Biologia Molecolare

DNA

La DNA polimerasi III si accorge di un errore, si stacca e

vengono reclutate le polimersi IV e V, sono polimerasi

TLS, risolvono il danno aggiungendo le basi al filamento

di neosintesi, si avrà una mutazione. Passato l’errore, IV e

V si staccano, la III si riattacca e continua la sintesi.

Modelli alternativi della sintesi translesione: i due modelli descrivono il meccanismo della sintesi

translesione, ciascuno di essi valido in particolari contesti:

A) modello di scambio delle polimerasi: la DNA polimerasi replicativa processiva sintetizza il DNA fino ad

incontrare una lesione nel DNA stampo. La DNA polimerasi si blocca ed è sostituita da una o più DNA

polimerasi translesione che sopraggiungono per replicare il DNA a libello del danno e subito dopo. In seguito

a questo bypass nella replicazione, la DNA polimerasi replicativa, ritorna, sostituisce la polimerasi

translesione e riprende la replicazione progressiva.

b) Nel modello di riempimento dell’interruzione, la DNA polimerasi replicativa progressiva sintetizza il

DNA fino a incontrare una lesione nel DNA stampo; invece di bloccarsi al punto dell’interruzione la

polimerasi oltrepassa il danno, continuando la sintesi del DNA a valle delle lesione al DNA e lasciandosi

indietro un’interruzione. Successivamente una o più DNA polimerasi translesione sintetizzano il DNA in

corrispondenza dell’interruzione, riempiendola.

2) INVERSIONE DEL DANNO:

Metodo di riparazione raro, riparazione del danno diretto

-fotoriattivazione o fotoliasi : elimina direttamente dimeri di timina che si formano per raggi UV, la fotoliasi

usa l’energia solare per rompere i legami covalenti che legano due timide adiacenti, le basi vengono riparate

perché viene tagliato il legame covalente che formava nella duplex una specie di angolo.

-rimozione dei gruppi metilici: rimozione gruppo metilico dalla metilguanina, la base ha una

conformazione più grande quindi causa una distorsione della doppia elica, l’enzima coinvolto è la

metiltrasferasi che stacca il gruppo metilico dalla guanina e lo trasferisce sui residui di cisteina

3) RIMOZIONE DEL DANNO:

Riparazione per escissione delle basi (BER):

I danni di origine endogena causati da ROS, idrolisi delle basi azotate, perdita spontanea di gruppi amminici

sono riparati da BER. Per danni causati da ROS, DNA glicosilasi specifiche, in grado di riconoscere i tipi di

lesione, rompono il legame glicosidico tra zucchero e base azotata danneggiata; quando enzimi identificano

la base alterata, comprimono la doppia elica del DNA cosi la base alterata viene inglobata in una cavità della

glicosilasi. L’enzima taglia il legame glicosidico tra base azotata e zucchero. Successivamente APE1

(endonucleasi) riconosce il sito privo di base e indice il legame fosfodiesterico.

A questo punto:

1) Short Patch BER: la DNA polimerasi β rimuove il desossiribosio privo della base e riempie il buco con

un nuovo nucleotide, saldato poi dalla ligasi

2) Long Patch BER: la DNA polimerasi δ o � e PCNA allungano 3’OH di alcuni nucleotidi, il filamento

spelato vie è poi tagliato da FEN1 (una nucleasi) che riconosce la particolare struttura che si forma durante la

reazione, la discontinuità è poi saldata dalla ligasi.

Riparazione per BER: questo meccanismi ripara i danni endogeni causati da stress ossidati o da danni

esogeni causati da agenti mutageni sulle basi; esistono due tipi di BER: short patch (viene sostituito solo il

nucleotide con la base alterata), long patch (la regione riparata è di una decina di nucleotidi).

Riparazione per escissione di nucleotidi (NER):

Ripara le lesioni che provocano una distorsione della doppia elica del DNA e che sono causate da agenti

chimico-fisici; il NER è richiesto per la riparazione dei danni causati da raggi UV.

La combinazione delle diverse mutazione e l’analisi della sensibilità ad un mutageno permettono di

raggruppare le mutazioni in gruppi di epistasi.

Il NER si suddivide in due vie che poi convergono in un meccanismo comune:

-GG NER: controlla intero genoma alla ricerca di eventi che causano la distorsione della doppia elica

- TCR NER: agisce su danni localizzati nelle regioni trascritte dalle RNA polimerasi

In tutti gli eucarioti il NER è diviso in: GG-NER e TCR-NER; i due meccanismi si distinguono nelle fasi

iniziali per poi convergere in un meccanismo comune.

In GG-NER il complesso proteico XCP individua regioni in cui il corretto appaiamento delle basi è alterato

a causa di una torsione della doppia elica; in TCR-NER diversi tipi di lesione nelle regioni trascritte

determinano un blocco delle RNA polimerasi che devono essere rimosse dal DNA per permettere la

riparazione, la rimozione delle RNA polimerasi richiede due proteine specifiche CSA e CSB.

Successivamente i passaggi di GG-NER e TCR-NER sono identici: il complesso multiproteico TFIIH apre il

DNA per un tratto di 30 nucleotidi attorno alla lesione, la proteine XPA conferma la presenza della lesione

legandosi ad essa (se non si lega, la reazione termina a questo stadio). La regione del DNA aperta

dall’elicasi è stabilizzata dalla proteine RPA; XPG e ERCC1 sono endonuclesi NER specifiche che tagliano

rispettivamente in 3’ e in 5’ il filamento di DNA contenente la lesione generando un frammento di 30

nucleotidi che verrà poi eliminato.

E’ stato così generato un buco con un’estremità 3’OH nel filamento danneggiato che può ora essere riparato

di normali enzimi che replicano il DNA copiando il filamento complementare che non è stato danneggiato.

Riparazione di errori replicativi (MMR):

Durante la replicazione del DNA, l’apparato replicativo può compiere degli errori:

-inserire un nucleotide che non rispetta la complementarietà delle bas

-provocare delezioni/inserzioni di nucleotidi in corrispondenza di sequenze ripetute più volte.

Questi errori vengono riparati dal MMR, è un meccanismo complesso che richiede proteine specifiche e

proteine normalmente coinvolte nella replicazione del DNA.

L’apparato enzimatico che agisce durante la replicazione può compiere degli errori durante la replicazione:

sul filamento neosintetizzato può venire inserita una base sbagliata (generando appaiamento sbagliato AC)

o si possono formare piccole bolle dovute allo scivolamento dell’apparati replicativo in corrispondenza di

sequenze nucleotidiche ripetute. Tali strutture anomale sono riconosciute da MutSα e MutSβ che reclutano i

complessi MutLα e MutLβ; il filamento neosintetizzato contente gli errori replicativi viene riconosciuto e

processato da esonucleasi (Exo1) che degrada il filamento di DNA in direzione 5’ 3’, successivamente



attraverso interazioni con tutto l’apparto di replicazione, viene ri-sintetizzato il filamento di DNA corretto.

Riparazione di rottura su entrambi i filamenti di DNA:

La lesione più pericolosa è la rottura su entrambi i filamenti del DNA, chiamata DSB; è generata da agenti

chimico-fisici (in particolare le radiazioni ionizzanti) e possono anche generarsi durante la replicazione del

DNA se il filamento di neosintesi incontra un’interruzione (nick) sul filamento stampo da copiare.

La risposta ai DSB è molto complessa e collegata a meccanismi di checkpoint; la riparazione di DSB avviene

principalmente mediante un meccanismo di ricombinazione tradizionale o mediante giunzione diretta delle

estremità rotte.

Il primo meccanismo è HR e coinvolge numerose proteine ricombinative; dallo schema si vede che HR

richiede l’esistenza di una copia di DNA identica a quella contenente la rottura e che la copia intatta di DNA

viene usata come stampo per riparare quella contenente il DSB.

La giunzione diretta delle estremità di un DSB può avvenire anche tramite un meccanismo alternativo NHEJ,

una reazione più semplice e che richiede un numero limitato di fattori proteici.

La possibilità di riparare un DSB tramite uno o l’altro dei processi dipende dalla fase del ciclo cellulare,

infatti il meccanismo HR richiede una copia di DNA intatta presente o nel cromatide fratello o sul

cromosoma omologo; mutazioni nei geni coinvolti nella riparazione dei DSB causano una predisposizione a

vari tumori.

HR richiede l’azione coordinata di diverse proteine: il complesso MRN con l’ausilio di alcune proteine

modifica il DSB originario causando la degradazione in direzione 5’->3’ delle estremità 5’ di ciascun DSB;

si generano cosi delle regioni a singolo filamento che sono stabilizzata dal legame con la proteina RPA.

Successivamente Rad51 altre proteine formano un nucleo proteico in cui il DNA a singolo filamento viene

ricoperto da una proteina (Rad51) e procede verso le sequenze omologhe di DNA presenti sul cromosoma

omologo non danneggiate formando la Giunzione di Holliday. La perdita dai Rad51 all’estremità 3’OH

innesca la neosintesi di DNA, la risoluzione degli intermedi di ricombinazione e l’azione della ligasi genera

due molecole riparate

Risposta cellulare a danni sul DNA e connessione tra riparazioni e ciclo cellulare:

Negli eucarioti la corretta successioni delle fasi del ciclo cellulare è assicurata da meccanismi di

sorveglianza, i Checkpoint, tra questi uno dei più importanti è il Checkpoint da danno al DNA; la

conseguenza più evidente dell’attivazione del checkpoint è il rallentamento o blocco temporaneo del ciclo

cellulare. Se la quantità di danni al DNA è tale da non poter essere riparata la cellula attiva l’apoptosi (morte

cellulare programmata), in modo da non correre il rischio di trasmettere alle generazioni successive

un’informazione genetica alterata e quindi dannosa.

L’attivazione dei checkpoint determina un blocco parziale o un rallentamento del ciclo cellulare e questo

fornisce più tempo alla cellula per riparare i danni o per innescare l’apoptosi. Attraverso interazioni fisiche

con proteine riparative o riconoscendo particolari strutture sul DNA danneggiato, alcune proteine richieste

per l’attivazione del checkpoint vengono reclutate in prossimità della lesione; queste proteine vengono

definite Sensori del danno.

Le proteine che agiscono agli stadi iniziali del checkpoint sono ATM e ATR, esse innescano la trasduzione

del segnale del checkpoint.

La ricombinazione:

Ricombinazione genica: tutti i processi che modificano l’organizzazione strutturale del DNA mediante

rotture e unioni della molecola; è fondamentale per la diversità genetica, per assicurare la corretta

segregazione dei cromosomi, e per la riparazione di alcuni tipi di danno al DNA: essenziale in meiosi, per

generare la diversità genetica e per la segregazione cromosomica, e in mitosi per riparare i danni al DNA e

far ripartire le forche replicative bloccate.

L’appaiamento dei cromosomi omologhi durante la meiosi permett