Biologia – Lezione 7 - Slides

Proteomics, like its precursor genomics, thus represents the emergence of a

new way of doing research that is not dependent on the testing of specific

models of cellular behavior. This style of science obviously does not replace,

but rather will increasingly operate with traditional biological methods.

JOE SUTLIFF

Stanley Fields: Proteomics in Genomeland, Science 291, 1221, (2001).

Le proteine sono cariche ad un pH differente dal loro punto

isoelettrico

Punto isoelettrico (pI)

Elettroforesi su gel

Metodo per separare le molecole (DNA, RNA,

proteine, etc.) sulla base di proprieta’ fisiche o

chimiche quali:

(1) dimensioni

(2) forma

(3) carica elettrica

Elettroforesi di Proteine

 Generalmente il

gel e’ fatto di

poliacrilammide

acrilammide (CH2=CH-CO-

NH2) +

N,N'-metilen-bis-acrilammide

CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-

CH=CH2

Elettroforesi di proteine

Condizioni Non Denaturanti

 Non-denaturante (nativo): nessun pre-trattamento delle

proteine prima dell’elettroforesi

– Le proteine conservano la loro forma normale (struttura 2° e 3°;

legami disolfuro covalenti)

– Le proteine conservano la loro carica normale

– Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma

Nome Carica Massa Forma

Proteina Q +3 30kD

Proteina R 42kD

4

SDS-Polyacrylamide Gel

Electrophoresis (SDS-PAGE)

CH

3

CH

2

CH

 SDS (Sodio Dodecil 2

CH

2

Solfato) CH

2

CH

2

– Solubilizza e denatura CH

2

le proteine CH

2

CH

– Aggiunge cariche 2

CH

2

negative alle proteine CH

2

CH

2

O O

O S SDS

-

O

Come funziona un Gel SDS-

PAGE ?

 Le proteine

cariche

negativamente

si muovono SDS, calore

s-s

verso

l’elettrodo Proteine con SDS

positivo –

 Proteine piu’

piccole si

muovono piu’

velocemente +

 Le proteine si

separano per

dimensione

Sistemi per la corsa di SDS-PAGE

Piccolo (8 x 10 cm) Medio (16 x 16 cm)

I principi dell’eletroforesi bidimensionale

1. Prima dimensione :

isoelettrofocalizzazione

: separazione in base al

punto isoelettrico

2. Seconda dimensione :

Elettroforesi in

condizione denaturante

(SDS) su gel di

poliacrilammide

2D-PAGE 1° Dimensione IEF

pH 3.5………………………………………..…pH 10

PAGE Mw (Kd)

Dimensione 200

Potere di risoluzione: 100

1000 proteine/gel

 50

2° 30

10

Immobiline

DryStrip pH 3–11

NL, 24 cm

using 0.5% IPG

Buffer 3–11 NL

,

pH 3–5.6 NL pH 7–11 NL

pH 5.3–6.5 pH 6.2–7.5,

Strategie utilizzate per la proteomica

con elettroforesi

•Analisi

bidimensionale di lisati

cellulari:

caratterizzazione delle

proteine

•Comparazione tramite

elettroforesi

bidimensionale

dell’espressione di

proteine

Identificazione

mediante

spettrometria di massa

Strumento per la 1°

dimensione su gradiente

di pH immobilizzato

1 4

2 5

3 Preparazione del campione per la

prima dimensione

2° Dimensione

Metodi di rivelazione

Le proprietà più importanti di un colorante sono:

•Elevata sensibilità

range di linearità

•Elevato

•Riproducibilità

con i metodi di identificazione delle

•Compatibilità

proteine Universali (blu coomassie)

Metodi Specifici (metodi di rivelazione di

modificazioni post traduzionali)

Slides lezione 8 di Biologia prof.ssa Modesti. Nello specifico gli argomenti trattati sono i seguenti: La Scienza del Proteoma, Era genomica, Era post-genomica, La proteomica, Proteomica strutturale, Proteomica differenziale (di espressione), Proteomica di interazione, ecc.