). I livelli elevati di cAMP dipendono dal contatto con le cellule del

follicolo, (passaggio attraverso giunzioni comunicanti o stimolazione dell’adenilato ciclasi

dell’oocita). Quindi, cAMP inibisce indirettamente la fosfatasi cdc25 (che attiva MPF) e le chinasi

che inibiscono la chinasi Myt (che inibisce MPF).

à

I ripresa e I divisione meiotica al momento dell’ovulazione, il progesterone attiva un recettore

• di superficie accoppiato a una proteina G, che inibisce l’adenilato ciclasi (l’enzima che sintetizza

cAMP). I livelli di MPF si innalzano e la I divisione meiotica può aver luogo, con l’espulsione del

primo globulo polare. à

Arresto in metafase II la telofase I non è completa: il nucleo non si despiralizza del tutto e la

• ciclina mitotica non viene completamente degradata, in quanto le stesse chinasi che hanno attivato

MPF stimolano un fattore CSF (fattore citostatico) che inibisce APC. Esse, inoltre, attivano Bub1,

un fattore del checkpoint della metafase, che contribuisce a inibire APC. Di conseguenza, il

nucleo non passa attraverso una seconda fase S, né attraverso una seconda profase e progredisce

direttamente fino alla metafase II. Questa, però, non può essere completata a causa dell’inibizione

di APC e Bub1. ++

à

II ripresa e II divisione meiotica la fecondazione causa un influsso di Ca , come abbiamo già

• visto. Questa inibisce tutte le attività chinasiche che contribuiscono al blocco della meiosi (CSF);

la meiosi può riprendere e completarsi, con l’espulsione del secondo globulo polare.

La morte cellulare

Esistono vari meccanismi di morte cellulare. Quelli principali sono:

Necrosi; è un evento accidentale dovuto ad un fattore esterno e passivamente subito dalle cellule.

• Si tratta di eventi dovuti a un trauma, avvelenamento, anossia, ecc. Di solito colpisce un gruppo di

cellule, portandole alla lisi cellulare, che a sua volta è segno di infiammazione perché le cellule

riconoscono il materiale come non-self (autoimmunità).

Apoptosi; è un evento programmato attivamente realizzato dalle cellule e realizzato di norma in

• condizioni fisiologiche. Di solito interessa singole cellule che, con dei processi di segnalazione,

portano alla degradazione finale della cellula. La frammentazione della cellula e le modificazioni

di superficie ne favoriscono la fagocitosi, da parte di fagociti specializzati o cellule vicine.

L’apoptosi non porta a processi di infiammazione o autoimmunità perché è la morte fisiologica

della cellula.

Autofagia; è il meccanismo abitualmente utilizzato per eliminare organuli danneggiati o inutili.

• Può anche essere attivata per ricavare energia, in caso di deficit energetico, e, in condizioni

estreme, può portare alla morte cellulare. Il processo di autofagia si evidenzia con la formazione di

vescicole autofagiche. 87  

Giorgia Palladino

In tempi recenti si è visto che il dualismo necrosi/apoptosi nascondeva in realtà una situazione più

complessa. Si è infatti visto che le due forme di morte possono a volte sfumare l’una nell’altra (ad

esempio una cellula può iniziare la morte per apoptosi e poi, in carenza di energia, non portarla a

termine e morire sostanzialmente per necrosi). Quando la cellula entra in necrosi si rigonfia, il suo

contenuto si lisa e viene disperso. La cellula in apoptosi, invece, attiva dei processi di contrazione

dell’actina e l’intera cellula si divide nei corpi apoptotici, mentre nel nucleo il DNA si frammenta.

Inoltre, si è visto che esiste una forma importante di morte cellulare che non era stata in precedenza

riconosciuta, la morte per autofagia. Una cellula ricorre in genere all’autofagia in condizioni di

carenza di sostanze nutrienti. Tuttavia, in certi contesti, l’autofagia viene attivata dagli stessi

meccanismi che in altri contesti porterebbero all’apoptosi e anche l’autofagia richiede l’attivazione

di specifici geni. Quando una cellula compie autofagia, si formano al suo interno delle vescicole

autofagiche che avvolgono gli organelli, fino a formare un corpo autofagico che, poi, si fonderà con

un lisosoma.

L’apoptosi può essere, in alcuni casi, anche indotta da particolari cellule. I linfociti T-killer, ad

esempio, possono indurre una cellula ad andare in apoptosi nel caso in cui questa sia riconosciuta

come cellula estranea, trasformata da un virus o da un cancro o trapiantata e non compatibile.

Che cos’è l’apoptosi

Al microscopio, possiamo notare una modificazione delle dimensioni di una cellula apoptotica.

Infatti, la condensazione citoplasmatica provoca una contrazione cellulare e la cromatina si aggrega

in masse dense e compatte.

Ma che cos’è, nello specifico, l’apoptosi? Il termine apoptosi deriva dal greco apo=oltre e

ptosis=cadere, e letteralmente indica la caduta delle foglie dagli alberi o dei petali dei fiori. Il

termine apoptosi è stato introdotto per la prima volta nel 1972 da Kerr, che lo usò per descrivere un

quadro di morte cellulare in colture di epatociti, che differiva totalmente dalla morte cellulare per

necrosi.

L’apoptosi è una modalità di morte cellulare attiva, tipica delle cellule di organismi pluricellulari; è

infatti una forma di “suicidio altruista”, per cui spesso la cellula si sacrifica per il bene dell’intero

organismo. Le modalità della morte sono finalizzate ad evitare l’instaurarsi di fenomeni di

infiammazione e autoimmunità e questo fa sì che la morte cellulare non sia avvertita dall’organismo

(morte indolore).

Quindi, si parla di programma apoptotico perché questo processo viene portato avanti attivamente,

con dispendio di energia, ed è innescato da induttori specifici. L’apoptosi, infatti, richiede l’azione

dei prodotti specifici di alcuni geni che sono conservati nel corso dell’evoluzione e che rispondono

a più stimoli.

Caratteristiche biochimiche delle cellule apoptotiche: le caspasi

Le caspasi sono proteasi specifiche del meccanismo di attuazione dell’apoptosi; vengono

sintetizzate come pro-enzimi (enzimi proteolitici che contengono la cisteina nel centro reattivo)

inattivi e, una volta attive, generano reazioni a catena. L’attivazione delle caspasi è l’evento che

segna l’inizio dell’apoptosi. Le caspasi si dividono in due gruppi:

Caspasi iniziatrici (caspasi-8, -9, -2, -10); vengono attivate in risposta a stimoli apoptotici e

• attivano le caspasi effettrici

Caspasi effetrici (caspasi-3, -7, -6); tagliano numerosi substrati, determinando tutte le

• caratteristiche morfologiche e funzionali tipiche della morte per apoptosi (degradazione del DNA,

blebbing, segnalazione per la fagocitosi, ecc.)

Le caspasi vanno a degradare proteine specifiche riconosciute da una sequenza di quattro

amminoacidi, di cui l’ultimo è l’acido aspartico (per questo il “asp”=aspartico di caspasi). Le vie

dell’apoptosi, quindi, vanno ad attivare le caspasi iniziatrici che, a loro, vola, attivano le caspasi

effettrici, che inducono i fenomeni di apoptosi.

I virus, quando infettano una cellula, ingaggiano una vera e propria lotta contro la cellula infettata,

cercando di evitare che essa si suicidi, il che comprometterebbe la riproduzione del virus stesso. Per

88  

Giorgia Palladino

questo motivo, i virus spesso sintetizzano inibitori delle caspasi. Anche le cellule tumorali, per

evitare di essere indotte al suicidio, spesso sintetizzano questi inibitori delle caspasi.

Sulla membrana plasmatica dei mitocondri si trova una proteina di membrana a cui si associa il

citocromo-c, un trasportatore di elettroni. Se la membrana mitocondriale viene alterata con una

depolarizzazione del potenziale di membrana, la permeabilità della membrana mitocondriale esterna

viene modificata e si aprono dei pori che consentono il rilascio del citocromo-c nel citoplasma, dove

poi si unirà ad un mediatore. Questo fenomeno è controllato dai modulatori dell’apoptosi e va ad

attivare le caspasi iniziatrici. Quindi, le molecole pro e anti-apoptotiche regolano l’apertura dei pori

per la fuoriuscita del citocromo-c.

Una volta attive, le caspasi attivano le Dnasi, responsabili del taglio di substrati nucleari e

frammentazioni del DNA. Il DNA viene digerito da una Dnasi caspasi-dipendente (CAD) in

frammenti di 180 bp (taglio delle unità nucleosomiali). CAD è di norma associata ad un inibitore

(iCAD); il taglio di iCAD indotto da una caspasi esecutrice (caspasi-3) attiva CAD che digerisce il

DNA in frammenti. La frammentazione avviene a livello dei siti accessibili tra i nucleosomi.

Lo scopo del taglio è il fatto che il DNA, frammentato in questo modo, diventa innocuo quando

viene fagocitato, quindi non può indurre la trasformazione della cellula che lo fagocita.

Fagocitosi: segnali “eat-me” nelle cellule di mammifero

La cellula in apoptosi deve segnalare a quelle vicine, o a dei fagociti specifici, di voler essere

fagocitata. Questa segnalazione avviene attraverso i cosiddetti segnali “eat-me”, di cui il principale

è un fosfolipide di membrana del versante citoplasmatico che viene flippato all’esterno. Infatti,

durante lo stimolo apoptotico, la fosfatidilserina (PS) trasloca dalla parte citoplasmatica alla parte

extracellulare della membrana plasmatica. È, quindi, la fagocitosi che protegge l’organismo

dall’instaurarsi di fenomeni infiammatori o di auto-immunità.

Un’altra categoria di proteine coinvolte nell’apoptosi sono i modulatori: per effetto di segnali

esterni o di una dinamica interna (es. presenza di danni non riparabili al DNA), variano nel

citoplasma le concentrazioni di molecole anti- o pro-apoptotiche. Se queste ultime prendono il

sopravvento, si attiva il processo di apoptosi che può avvenire in due vie principali:

Via estrinseca; mediata dai recettori di morte

• Via intrinseca; mediata dai mitocondri

La via estrinseca

La via estrinseca viene attivata da specifici segnali extracellulari (es. FasL, TNF) e coinvolge i

recettori di morte. I recettori della membrana cellulare formano dei trimeri che ricevono dei segnali

solubili, localizzati sia sulla superficie dei linfociti T-killer che sparsi nel citoplasma. Quando il

ligando arriva al suo recettore, la porzione citoplasmatica si modifica e attira altre molecole, ovvero

il recettore attira delle proteine dette adattatori che attirano le pro-caspasi iniziatrici. Con

l’attivazione delle caspasi iniziatrici e, successivamente, delle caspasi effettrici, si ha il taglio

proteolitico dei bersagli a valle (attivazione di CAD).

La via intrinseca

Questa via parte da una necessità interna della cellula, che può essere attivata da sostanze chimiche,

radiazioni o radicali liberi che provocano danni al DNA (importante ruolo di p53) o per la

mancanza di fattori di sopravvivenza.

In questo caso, viene traslocato Bax, un fattore pro-apoptotico, sulla superficie del mitocondrio, in

modo da provocare l’apertura dei pori e la fuoriuscita del citocromo-c, che si associa all’adattatore

Apaf1 e a dATP, formando un complesso con la procaspasi 9. Si ha così la formazione

dell’apoptosoma e l’attivazione della caspasi-iniziatrice (caspasi-9), che si attiva e dà inizio alla

cascata di caspasi.

Il B-cell linfoma, o Bcl-2, è stato il primo fattore apoptotico ad essere scoperto. Questo linfoma,

infatti, produce grandi quantità di fattore anti-apoptotico e, se modificato, diventa un cancro. I

89  

Giorgia Palladino

fattori della famiglia di Bcl-2 sono tutti fattori apoptotici, sia a favore che contro, perché sono tutti

della stessa famiglia (domini comuni).

Le due vie dell’apoptosi

La via estrinseca e quella intrinseca trovano un punto di convergenza nella proteina Bid. Quando le

caspasi tagliano il substrato, questa parte tagliata diventa una parte pro-apoptotica, che arriva al

mitocondrio e attiva la via intrinseca. Quindi, la caspasi-8 è in grado di attivare Bid. Anche se

questa è inattiva, se viene scissa può attivare Bax e portare al rilascio del citocromo-c. Oltre al

citocromo, dal mitocondrio escono anche altre molecole che sono inibitori dell’inibitore

dell’apoptosi e che eliminano gli inbitori propri della cellula o posti da un virus e che impediscono

l’apoptosi. Anche i fattori di crescita sono fattori di sopravvivenza e hanno un ruolo nella

repressione della via intrinseca. Anche il contatto cellula-cellula o cellula-ECM (matrice) può

svolgere lo stesso ruolo.

Circostanze in cui si osserva l’apoptosi

Sviluppo embrionale/fetale; da un certo punto dello sviluppo embrionale, alcune strutture vengono

• eliminate. Oltre a strutture intere, abbiamo la morte cellulare di gruppi di cellule per apoptosi

durante lo sviluppo embrionale, ad esempio nel sistema nervoso. Infatti, durante la formazione

dell’embrione vengono prodotte più del doppio delle cellule nervose necessarie e i neuroni entrano

in competizione tra loro, cercando di raggiungere per primi i territori da innervare. Quelli che non

raggiungono in tempo utile il bersaglio, vanno incontro ad apoptosi. Questo meccanismo viene

messo in atto perché l’organismo si assicuri che tutte le zone vengano innervate

Metamorfosi; alcune parti del corpo possono essere perse per apoptosi, ad esempio la coda dei

• girini o la membrana interdigitale degli esseri umani. Poiché la morte per apoptosi non è dolorosa,

questo non è un evento traumatico per l’organismo. Un altro esempio è quello del verme C.

elegans, poichè nel periodo embrionale di un verme ermafrodita si formano 1090 cellule, ma 131

muoiono per apoptosi durante lo sviluppo

Mantenimento dell’omeostasi cellulare; l’omeostasi cellulare è il frutto di un sottile equilibrio,

• finemente regolato, tra proliferazione e morte cellulare. Una carenza di apoptosi porta ad un

eccesso di cellule, cioè a cancro o tumori, mentre un’eccessiva apoptosi porta ad una carenza di

cellule, cioè a degenerazione e aplasia. Molte cellule sembrano contenere nel genoma un

programma di suicidio, la cui soppressione è indispensabile per la continua sopravvivenza

dell’organismo. La soppressione del programma di suicidio si attua attraverso fattori e segnali

esterni (fattori di sopravvivenza, attacco al substrato, ecc.) che determinano un controllo sociale

delle cellule

Normale turn-over tissutale; le cellule staminali proliferano e si differenziano e, man mano che si

• accrescono, invecchiano e muoiono per apoptosi. Questo succede perché vengono logorate e,

quindi, devono essere sostituite da quelle sottostanti più giovani. Ad esempio, le cellule che vanno

in apoptosi grazie alla caspasi-3 all’apice dei villi intestinali, possono essere rilasciate nel lume

intestinale o essere fagocitate

Ontogenesi e omeostasi del sistema immunitario; le cellule T (del timo) maturano, acquisiscono

• capacità funzionali e apprendono il concetto di self all’interno del timo. I linfociti T maturi

vengono riversati nel sangue periferico, dove svolgono la loro attività citotossica. Le cellule T che

non superano il processo della selezione timica vengono eliminate tramite apoptosi, poiché

potenzialmente pericolose per l’organismo. Anche le cellule del sistema immunitario, una volta

guarita l’infiammazione, muoiono per mancanza dell’antigene e perché non ricevono più segnali

di sopravvivenza. Infatti, quando la sopravvivenza dei cloni linfocitari non è più necessaria, in

quanto non è più presente l’antigene, i linfociti esprimono il recettore Fas e vanno incontro ad

apoptosi

Atrofia ormone-dipendente; ad esempio, la ghiandola mammaria si sviluppa con la crescita ed

• aumenta nuovamente con l’allattamento. Con la fine di questo, regredisce a causa del calo

90  

Giorgia Palladino

dell’ormone prolattina. Un altro esempio è quello della mucosa uterina, che si sfalda a causa del

calo del progesterone nel caso in cui l’ovulo non venga fecondato; quindi il progesterone è un

segnale di sopravvivenza per la mucosa uterina

Deprivazione dei fattori di crescita; come abbiamo detto, molte cellule sembrano contenere nel

• genoma un programma di suicidio, la cui soppressione è indispensabile per la continua

sopravvivenza. La soppressione del programma di suicidio si attua attraverso fattori e segnali

esterni (fattori di sopravvivenza, attacco al substrato, ecc.) che determinano un controllo sociale

delle cellule. Le cellule, quindi, competono per fattori di crescita che, allo stato stazionario, non

bastano per tutte e la morte per apoptosi è conseguenza di un’insufficienza di fattori di crescita.

Ma perché vengono prodotte più cellule di quelle necessarie? Prendiamo, ad esempio, una cellula

precursore del sistema emopoietico, che potenzialmente può diventare produttore di piastrine,

globulo rosso, granulocita, ecc. Nel caso arrivi un’infezione, l’organismo aumenterà i fattori di

sopravvivenza in modo da far sviluppare più cellule, ad esempio granulociti, di quelle che si

formerebbero in condizioni normali. Questo succede perché in caso di infezione serve una risposta

immediata, quindi le cellule devono essere già pronte e l’organismo non ha il tempo necessario per

produrne di nuove con il giusto tempismo

Perdita del contatto cellula-cellula e cellula- substrato; si dice anoichisi la condizione per cui la

• cellula perde il contatto con la matrice. In questo caso, la cellula non riceve più segnali di

sopravvivenza perché non è più nel suo ambiente, e quindi va in apoptosi. Questa modalità di

apoptosi è un metodo di difesa dell’organismo contro i tumori. Lo stesso discorso vale per la

perdita del contatto cellula-cellula (e dei segnali elettrici): ad esempio, quando la cellula

muscolare perde il contatto con il nervo va in atrofia, perché non riceve più impulsi e segnali

elettrici

Citotossicità cellulo-mediata; il linfocita T-citotossico riconosce una cellula infettata da un virus

• grazie all’interazione dei recettori Fas-FasL (via intrinseca) e la induce all’apoptosi. Oppure, il

linfocita T-citotossico può inserire una caspasi già attiva, il granzyme B, nella cellula bersaglio, ad

esempio tumorale, inducendone l’apoptosi. La perforina, anch’essa prodotta dal linfocita T-

citotossico, media l’ingresso del granzyme B nel citoplasma della cellula bersaglio. Quindi, il

granzyme è la terza via che porta all’apoptosi, oltre alla via estrinseca e quella intrinseca.

Tossine, farmaci;

• Radiazioni;

• Infezioni virali;

Danno al DNA e apoptosi

Tossine, farmaci, radiazioni e infezioni virali possono portare a un danno del DNA. Abbiamo visto

che, se il danno è molto esteso, la cellula attiva p53 che blocca il ciclo cellulare e tenta di riparare

tale danno. Se questo viene riparato, viene riattivato il ciclo cellulare; in caso contrario, p53 attiva

dei segnali pro-apoptotici.

Modulatori dell’apoptosi

Abbiamo visto che il primo modulatore anti-apoptotico scoperto fu Bcl-2, che era espresso in

eccesso in cellule leucemiche. I modulatori anti-apoptotici possono essere considerati oncogeni. Un

importante modulatore pro-apoptotico è Bax: esso viene indotto da p53 quando i danni al DNA non

sono riparabili ed è meglio per l’organismo che la cellula muoia, piuttosto che sopravviva con un

DNA alterato che la potrebbe portare alla trasformazione tumorale. I modulatori pro-apoptotici

possono, invece, essere considerati oncosoppressori.

Apoptosi e cancro

L’apoptosi è la modalità di morte con cui l’organismo elimina, in condizioni fisiologiche, le cellule

che, per vari motivi, sono eccedenti le sue necessità, e quindi inutili, e potenzialmente pericolose,

cioè trasformate, infettate da virus o con mutazioni. Ne consegue che tute le molecole che

91  

Giorgia Palladino

favoriscono l’apoptosi sono da annoverarsi tra gli oncosoppressori e quelle che la inibiscono sono

potenzialmente oncogeni. Quindi p53, che induce l’apoptosi nelle cellule con DNA danneggiato, è

infatti il prototipo degli oncosoppressori. Bcl-2, invece, è il prototipo dei modulatori anti-apoptotici

e fu identificato per la prima volta in cellule di linfoma, che lo esprimevano in eccesso ed erano così

ostacolate ad entrare in apoptosi. Esso è a tutti gli effetti un oncogéne.

La differenza tra un cancro e un tumore è che il tumore è benigno, ma può diventare maligno,

mentre il cancro è esclusivamente maligno.

La senescenza

In caso di danno al DNA non riparabile, la cellula può, in alternativa all’apoptosi, decidere di

andare in senescenza. La cellula entra quindi in G , ovvero viene esclusa per sempre dal ciclo

z

cellulare, cessa di dividersi e può rimanere in tale stato anche per decine di anni. Assume un aspetto

appiattito ed esprime in grande quantità beta-galattosidasi, un enzima lisosomiale, il che consente ai

ricercatori di evidenziarla con una semplice reazione che la colora in blu. Non è ancora bel chiaro

da dove venga la scelta della cellula tra apoptosi e senescenza, ma sappiamo che comunque è

coinvolta p53.

La senescenza è una situazione favorevole nella vita giovanile dell’organismo, perché mantiene

inalterato il numero di cellule, ma nella vita di anziano un grande numero di cellule senescenti può

dare dei problemi; infatti, le cellule senescenti si dicono “buoni cittadini ma cattivi vicini” in quanto

emettono sostanze che inducono alla trasformazione tumorale delle cellule vicine.

Un'altra importante causa di senescenza è l’eccessivo accorciamento dei telomeri. Quando la

lunghezza dei telomeri scende al di sotto di un dato limite, la cellula cessa di dividersi, perché un

ulteriore accorciamento dei telomeri renderebbe la instabile il suo genoma. Infatti, i cromosomi

tenderebbero ad appiccicarsi agli estremi, portando ad aneuploide. Si attiva così un check-point che

è una variante della DNA-damage response (DDR), che coinvolge p16, un inibitore della

fosforilazione di Rb. Il ciclo della cellula, quindi, si blocca in G .

1

Dunque, esistono due vie diverse che portano alla senescenza, cioè un danno esteso o l’eccessivo

accorciamento dei telomeri. La senescenza, però, non è sempre una buona scelta per la cellula

perché, se i meccanismi di regolazione non funzionano, la trasformazione cellulare può essere una

temibile alternativa.

Oncogeni, oncosoppressori e la teoria unificata del cancro

Il cancro si può identificare con più di una caratteristica:

È una crescita incontrollata di cellule

• Ha un potenziale moltiplicativo illimitato

• Le cellule cancerose diventano immortali perché bypassano i controlli sulla lunghezza dei telomeri

• grazie all’espressione della telomerasi

Le cellule cancerose mancano totalmente o parzialmente di maturazione differenziativa, ovvero

• non sono funzionali perché non sono differenziate e stoppano i segnali di blocco che portano la

cellula alla senescenza. Inoltre, non si differenziano perché le cellule differenziate perdono la

capacità riproduttiva

Le cellule cancerose si contrappongono e sono indipendenti dalla presenza di segnali di

• proliferazione, come i fattori di crescita. Le cellule normali, infatti, crescono quando hanno spazio

per farlo (inibizione da contatto), mentre quelle cancerose si dividono indipendentemente dai

segnali di proliferazione, ovvero riescono a sopravvivere anche in carenza di adesione

(autosufficienza, autocrinia). Se una cellula è trasformata, infatti, continua a crescere anche in

mancanza di spazio: in vitro si può osservare la formazione di foci, cioè cumuli, di crescita.

Per capire se una o più cellule sono trasformate, bisogna vedere se causano un cancro iniettandole

in un animale vivo, dove possono sopravvivere anche senza fattori di crescita. La proliferazione,

infatti, di solito richiede due segnali: quello di proliferazione, che necessita di sapere se la cellula si

trova nella sua sede per potersi duplicare, e quello di contatto totale con altre cellule, poiché in quel

92  

Giorgia Palladino

caso significa che non c’è abbastanza spazio per proliferare. Nel tempo, inoltre, le cellule cancerose

acquisiscono altre mutazioni (la cosiddetta progressione tumorale) per evitare i controlli:

Motilità e invasività attraverso le metastasi, cose che una cellula sana non attiva se si trova nella

• sua sede

Sintesi di enzimi in grado di ledere il tessuto connettivo; in questo modo, la cellula si fa spazio per

• muoversi, esce dal suo sito ed entra nei vasi sanguigni per creare nuove metastasi

A volte riescono ad eludere il controllo esercitato dal sistema immunitario, che solitamente riesce

• ad uccidere le cellule riconosciute come estranee inducendole all’apoptosi

Le cellule tumorali, inoltre, hanno un metabolismo alterato, che si basa maggiormente sulla glicolisi

anaerobia che sulla fosforilazione ossidativa. In questo modo, però, accumulano acido lattico, ma

effettuano una maggior degradazione delle proteine. Questo accade perché spesso la massa

tumorale non è raggiunta dai vasi, e quindi riceve meno ossigeno, che non permette loro la

fosforilazione tradizionale. Alcune di queste cellule, dunque, possono morire per necrosi (mancanza

di ossigeno) e, così, spargono sostanze che portano all’infiammazione. Inoltre, le cellule cancerose

tendono ad indurre nel paziente un’estrema magrezza, poiché lo rendono incapace di assorbire il

nutrimento sottraendo all’organismo le sostanze nutritizie, e spesso sviluppano la resistenza ai

farmaci e ai trattamenti antiblastici. La condizione per cui la cellula tumorale diffonde sostanze

tossiche nell’organismo e gli sottrae sostante nutritizie, provocandone l’estrema magrezza, si

chiama cachexia.

Inoltre, le cellule tumorali producono una sostanza che richiama i vasi dal tessuto circostante,

ovvero induce a una neo angiogenesi. Si può cercare di controllare questo aspetto con dei farmaci,

ad esempio il tallidomide. Inizialmente questo farmaco fu usato come antinausea per le donne

incinte, ma provocò gravissimi danni ai feti in quanto, appunto, contrasta la formazione di nuovi

vasi sanguigni. Quindi ha trovato un nuovo impiego nella cura contro il cancro. Per quel che

riguarda la resistenza ai farmaci, invece, la cellula tumorale riesce ad aumentare l’espressione dei

trasportatori di membrana e li usa per eliminare i farmaci antitumorali (multi-drug resistance). Per

di più, le cellule tumorali esprimono in grandi quantità Bcl2, un antiapoptotico, e quindi perdono la

capacità di andare in apoptosi. Inoltre, i recettori di membrana per i segnali apoptotici che,

solitamente, provocano la via estrinseca vengono alterati con una mutazione, quindi la via

estrinseca viene bloccata. La cellula tumorale può anche produrre un eccesso di inibitori delle

caspasi che sono presenti nella cellula e che, se rimossi, vanno ad attivare le caspasi effettrici (come

fanno i virus).

La cellula tumorale è instabile geneticamente perché, quando subisce una mutazione, viene

modificato il numero di cromosomi. Questo va ad attivare il blocco della proliferazione, che

dovrebbe portare la cellula all’apoptosi e alla senescenza. Poiché, però, la cellula tumorale perde la

capacità di attivare p53, essa sopravvive anche se è geneticamente mutata e non risponde più ai

segnali che la indurrebbero alla non proliferazione e alla morte.

Nel cancro, non esiste una demarcazione netta nel tempo tra tumore benigno e maligno. All’inizio,

infatti, la cellula presenta alcune mutazioni, come una maggior proliferazione e l’assenza di

apoptosi. Poi, viene indotta ad altre mutazioni se favorita da un ambiente ricche di ROS (specie

reattive dell’ossigeno), che sono prodotti dai meccanismi dell’infiammazione. Questi ROS, infatti,

sono in grado di alterare il DNA, favorendone le mutazioni. Quando la cellula accumula un numero

troppo grande di mutazioni, allora il tumore diventa inevitabilmente maligno. Possiamo descrivere

il tumore maligno come un insieme di cellule varie, che non presentano tutte le stesse mutazioni.

Per questo, è difficile colpirne una singola caratteristica. Queste cellule, molto diversificate tra loro,

competono le une con le altre in modo che quelle con le mutazioni più favorevoli sopravvivano e

che prolifichi di più il clone più aggressivo e meno trattabile.

Il cancro: una o più malattie diverse?

Il cancro si presenta in modo molto diverso per morfologia, tipo di tessuto interessato, risposta ai

farmaci, aggressività, invasività, effetti collaterali (es. tossicità e cachexia) e alterazioni

cromosomiche. Anche le origini sono svariate: lo stesso tumore può presentarsi in forme “familiari”

93  

Giorgia Palladino

o sporadicamente, alcuni casi sono dovuti ad agenti mutageni ben individuati, ma altri, identici,

sono spontanei, vi sono virus oncògeni che danno manifestazioni tumorali diverse e in alcuni casi

identiche a quelle non riconducibili a infezioni virali, tumori derivanti da un’occupazione specifica

(esposizione ai raggi, lavoro nei centri navali, esposizione all’amianto…), ecc.

Del cancro, inoltre, si sono osservate numerose e disparate cause che non sempre sono congruenti

tra loro. Vediamo la differenza tra le osservazioni fatte e i dati che ancora confondono gli studi.

Osservazioni Dati confondenti

In alcune famiglie si eredita la predisposizione

Tumori ereditari, cioè frequenza elevatissima di generica al cancro e non a un determinato

un tumore particolare in una data famiglia tumore

Agenti mutageni, come sostanze chimiche o Le mutazioni somatiche hanno effetti diversi da

radiazioni ionizzanti quelle che colpiscono le cellule germinali

Gli stessi virus oncògeni possono avere effetti

Virus oncogeni, che possono essere lenti o rapidi o lenti; inoltre, sono oncògeni sia i virus a

rapidi DNA che quelli a RNA, ma non tutti

Evidenze citogenetiche: alcuni tumori Non tutti i tumori hanno i “markers”, anzi, per

presentano dei cromosomi “marker” con lo più presentano solo una generica aneuplodia

mutazioni che si ripetono sempre e che sono che tende ad aumentare con la progressione

amplificatori di geni (DS, HSR) tumorale

Come esempio di tumore ereditario, possiamo studiare il caso del retinoblastoma (Rb), un gene che,

se mutato, porta a un tumore ereditario della retina che si manifesta in età molto precoce. Sappiamo

che Rb viene fosforilato dalla ciclina della fase G1 per permettere alla cellula di superare il punto di

restrizione ed entrare in fase S. A sua volta, Rb blocca il fattore di trascrizione E2F, che controllano

i geni che portano alla progressione nel G1 e al passaggio del punto di restrizione. Se Rb è mutato,

però, non riesce a bloccare E2F, perciò non servono stimoli mitogenici per superare il punto di

restrizione.

Se un allele per Rb è mutato, l’individuo sarà portatore sano poiché è un gene recessivo. Se, però,

l’altro allele muta, si avrà il gene Rb mutato. Una mutazione di Rb può venire, ad esempio, dalla

luce, che porta uno stress di radicali. Rb, se non mutato, sarebbe un freno alla proliferazione, quindi

un oncosopressore.

Esistono anche tanti agenti cancerogeni che, come abbiamo visto, sono collegati ad uno specifico

ambiente di lavoro e si conoscono da molto tempo.

Nel 1600, ad esempio, era molto diffuso il cancro allo scroto tra gli spazzacamini. La fuliggine,

infatti, andava a contatto con le mucose del pene e causava un tipo di cancro che, oggi, non si trova

più. Tale cancro era provocato dal benzopirene, un conosciuto fattore oncogeno.

Un esempio, invece, di virus oncogeno è l’HTLV-1, che porta ad eccesso di proliferazione e causa

una forma di leucemia. Questo virus è un parente stretto dell’HIV, che invece porta alla morte dei

linfociti T-helper.

Markers tumorali

Con il passaggio di geni da un cromosoma all’altro, si possono formare delle proteine di fusione.

Ad esempio, il prodotto genico della leucemia mieloide cronica (LMC) è una proteina di fusione

che codifica per una chinasi anomala. In questo caso, avendo individuato una caratteristica specifica

del tumore, che è la chinasi, riusciamo ad uccidere solo le cellule tumorali e non quelle sane, se il

tumore viene scoperto prima che si inneschino altre mutazioni. Oggi, quindi, un farmaco specifico

inibisce questa chinasi e sta dando ottimi risultati.

Alcuni tumori, invece, sono riusciti ad espandere una regione che di solito è molto limitata di un

cromosoma, oppure riescono a produrre piccoli cromosomi extra non presenti nelle cellule normali.

Per fare questo, le cellule tumorali duplicano dei geni che rimangono nello stesso cromosoma o che

vanno a formare cromosomi a sé stanti. Se questo gene mutato codifica per un’accelerazione della

proliferazione o per un’inibizione dell’apoptosi, è un oncogene. 94  

Giorgia Palladino

Si è osservato che dentro al genoma di un virus oncogeno è presente un gene di solito presente in

una cellula normale che, probabilmente, è stato mutato nel virus. Un esempio di questo tipo è ras,

una G-protein che si attiva quando arriva un fattore di crescita, in modo che il suo recettore si

autofosforili diventando un sito di attacco per le proteine che attirano ras. Ras, a sua volta, favorisce

la fosforilazione delle chinasi, che provocano una cascata di fosforilazioni e che, alla fine, portano

alla sintesi delle cicline. La proteina ras si inattiva idrolizzando il GDP in GTP. Questa ras del virus,

però, ha perso la capacità di idrolizzare il GDP, ed è quindi sempre attiva. Ma perché questa

proteina cellulare si trova in un virus? Perché il virus, quando integra il suo DNA con quello della

cellula ospite, si integra nelle vicinanze di ras. Quando parte il ciclo lisogenico, il genoma virale

può portarsi dietro ras, ma senza il pezzo di dominio che idrolizza il GDP, rendendo ras sempre

attiva.

Per questo, vennero prodotti dei plasmidi contenenti ras per vedere se questo era sufficiente per

mutare le colture cellulari (foci). Si vide che non bastava un solo plasmide, ma bisognava associare

a ras un fattore di trascrizione che vada ad attivare le chinasi che portano alla sintesi delle cicline

del G1. Nacque così l’ipotesi dei due colpi, ovvero del fatto che servano due plasmidi per far

mutare le cellule perché queste hanno dei sistemi di difesa ridondanti. Negli animali, ad esempio,

sono necessarie ben sette mutazioni per superare tutti i controlli delle cellule immunitarie. Quindi, il

tumore è sempre causato dalle mutazioni geniche che colpiscono i segnali che regolano la

proliferazione e l’apoptosi, poiché il ciclo cellulare è regolato da segnali di stimolazione e da

segnali di inibizione.

La teoria unificante del cancro

Abbiamo visto che oncogeni e oncosoppressori regolano l’apoptosi e la proliferazione della cellula

(il termine oncogeno, però, non è troppo corretto perché indica un gene che, se non mutato, non

porta ad un tumore, ma è una sua mutazione che lo porta ad essere troppo espresso e, quindi, a

provocare il tumore). Possiamo distinguere, in generale, due diversi tipi di mutazione:

Le mutazioni che comportano gain of function (degli oncogeni) sono dominanti, ovvero basta la

• mutazione di uno dei due alleli per causare l’effetto

Le mutazioni che comportano loss of function (degli oncosoppressori) sono recessive, ovvero

• entrambi gli alleli devono essere inattivati per causare l’effetto

In qualche caso, ad esempio p53, anche la mutazione loss of function viene ad essere dominante per

un effetto quantitativo del prodotto genico. Abbiamo visto che p53 regola la sintesi di altri geni e

viene attivata in seguito a un danno al DNA. Dopo essere stata prodotta, p53 entra nel nucleo, in

quanto fattore di trascrizione, e, nel nucleo, incontra la molecola mdm2, che la porta fuori dal

nucleo una volta che il suo compito è finito e la ubiquitina, degradandola nel proteasoma. Attivare

p53 fosforilandola, quindi, significa renderla non riconoscibile da mdm2, in modo che possa agire

nel nucleo in caso di danno al DNA. Questa regolazione ha come scopo il fatto che è molto più

rapido attivare una proteina già presente piuttosto che sintetizzarla.

Il fatto è che p53 è un tetramero, per cui se c’è una mutazione di uno degli alleli significa che la

metà di p53 è mutata; quindi, basta che uno solo dei tetrameri di p53 sia mutato perché p53 non

funzioni. Per questo motivo la mutazione, anche se è loss of function, è dominante. La mutazione di

p53 è ereditaria.

Oncogeni e oncosoppressori

Abbiamo visto che i segnali di stimolazione del ciclo cellulare (acceleratori), se mutati, se espressi

nel momento sbagliato, in cellule sbagliate o in eccesso favoriscono la trasformazione tumorale.

Oncogéni: meccanismo di gain of function

nella fase decisionale, sono fattori di crescita, i loro recettori, molecole coinvolte nella trasduzione

• del segnale mitotico come G-proteins (ras) o chinasi (MAPK)

nella fase di esecuzione, sono geni precoci (myc, fos, jun), altri fattori di trascrizione, cicline,

• alcune fosfatasi e altre molecole di regolazione positiva del ciclo cellulare

sono oncogeni tutte le proteine e i fattori anti-apoptotici e tutti gli acceleratori della proliferazione

• 95  

Giorgia Palladino

Abbiamo visto che i segnali di inibizione del ciclo cellulare (freni), se mutati, se deleti, se non

espressi nel momento giusto o in quantità sufficiente favoriscono la trasformazione tumorale.

Oncosoppressori: meccanismo di loss of function

nella fase decisionale, sono i fattori di inibizione della crescita, di differenziamento e rispettivi

• recettori, integrine e molecole di adesione, molecole coinvolte nella trasduzione dei segnali

citostatici

nella fase di esecuzione, sono Rb e altre molecole di regolazione negativa del ciclo cellulare,

• inibitori dei complessi ciclina-chinasi, molecole dei check-points come p53

sono oncosoppressori tutte le proteine e i fattori pro-apoptotici e i freni della proliferazione

La scoperta degli oncosoppressori

Gli oncosoppressori furono scoperti usando la tecnica della fusione somatica, indotta dal glicole

polietilenico, di cellule di specie affini, una specie sana e una mutata. Ibridando le cellule normali e

quelle trasformate, si vede che l’ibrido appare normale fin quando, nelle divisioni cellulari, le

cellule in cui si ha una reversione spontanea al fenotipo tumorale perdono il cromosoma 11, mentre

le altre continuano ad apparire normali. Questo era un chiaro segnale che il cromosoma 11 contiene

un gene che protegge dai tumori. Infatti, se si fondono, sempre con il glicole polietilenico, le cellule

tumorali con microcellule contenenti un cromosoma 11 normale e si pongono gli ibridi in coltura, le

cellule che captano il cromosoma 11 tornavano al fenotipo normale.

Interpretazione genetica

Gain of function di un oncogéne:

le mutazioni che determinano l’insorgenza di un tumore sono quelle che attivano un oncogéne. La

funzione normale degli oncogéni è quella di regolare positivamente il ciclo cellulare: ad esempio, la

controparte normale di un oncogene (c-onc) può essere un recettore per un fattore di crescita, una

chinasi coinvolta nella trasduzione del segnale, un fattore di trascrizione. Anche i geni che regolano

negativamente l’apoptosi sono c-onc, ad esempio Bcl-2. La mutazione comporta un guadagno di

funzione, cioè un aumento quantitativo, l’attivazione perenne, la sintesi in momenti inopportuni in

cellule che non dovrebbero esprimere il gene.

Loss of function di un oncosoppressore:

i tumori ereditari dipendono dalla mutazione di uno degli alleli di un gene oncosoppressore, seguita

dall’inattivazione, per una seconda mutazione, dell’altro allele (ad esempio tumori ereditari

specifici come il retinoblastoma), oppure dalla mutazione di un gene coinvolto nella riparazione del

DNA (ad esempio tumori ereditari aspecifici come la sindrome di Lynch). In ogni caso, la

mutazione comporta la perdita di funzione dell’oncosoppressore. La funzione dei geni

oncosoppressori è quella di regolare negativamente il ciclo cellulare, ad esempio ritardando il ciclo

cellulare, inducendo l’apoptosi, controllando l’inibizione da contatto o l’adesione al substrato.

La funzione dei virus oncògeni:

alcuni retrovirus inseriscono il loro promotore nel DNA cellulare in modo tale da controllare

positivamente un c-onc (virus lenti), altri inseriscono direttamente nel DNA cellulare un oncògene

cellulare difettivo (v-onc) da esso trasportato (virus rapidi). Alcuni virus a DNA sintetizzano

proteine che inattivano oncosoppressori o simulano fattori di trascrizione, ovvero inseriscono un

gene virale simile a quello umano che, nella cellula ospite, svolge la stessa funzione del gene

originale ma è mutato.

Markers e modificazioni citogenetiche:

i markers di alcuni tumori sono l’espressione di riarrangiamenti cromosomici, che portano alcuni c-

onc sotto il controllo di promotori attivi in quel dato tipo cellulare o determinano la sintesi di una

proteina ibrida con funzioni oncogéne. Le amplificazioni geniche spesso riguardano gli oncogéni.

Progressione tumorale:

il tumore tende ad insorgere a partire da una singola cellula (origine clonale) che ha subito più

mutazioni, interessanti punti di controllo del ciclo cellulare diversi. La progressione tumorale porta

96  

Giorgia Palladino

ad una diversificazione delle cellule tumorali, con la prevalenza di diversi cloni, ciascuno

caratterizzato da mutazioni nuove che conferiscono vantaggi selettivi.

La modificazione epigenetica del cancro e le cellule staminali tumorali

Abbiamo ora compreso che, in genere, le mutazioni geniche sono precedute o accompagnate da

alterazioni epigenetiche del cancro. Questo vuol dire che l’espressione del DNA è regolata anche

dalla compattazione della cromatina e, se un gene è compattato e non viene trascritto, la cellula è

più propensa a diventare una cellula mutata.

Inoltre, vi sono cellule tumorali staminali molto difficili da combattere. Le cellule staminali in

genere sono cellule in G in grado, ogni tanto, di dividersi. Le cellule tumorali staminali, invece,

0

sono una piccola sottopopolazione delle cellule di un tumore in grado di rigenerare l’intero tumore.

Se una mutazione colpisce una cellula staminale, noi possiamo eliminare i precursori della cellula

staminale con dei farmaci, ma il tumore si conserverà nella staminale stessa e, quindi, si ripresenterà

quando la cellula staminale formerà nuovi precursori che, a loro volta, si divideranno.

L’evoluzione e lo sviluppo di un organismo pluricellulare

L’evoluzione di organismi pluricellulari ha comportato:

Il diversificamento dei tipi cellulari, cioè il differenziamento è una conseguenza della

• pluricellularità

Il coordinamento nella formazione delle cellule e nella loro funzione; ad esempio, nel periodo

• embrionale e di sviluppo le cellule devono coordinarsi per la dimensione dei vari organi

L’organizzazione delle cellule in tessuti funzionali

• L’eliminazione di cellule estranee o invecchiate

• Nuove e più raffinate modalità di segnalazione, ad esempio tutti gli organi e tessuti devono essere

• innervati

Nello sviluppo embrionale si specializza una linea germinale, che si stacca dalla linea somatica

• molto presto. Questo distacco preserva la cellula dal dividersi numerose volte in modo che non ci

siano errori nella linea germinale. Nello zigote, quindi, abbiamo delle divisioni iniziali e, mentre il

numero di cellule aumenta, viene a determinarsi la loro funzione.

Lo sviluppo di un organismo pluricellulare procede attraversi divisioni mitotiche successive, che

originano le genealogie cellulari. Esse sono cellule prive di differenziamento, con potenzialità

differenziative multiple e con un differenziamento che dipende da pacchetti di geni che vengono o

meno attivati. Le genealogie cellulari tracciano l’ordine di nascita delle cellule, la restrizione

progressiva del loro potenziale differenziativo e il loro differenziamento in tipi cellulari

specializzati. Le genealogie cellulari sono controllate da fattori intrinseci alle cellule stesse (interni),

che sono forgiati dalla storia della cellula e da meccanismi interni di regolazione, e da fattori

estrinseci alle cellule (esterni), come segnali cellula-cellula e informazioni provenienti

dall’ambiente. Una genealogia cellulare ha inizio con le cellule staminali, cellule non specializzate

che hanno il potenziale di autoriprodursi all’infinito e di generare cellule maggiormente

specializzate. Ogni cellula, uscita da un ciclo cellulare, va a restringere il suo potenziale

differenziativo ed esprime un certo numero di geni che le consentono di comunicare con le altre

cellule in maniera sempre più perfezionata. Per fare ciò, tali cellule mettono a riposo parte della

cromatina e si concentrano su quella necessaria alla specializzazione; man mano che la

specializzazione progredisce, quindi, abbiamo un progressivo aumento della condensazione della

cromatina. Nell’adulto, le cellule staminali permangono ma sono già predisposte ad un numero

limitato di destini differenziativi.

Lo zigote, quindi, è una cellula totipotente che comincia a dividersi nella morula, un primo

aggregato di cellule anch’esse quasi del tutto totipotenti. La morula, poi, si accresce nella

blastocisti, che possiamo considerare la prima fase del feto umano. La blastocisti è una sfera

circondata da uno strato di cellule che dovranno andare a formare gli annessi embrionali e il corpo

dell’embrione. Le cellule della blastocisti, quindi, sono cellule staminali pluripotenti, cioè da cui si

97  

Giorgia Palladino

possono ottenere tutti i tessuti tranne gli annessi embrionali. Sono, invece, cellule moltipotenti

quelle dei foglietti embrionali, che hanno già una specializzazione. Si arriva così, quindi, alle cellule

mature, che sono unipotenti. Volendo, possiamo dare una definizione ancora più precisa alle

possibilità di differenziamento delle cellule staminali:

Cellule staminali totipotenti; queste cellule hanno capacità illimitate e hanno la possibilità di

• formare membrane e tessuti, cioè annessi embrionali, il corpo stesso dell’embrione e anche tutti i

tessuti e gli organi che si svilupperanno con lo svilupparsi dell’embrione. Un esempio di staminale

totipotente è proprio l’embrione

Cellule staminali pluripotente; queste cellule hanno la possibilità di formare la maggior parte, ma

• non tutti, i tessuti di un organismo. Un esempio di queste cellule è il blastocele

Cellule staminali multipotenti; queste cellule hanno il compito di produrre cellule che hanno una

• funzione specifica. Un esempio sono le cellule staminali del sangue

Possiamo dire che con il termine differenziamento si intende il processo che porta una cellula a un

fenotipo maturo e funzionale, ossia che la porta a svolgere le sue funzioni specifiche, che di norma

sono dipendenti dall’acquisizione di una specifica morfologia e localizzazione corporea.

Cosa sono le cellule staminali

Le cellule staminali sono cellule dotate di capacità di autorinnovamento, cioè di proliferare infinite

volte originando altre cellule staminali non differenziate grazie all’espressione dell’enzima

telomerasi. Queste cellule sono poi in grado di differenziare dando luogo a uno o più tipi di cellule

mature.

Le cellule staminali embrionali derivano da blastocisti (stadio precoce pre-impianto) e sono toti- o

pluri-potenti.

Le cellule staminali adulte o somatiche derivano da tessuti adulti e sono pluri- o multi-potenti.

Entrambi i tipi di cellule possono essere coltivati in vitro e indotti a differenziare.

Le cellule staminali possono dividersi in maniera simmetrica o asimmetrica, il che permette loro di

mantenere la staminalità. Avviene una divisione simmetrica di una cellula staminale, o di un

progenitore, se il destino delle due cellule figlie è lo stesso; al contrario, la divisione asimmetrica

avviene quando il destino delle due cellule figlie è diverso. Le cellule che vanno incontro a

differenziamento sono dette progenitrici, che andranno incontro a divisioni successive alla fine delle

quali produrranno cellule differenziate.

Ad esempio, le HSC (hematopoietic stem cell) sono le cellule staminali emopoietiche del midollo

osseo. I progenitori possono essere di tipo mieloide, cioè producono tutte le cellule del sangue

tranne i linfociti, o linfoide, cioè producono tutti i tipi di linfociti. Si chiama commitment quella

cellula che si è già predisposta verso un tipo di differenziamento.

Nell’adulto, le cellule staminali sono localizzate in sedi specifiche, dette nicchie, formate da cellule

non staminali che regolano le funzioni vitali di quelle staminali: la sopravvivenza, il mantenimento,

l’auto-rinnovamento, il controllo della proliferazione e la repressione del differenziamento. La

nicchia è quindi un’unità fisiologica, le cui componenti sono le cellule e i segnali, solubili e non,

presenti in tale sede. Anche la divisione asimmetrica necessita dell’informazione topografica, cioè

posizionale e direzionale, fornita dalla nicchia. La nicchia protegge le cellule staminali

dall’esaurimento e allo stesso tempo protegge l’ospite dalla loro eccessiva proliferazione; la

staminale, infatti, è una cellula quiescente in G che viene richiamata alla divisione da fattori

0

proliferatrici. La nicchia integra i segnali che mediano la risposta bilanciata delle cellula staminali

alle necessità dell’organismo. Aberrazioni dei segnali della nicchia possono essere alla base di

patologie, dalle patologie tumorali alle aplasie. La nicchia può essere, quindi, vista anche come

punto di partenza per gli approcci terapeutici.

Le cellule progenitrici hanno il compito di rifornire la necessità di cellule dell’adulto per il

rinnovamento cellulare. Si parla di compartimento proliferante, o staminale, in G perché la cellula

0

staminale non tende a dividersi, mentre quella proliferatrice si.

Il filamento immortale e il differenziamento 98  

Giorgia Palladino

Abbiamo visto che, quando una cellula si duplica, la divisione del DNA è semiconservativa. Questo

vuol dire che quando una staminale si divide, in una delle cellule figlie rimarrà comunque un

filamento proveniente dalla staminale anche dopo molte divisioni, che si tramanda di cellula in

cellula. La teoria del filamento immortale sta raccogliendo conferme sperimentali, in quanto rallenta

l’accumularsi di mutazioni casuali. Inoltre, ha profonde implicazioni per quanto riguarda cancro,

invecchiamento e differenziamento.

L’acquisizione del differenziamento è un processo a più passaggi, a tappe successive, ognuna

caratterizzata dalla variazione dell’espressione genica e del tipo di segnali che la cellula può

mandare o ricevere dalle cellule adiacenti. Il differenziamento, quindi, porta a un progressivo

restringimento delle potenzialità differenziative di una cellula pluripotente, ossia con molteplici

potenzialità differenziative. Di norma, tale processo è accompagnato da una progressiva perdita di

potenziale moltiplicativo.

Differenziamento e segnali

Abbiamo detto che il differenziamento è governato da segnali che vengono da altre cellule

dell’organismo (segnali solubili, ormoni o fattori di crescita), da cellule vicine (segnali cellula-

cellula) o dalla matrice extracellulare. Di norma i vari passaggi del differenziamento sono governati

da diversi segnali. Spesso la cellula risponde con altri segnali: il differenziamento embrionale è un

processo di progressiva acquisizione di specializzazione di tutta la regione interessata e si attua in

loco (differenziamento loco-regionale).

I fattori di crescita sono glicoproteine con funzione di segnale, sintetizzate da cellule o tessuti non

definiti come ghiandole e diffusi per via endocrina o paracrina. I fattori di crescita hanno spesso più

funzioni:

Segnale proliferativo

• Segnale differenziativo

• Segnale di sopravvivenza

Lo stesso fattore può svolgere più ruoli in momenti diversi nel corso del differenziamento di una

data filiera. In altri casi, la cellula, differenziando, acquisisce recettori per fattori diversi.

Ad esempio, la componente extracellulare riconosce il fattore di crescita G-CSF; il recettore sente la

presenza di un ligando e si attiva nella parte intracellulare (si autofosforila) per diventare un sito di

attacco per i fattori di trasduzione del segnale. Queste proteine si attivano e, a loro volta, attivano

una catena che finirà o nel differenziamento o nella proliferazione.

Se la cellula ha fattori di trasduzione che riconoscono una specifica regione, saranno attivati i geni

della proliferazione; se riconoscono un’altra regione, invece, attivano i geni della maturazione,

oppure entrambi.

Questi sono due modi diversi di rispondere allo stesso fattore di crescita.

I fattori di crescita sono anche fattori di sopravvivenza: possono salvare una cellula dall’apoptosi,

indurla al differenziamento o alla proliferazione in base al modo casuale in cui sono disposti i

recettori. Il precursore, così, viene regolato sia nella sua capacità di sopravvivere, che in quella di

proliferare e differenziarsi. Infatti, in alcuni casi, si formano più cellule staminali di quelle che sono

necessarie all’organismo maturo “a regime”. In condizioni di equilibrio, l’eccesso è destinato a

morire per apoptosi. Tuttavia, in caso di necessità, tali cellule “in più” costituiscono una preziosa

riserva. L’organismo regola la sopravvivenza, la proliferazione e il differenziamento di tali cellule

attraverso la disponibilità limitata dei fattori di crescita. Le cellule staminali, così, competono tra

loro per assicurarsi un apporto sufficiente di tali fattori.

Un esempio di segnale paracrino

L’interazione tra cellule linfoidi è un esempio di segnale paracrino. La cellula APC presenta

l’antigene ai linfociti e li induce a differenziarsi in linfociti citotossici. L’interazione con diversi

segnali solubili, cellula-cellula, ecc. li induce ad un differenziamento diverso.

Un altro esempio è quello dello sviluppo dell’occhio. Nel corso dello sviluppo embrionale si

osservano segnali paracrini che inducono il differenziamento dei tessuti vicini e sono definiti

99  

Giorgia Palladino

morfogeni. Tra questi tessuti c’è, ad esempio, il tessuto nervoso della coppa ottica, che diffonde in

maniera paracrina e incide nell’epitelio vicino. I tessuti morfogeni si diffondono poi a cascata,

provocando colloqui reciproci tra tessuti.

L’irreversibilità del differenziamento

Il differenziamento viene trasmesso alle cellule figlie e, quindi, procede nella stessa direzione e

sembra irreversibile. Esamineremo però alcune eccezioni, che dimostrano che di fatto vi è una certa

plasticità del differenziamento (transdifferenziamento e reversibilità) e ci fanno capire come il

differenziamento viene modulato.

Prima, però, ci chiediamo come fa una cellula ad ereditare l’informazione che deve farla arrivare ad

un certo tipo di differenziamento. Con la condensazione del DNA, una cellula mantiene il

differenziamento raggiunto, che poi verrà incrementato. Ma come fanno le cellule ad ereditare la

condensazione solo di alcuni tratti del DNA, visto che nella mitosi è tutto condensato? Perché

alcuni geni rimangono condensati e non vengono più espressi? Abbiamo visto che esistono delle

modificazioni epigenetiche che influenzano la trascrivibilità del DNA. La metilazione di un

filamento di DNA, che è ereditaria, agisce anche sul filamento di nuova sintesi; questa metilazione

richiama poi degli enzimi che provocano l’inibizione, la compattazione, di quel tratto di DNA. La

metilazione è l’unico di questi metodi di trasmissione dell’informazione conosciuto; del resto

sappiamo solo che gli istoni sono coinvolti, ma non sappiamo in che modo.

Vediamo ora, invece, le eccezioni al processo di differenziamento.

Le cellule cancerose spesso fanno un passo indietro, nel senso che perdono alcuni aspetti terminali

del differenziamento, diventando morfologicamente poco riconoscibili e perdendo funzionalità,

mentre acquisiscono nuovamente capacità illimitate di proliferazione.

Anche la clonazione riproduttiva della pecora Dolly (e, in seguito, di altri mammiferi) è stato

eseguito sostituendo il nucleo di una cellula somatica differenziata (una cellula mammaria) al posto

del nucleo di una cellula nuova matura.

Inoltre, se si fanno fondere globuli rossi di pollo (nuclei presenti ma inattivi) con cellule umane

cancerose, le cellule ibride cominciano ad esprimere proteine di pollo precedentemente non

espresse.

Questi esperimenti dimostrano che il differenziamento è regolato da elementi (proteine, RNA)

presenti nel citoplasma, ovvero nel citoplasma c’è qualcosa che influisce sul differenziamento del

nucleo e si dimostra la collaborazione tra nucleo e citoplasma.

Un’altra eccezione nel processo di differenziamento è la rigenerazione. I mammiferi hanno questa

capacità solo a livello tissutale, ma alcuni animali, come gli anfibi, hanno grandi capacità di

rigenerare arti e organi. Questo processo è possibile perché le cellule pre-esistenti si de-

differenziano e, come nello stadio embrionale, ricominciano a proliferare e differenziarsi,

riformando la parte che deve essere rigenerata. Questa rigenerazione, dunque, non parte da cellule

staminali, ma da cellule già differenziate che hanno la capacità di tornare indietro.

Differenziamento come espressione differenziale di geni

Abbiamo visto che il differenziamento viene trasmesso alle cellule figlie in quanto i segnali

influiscono sull’espressione genica della cellula, per lo più agendo sullo stato della cromatina e sui

fattori di trascrizione o sui repressori. Quindi, in ultima analisi, il differenziamento deriva

dall’espressione differenziale di geni che determinano una specializzazione della cellula stessa.

La regione di controllo di geni specifici del differenziamento può comprendere numerosi siti di

legame con fattori di trascrizione e con regolatori negativi. Per mantenere lo specifico pattern di

espressione genica, i regolatori devono essere espressi (la regolazione comprende un feedback

positivo). Il differenziamento può comportare l’inattivazione di alcune regioni di cromatina

(metilazione del DNA, ecc.) e le cellule figlie ereditano tale pattern di espressione e di repressione.

Cosa ci ha insegnato la clonazione riproduttiva 100  

Giorgia Palladino

È stato il contesto del citoplasma dell’ovocita a riprogrammare il nucleo della cellula somatica

differenziata, rendendolo totipotente. Questo significa che il citoplasma di un ovocita contiene

molecole (proteine, RNA non tradotti) in grado di indurre uno stato di staminalità. Quindi, i geni

della totipotenza, espressi dal nucleo dell’ovocita, sono stati trascritti e tradotti prima della

fecondazione in prodotti genici che risultano determinanti per consentire lo sviluppo embrionale.

Questo conferma l’interazione e la collaborazione tra nucleo e citoplasma.

Metodi e principali risultati del progetto Human Genome

440 scienziati di 32 gruppi hanno condotto 24 generi di esperimenti su 150 tipi cellulari (solo 6 tipi

cellulari studiati in tutti gli esperimenti). Gli esperimenti avevano principalmente questi scopi:

Identificare gli RNA trascritti

• Identificare le modalità di controllo dell’espressione genica

• Individuare i siti di legame al DNA di 120 fattori di trascrizione

• Mappare le regioni in cui il DNA e gli istoni sono marcati epigeneticamente

• Identificare il DNA funzionale ma non codificante

• Studiare come l’evoluzione ha influito sulle sequenze e le loro regolazioni

Inoltre, sappiamo che:

Il 95% del DNA a sequenza unica viene trascritto o partecipa ad almeno un evento di regolazione

• Circa 21000 sono i geni codificanti proteine

• Circa 18000 sono i geni trascritti ma non tradotti (RNA non codificanti)

• Circa 470000 sono le regioni regolatrici

• Circa 3000000 sono i siti di legame DNA-proteine individuati, ma solo 3700 sono presenti in tutti

• i tipi cellulari

I siti di controllo possono essere molto distanti (anche su altri cromosomi?)

Dopo la pecora Dolly, la clonazione riproduttiva è stata applicata con un certo successo in

veterinaria. Ma, più che alla clonazione riproduttiva, la medicina moderna è interessata alle cellule

staminali per fini di rigenerazione. Per ottenere cellule staminali, attualmente si stanno percorrendo

queste strade:

Manipolazione di embrioni umani per produrre cellule staminali, ma con problemi etici e giuridici

• e risultati scientifici ancora preliminari

Trasferimento di un nucleo di una cellula somatica del paziente nel citoplasma di un ovocita, per

• poi coltivare la blastocisti e ottenere solo il tessuto desiderato; il permesso per questa

sperimentazione è stato recentemente concesso in Inghilterra

Isolamento di cellule staminali da tessuti adulti o fetali (ad esempio l’amnios) perché da esse si

• possono ottenere tessuti, anche se hanno limitate capacità riproduttive. Questo processo, unito a

metodiche che ne consentano la moltiplicazione e il differenziamento, ha il vantaggio di non

provocare rigetto perché i tessuti embrionali producono sostanze tollerogeniche, cioè che si fanno

accettare dal corpo adulto. In alternativa, si stanno provando ad usare cellule adipose per la

ricostruzione di altri tessuti, o della pelle per le problematiche dei grandi ustionati, oppure ancora

della cornea; le cellule adipose, infatti, hanno molte potenzialità

Individuazione dei geni della staminalità, che si potrebbero attivare nelle cellule differenziate per

• riprogrammarle (iSC). Infatti, andando ad inserire questi geni nelle cellule somatiche, si ottiene

uno sdifferenziamento e le stesse cellule possono essere riprogrammate per poi essere

differenziate in altri tessuti

La blastocisti e la clonazione terapeutica per la cura del cancro

Dalla massa cellulare interna della blastocisti si differenzieranno i foglietti embrionali e, da lì, le

varie cellule specializzate che compongono i vari tessuti del corpo. Le cellule della blastocisti si

possono coltivare in vitro e far differenziare.

Un altro metodo è la clonazione terapeutica, che immette nell’ovocita maturo, dopo averlo privato

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Giorgia Palladino


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12Gio

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie (Facoltà di Agraria, di Chimica Industriale, di Farmacia, di Medicina e Chirurgia, di Medicina Veterinaria e di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali)
SSD:
Università: Bologna - Unibo
A.A.: 2014-2015

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher 12Gio di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Morfologia Cellulare e d'Organo e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Bologna - Unibo o del prof Marini Marina.

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