Biologia – Lezione 7 - Slides

ERA POST-GENOMICA

Migliaia di geni al lavoro, contemporaneamente:

Il livello di espressione di un mRNA spesso non rappresenta la quantità di proteina attiva PROTEOMA.

DINAMICO: Proteine espresse dal genoma.

Analisi delle proteine e delle loro funzioni espresse da un sistema biologico.

La proteomica:

• Proteomica strutturale: analisi su larga scala della struttura delle proteine (cristallografia a raggi X, NMR).
• Proteomica differenziale (di espressione): analisi su larga scala dell'espressione proteica (2-DE, MS).
• Proteomica di interazione: analisi su larga scala delle interazioni tra proteine (pull-down, purificazione per affinità, two-hybrid system, analisi di network...).

Proteomics, like its precursor genomics, thus represents the emergence of a new way of doing research that is not dependent on the testing of specific models of cellular behavior. This style of science obviously does not replace, but rather will increasingly operate with.

traditional biological methods.

JOE SUTLIFF

Stanley Fields: Proteomics in Genomeland, Science 291, 1221, (2001).

Le proteine sono cariche ad un pH differente dal loro punto isoelettrico

Punto isoelettrico (pI)

Elettroforesi su gel

Metodo per separare le molecole (DNA, RNA, proteine, etc.) sulla base di proprietà fisiche e chimiche quali:

1. dimensioni
2. forma
3. carica elettrica

Elettroforesi di Proteine

Generalmente il gel è fatto di poliacrilammide (CH2=CH-CO-NH2) + N,N'-metilen-bis-acrilammide (CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2)

Elettroforesi di proteine

Condizioni Non Denaturanti

Non-denaturante (nativo): nessun pre-trattamento delle proteine prima dell'elettroforesi

• Le proteine conservano la loro forma normale (struttura 2° e 3°; legami disolfuro covalenti)
• Le proteine conservano la loro carica normale
• Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma

Nome Carica Massa Forma

Proteina Q +3 30kD

Proteina R

42kD-4SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

SDS (Sodio Dodecil Solfato) - Solubilizza e denatura le proteine - Aggiunge cariche negative alle proteine - Come funziona un Gel SDS-PAGE?

Le proteine cariche negativamente si muovono verso l'elettrodo positivo - Proteine con SDS - Proteine più piccole si muovono più velocemente - Le proteine si separano per dimensione

Sistemi per la corsa di SDS-PAGE - Piccolo (8 x 10 cm) - Medio (16 x 16 cm)

I principi dell'elettroforesi bidimensionale - Prima dimensione: isoelettrofocalizzazione: separazione in base al punto isoelettrico - Seconda dimensione: Elettroforesi in condizione denaturante (SDS) su gel di poliacrilammide

2D-PAGE - 1° Dimensione IEF pH 3.5... pH 10 - PAGE Mw (Kd) - Dimensione 200 - Potere di risoluzione:

1. 1001000 proteine/gel
2. 502°
3. 3010ImmobilineDryStrip pH 3–11NL, 24 cmusing 0.5% IPGBuffer 3–11 NL,pH 3–5.6 NL pH 7–11 NLpH 5.3–6.5 pH 6.2–7.5,
4. Strategie utilizzate per la proteomicacon elettroforesi
• Analisibidimensionale di lisaticellulari:caratterizzazione delleproteine
• Comparazione tramiteelettroforesibidimensionaledell’espressione diproteine
• Identificazionemediantespettrometria di massa
5. Strumento per la 1°dimensione su gradientedi pH immobilizzato
1. Preparazione del campione per laprima dimensione
6. 2° Dimensione
7. Metodi di rivelazione
• Le proprietà più importanti di un colorante sono:
• Elevata sensibilitàrange di linearità
• Elevato
• Riproducibilitàcon i metodi di identificazione delle
• Compatibilitàproteine Universali (blu coomassie)
• Metodi Specifici (metodi di rivelazione dimodificazioni post traduzionali)
8. BIOINFORMATICS
9. Up to 36 2D-databasesare now available

ininternet Swiss 2D PAGE

Applicazioni della proteomica in campo clinico:

Ricerca biomarker