Biologia – Lezione 7 - Slides

ERA POST-GENOMICA

La sola sequenza, anche se completa,

non SUFFICIENTE

del genoma è a

comprendere le funzioni (e disfunzioni)

biologiche del nostro organismo.

Eukaryotic Cell

DNA Protein mRNA

Dipendente dal tipo di cellula e dallo stato della cellula

•

Livello quantitativo

•

Localizzazione spaziale

•

Cambiamenti temporali

•

Interazioni Migliaia di proteine

Bruco muta in farfalla

Indistinguibili ad una analisi genetica.

Diverso fenotipo.

•

Il termine PROTEOME è stato inventato nel 1994 da Marc

Wilkins (Macquire University, Sydney).

PROTEOMA

Insieme delle proteine espresse ed eventualmente modificate dal

genoma in un determinato momento della vita di una cellula o di

un tessuto.

PROTEOMICA

È lo studio del proteoma mediante tecnologie che

prevedono un’analisi su larga scala delle proteine,

delle loro interazioni e delle modificazioni a cui

vanno incontro in un organismo

ERA POST-GENOMICA

Il progetto genoma umano ha fornito una quantità enorme di

informazioni sulla sequenza di singoli geni

STATICO

Migliaia di geni al lavoro, contemporaneamente:

contemporaneamente

Il livello di espressione di un mRNA spesso non

rappresenta la quantità di proteina attiva

PROTEOMA

DINAMICO

PROTEine espresse dal genOMA

Analisi delle proteine e delle loro funzioni espresse da un sistema

biologico

La proteomica

 Proteomica strutturale

analisi su larga scala della struttura delle proteine

(cristallografia a raggi X, NMR)

 Proteomica differenziale (di espressione)

analisi su larga scala dell’espressione proteica

(2-DE, MS)

 Proteomica di interazione

analisi su larga scala delle interazioni tra proteine

(pull-down, purificazione per affinità, two-hybrid system, analisi di

network...)

Proteomics, like its precursor genomics, thus represents the emergence of a

new way of doing research that is not dependent on the testing of specific

models of cellular behavior. This style of science obviously does not replace,

but rather will increasingly operate with traditional biological methods.

JOE SUTLIFF

Stanley Fields: Proteomics in Genomeland, Science 291, 1221, (2001).

Le proteine sono cariche ad un pH differente dal loro punto

isoelettrico

Punto isoelettrico (pI)

Elettroforesi su gel

Metodo per separare le molecole (DNA, RNA,

proteine, etc.) sulla base di proprieta’ fisiche o

chimiche quali:

(1) dimensioni

(2) forma

(3) carica elettrica

Elettroforesi di Proteine

 Generalmente il

gel e’ fatto di

poliacrilammide

acrilammide (CH2=CH-CO-

NH2) +

N,N'-metilen-bis-acrilammide

CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-

CH=CH2

Elettroforesi di proteine

Condizioni Non Denaturanti

 Non-denaturante (nativo): nessun pre-trattamento delle

proteine prima dell’elettroforesi

– Le proteine conservano la loro forma normale (struttura 2° e 3°;

legami disolfuro covalenti)

– Le proteine conservano la loro carica normale

– Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma

Nome Carica Massa Forma

Proteina Q +3 30kD

Proteina R 42kD

4

SDS-Polyacrylamide Gel

Electrophoresis (SDS-PAGE)

CH

3

CH

2

CH

 SDS (Sodio Dodecil 2

CH

2

Solfato) CH

2

CH

2

– Solubilizza e denatura CH

2

le proteine CH

2

CH

– Aggiunge cariche 2

CH

2

negative alle proteine CH

2

CH

2

O O

O S SDS

-

O

Come funziona un Gel SDS-

PAGE ?

 Le proteine

cariche

negativamente

si muovono SDS, calore

s-s

verso

l’elettrodo Proteine con SDS

positivo –

 Proteine piu’

piccole si

muovono piu’

velocemente +

 Le proteine si

separano per

dimensione

Sistemi per la corsa di SDS-PAGE

Piccolo (8 x 10 cm) Medio (16 x 16 cm)

I principi dell’eletroforesi bidimensionale

1. Prima dimensione :

isoelettrofocalizzazione

: separazione in base al

punto isoelettrico

2. Seconda dimensione :

Elettroforesi in

condizione denaturante

(SDS) su gel di

poliacrilammide

2D-PAGE 1° Dimensione IEF

pH 3.5………………………………………..…pH 10

PAGE Mw (Kd)

Dimensione 200

Potere di risoluzione: 100

1000 proteine/gel

 50

2° 30

10

Immobiline

DryStrip pH 3–11

NL, 24 cm

using 0.5% IPG

Buffer 3–11 NL

,

pH 3–5.6 NL pH 7–11 NL

pH 5.3–6.5 pH 6.2–7.5,

Slides lezione 8 di Biologia prof.ssa Modesti. Nello specifico gli argomenti trattati sono i seguenti: La Scienza del Proteoma, Era genomica, Era post-genomica, La proteomica, Proteomica strutturale, Proteomica differenziale (di espressione), Proteomica di interazione, ecc.