Biologia Molecolare

Biologia molecolare

Struttura degli acidi nucleici

Gli acidi nucleici (DNA e RNA) sono polimeri lineari la cui unità costituzionale è il nucleotide. I nucleotidi sono costituiti da:

• Zucchero pentoso (desossiribosio, manca OH in posizione 2, o ribosio, c'è OH in posizione 2); il gruppo OH conferisce instabilità alla molecola di RNA, il DNA che ha un H al posto dell’OH è più stabile.
• Base azotata: purine (doppio anello eterociclico, AG), pirimidine (singolo anello, CT). La differenza tra U e T è che T ha un gruppo metilico in posizione 5’, mentre U no. Ciascuna base è legata in posizione 1’ di uno zucchero con legame glicosidico che interessa N1 delle pirimidine e N9 delle purine.
• Gruppo fosfato

Nucleoside: base legata in posizione 1 allo zucchero (adenosina, guanosina, citidina, timidina, uridina).

Nucleotidi: nucleoside con 1 o più gruppi fosfato che dona acidità alla molecola; il gruppo fosfato può trovarsi in posizione 5’ o 3’. I nucleotidi usati come substrato per la sintesi di DNA e RNA hanno 3 gruppi fosfato legati in serie sulla posizione 5’ dello zucchero (questi gruppi fosfato vengono indicati con αβγ), ogni nucleotide trifosfato perde 2 gruppi fosfato quando viene usato come substrato per la sintesi degli acidi nucleici. Un gruppo fosfato forma un legame con C5’ di uno zucchero e C3’ dello zucchero successivo (legame fosfodiestere), il legame conferisce polarità alla molecola: 5’→3’.

Se non sono inseriti nella catena possono avere due o tre gruppi fosfato; ad esempio i nucleotidi della fotosintesi hanno 3 gruppi fosfato che vengono indicati come alfa beta e gamma (il fosfato alfa è legato tramite legame fosfodiestere, mentre quelli tra i fosfato sono legami fosfo-anidride). I nucleotidi sono uniti insieme covalentemente da legami fosfodiestere tra il gruppo 3’OH di uno zucchero e il 5’-fosfato del successivo.

Lo scheletro della catena polinucleotidica è formato dall’alternanza di zuccheri e di gruppi fosfato e le basi sporgono lateralmente.

Regola di Chargaff

La percentuale di A è sempre uguale alla percentuale di T, e la percentuale di G è uguale alla percentuale di C; questa regola non vale per l'RNA.

Basi azotate: sono anelli eterociclici suddivisi in purine e pirimidine; le basi possono subire modificazioni chimiche essenziali per i processi biologici che coinvolgono il DNA e l'RNA. La complementarità delle basi azotate permette alle coppie di compattarsi nel modo energeticamente più favorevole all’interno della doppia elica; i membri di ciascuna coppia di basi si possono adattare insieme dentro la doppia elica solo se le due catene polinucleotidiche sono antiparallele. AT forma un legame doppio, CG un legame triplo.

Lo scheletro della catena è costituito dall'alternanza di zuccheri di gruppi fosfato con le basi che sporgono lateralmente; la catena ha una polarità 5' → 3': il nucleotide all'estremità della catena 5' ha un gruppo 5'-fosfato libero mentre il nucleotide all'estremità ha un gruppo 3'-OH libero.

I nucleotidi sono legati tra loro e formano una catena polinucleotidica, alternanza di zuccheri e gruppi fosfato all'esterno con basi azotate all'interno; c'è solo un gruppo fosfato.

La polarità del DNA (cioè i filamenti hanno due estremità che sono chimicamente diverse) è il modo in cui i nucleotidi sono allineati insieme e danno al filamento una polarità chimica, all’estremità 3’ c’è il gruppo OH, mentre all’estremità 5’ c’è il gruppo COOH. La polarità è importante perché tutte le reazioni biologiche sono specifiche per una delle due estremità.

Struttura fisica del DNA

Il DNA è composto da due catene polinucleotidiche legate da legami idrogeno, costituite da 4 tipi di nucleotidi uniti covalentemente; formano una struttura con un ossatura zucchero-fosfato da cui sporgono le basi. Le basi sono disposte quasi perpendicolarmente rispetto all’asse della doppia elica.

Secondo il modello di W. R C, il DNA è formato da:

• Due catene polinucleotidiche antiparallele (cioè disposte con polarità 5’→3’) con le estremità 3’ 5’ opposte.
• Uno scheletro zucchero-fosfato esterno e all’interno le basi azotate unite tra loro in modo complementare con legami a idrogeno.
• È una doppia elica destrosa, un giro dell’elica è pari a 34 amstrong, diametro 20 amstrong, le basi sono distanziate 3,4 amstrong e troviamo 10,6 paia di basi per ogni giro dell’elica.
• L’avvolgimento dei due filamenti l’uno sull’altro crea due scanalature/solchi (maggiore 12 amstrong e minore 22 amstrong), essi sono importanti per il riconoscimento della sequenza di DNA.

Le catene polinucleotidiche singole hanno una parte idrofilica (scheletro zucchero-fosfato) e una parte idrofobica (le basi). Nella doppia elica i due scheletri, con caratteristiche negativa, si dispongono all’esterno della struttura a contatto con l’acqua, le basi all’interno sfuggendo così all’acqua; la stabilità della molecola dipende da diverse forze: legami idrogeno tra le basi, effetto idrofobico di impilamento delle basi. La stabilità dipende anche dalla composizione in basi: un DNA ricco di GT è più stabile di uno ricco di AT.

Strutture alternative del DNA

Determine attraverso studi di diffrazione a raggi X in diverse condizioni:

• Alta umidità (95%) e bassa salinità (condizioni cellulari, in vivo) → DNA B, destroso
• Minore umidità (75%) e alta salinità → DNA A, destroso, basi sono più curvate rispetto al piano perpendicolare della doppia elica, 11 coppie di basi per giro, passo di 25 A e diametro di 23 A
• Alta salinità o in presenza di alcoli → DNA Z, sinistrosa, passo di 46 A e diametro di 18 A

Strutture speciali

Tripla elica: di solito gli acidi nucleici sono a singolo o doppio filamento, ma possono formarsi regioni a tripla elica; un filamento di DNA duplex con un filamento composto solo da purine e l’altro da pirimidine, può raccogliere nel solco maggiore une terza catena.

Quartetti di G: si forma tra quattro tratti di DNA/RNA a singolo filamento che contengano 3 o più G consecutive; i quattro tratti si affiancano l’uno all’altro a formare quattro filamenti tenuti insieme da legami idrogeno tra le G.

Ripetizioni invertite: sono presenti due copie della stessa sequenza in orientamento opposto.

Sequenza palindromica: due sequenze identiche adiacenti, ma di orientamento opposto, la duplex è identica se letta in direzione 5’→3’.

Struttura cruciforme: forma assunta da alcune sequenze ripetute, in cui ciascun filamento di una delle due sequenze ripetute trova una regione complementare cui appaiarsi adiacente nello stesso filamento. Le sequenze ripetute costituiscono due steli, mentre le basi che separano le due sequenze ripetute non hanno modo di appaiarsi e formano due anse (struttura a forcina).

La topologia del DNA

La struttura a doppia elica presenta molti vantaggi: stabile, protegge informazione genetica al suo interno, possibilità di individuare errori e rotture nel genoma (grazie a complementarietà basi); lo svantaggio è che tutti gli eventi richiedono un’apertura della doppia elica e la separazione dei filamenti per togliere i superavvolgimenti (che possono interferire con espressione dei geni, duplicazione e segregazione cromosomi). Il DNA si può avvolgere su se stesso con conseguente cambiamento della sua conformazione nello spazio. Lo stato superavvolto del DNA contiene energia che viene utilizzata per aprire i filamenti.

Il superavvolgimento può avvenire in molecole di DNA circolari o lineari dove però le estremità sono fissate alle strutture del cromosoma; il DNA batterico è una molecola circolare mentre quello eucariotico è una molecola lineare ancorata a proteine (estremità fissate). Per controllare lo stato di superavvolgimento il DNA deve essere tagliato su uno o entrambi i filamenti, questo compito è svolto dalla Topoisomerasi.

Le conseguenze del superavvolgimento cambiano a seconda del verso di attorcigliamento:

• Superavvolgimento negativo (sinistroso): DNA si avvolge in direzione opposta rispetto a quella della doppia elica.
• Superavvolgimento positivo (destroso): DNA si avvolge nella stessa direzione della doppia elica.

Numero di legame (Lk)

Consideriamo due filamenti circolari chiusi che si avvolgono l’uno intorno l’altro e che i due filamenti possano passare l’uno attraverso all’altro per essere separati.

Numero di legame (Lk): è il numero di volte che un filamento dovrebbe passare attraverso l'altro affinché le due catene possano separarsi o avvitarsi l'una sull'altra.

• Specifica rigorosamente il numero dei giri dell'elica in un DNA circolare chiuso in assenza di superavvolgimento.
• Non varia quando la doppia elica subisce qualunque tipo di torsione o deformazione, varia solo se una delle catene di DNA si interrompe.

Il numero di legame Lk è definito dalla seguente equazione: Lk= Tw + Wr (descrive le possibili conformazioni che il DNA assume nello spazio 3D).

Numero di avvolgimento/torsione o twisting (Tw): frequenza, numero di volte che un filamento si avvolge sull'altra; è una proprietà intrinseca alla molecola ed è: n° bp/ n° bp per giro elica (10,4 per DNA in forma B). Definisce il grado di avvitamento della doppia elica.

Numero di avvitamento/contorsione o writhing (Wr): numero di superavvolgimenti/avvitamenti, numero di incroci dell'asse longitudinale.

Per il DNA circolare chiuso o DNA con estremità fissate, Lk è costante e non può essere modificato da nessuna deformazione che non comporti la rottura e la riunione di uno o entrambi filamenti; per modificare Lk occorre rompere la doppia elica (nick) e far ruotare i due filamenti l'uno rispetto all'altro in modo da aumentare o diminuire il numero di volte che un filamento si incrocia con l'altro.

Ad ogni cambiamento la molecola risponde cercando di ritrovare il proprio equilibrio naturale di struttura, esempio:

• Se si riduce L di 2 unità riducendo di 2 unità T, la molecola introduce 2 superavvolgimenti negativi (W=-2) per ripristinare il valore T=20.
• Se si aumenta L di 2 unità aumentando 2 unità T, la molecola introduce 2 superavvolgimenti positivi (W=+2) per ripristinare il valore T=20.

Esistono due tipi di superavvolgimento:

• Plectonemico: nel DNA nudo.
• Toroidale: quando DNA avvolto intorno all’ottamero.

Topoisomeri: molecole circolari di DNA chiuse di uguale lunghezza ma che differiscono solo per il numero di legame Lk. Il superavvolgimento contiene energia libera perché il DNA tende a ritornare nel suo stato di quiete e il DNA negativamente superavvolto facilita i fenomeni biologici in cui i filamenti devono essere parzialmente denaturati; una molecola di DNA duplex chiusa in cui introduciamo superavvolgimenti negative, tende a scaricare questa tensione torsionale arrotolandosi in senso opposto. La molecola di DNA contiene quindi dell’energia che permette al DNA di subire delle transizioni strutturali.

DNA topoisomerasi

Le Topoisomerasi sono molecole di DNA circolare covalentemente chiuse di uguale lunghezza, che differiscono solo per Lk. L'energia libera contenuta in una molecola superavvolta può indurre transizioni strutturali del DNA. Esse sono in grado di tagliare il DNA, modificano il numero di legame e ripristinano la doppia elica. Le DNA topoisomerasi impediscono al DNA di aggrovigliarsi durante la replicazione: man mano che la forcella si muove lungo il DNA a doppio filamento, crea il “problema dell’avvolgimento”; perché una forcella replicativa si muova, l’intero cromosoma dovrebbe ruotare, ma questo richiederebbe troppa energia, per risolvere questo problema si forma un perno nell’elica ad opera delle DNA topoisomerasi. La DNA topoisomerasi è una nucleasi reversibile che si attacca covalentemente ad un fosfato dell’ossatura del DNA rompendo così un legame fosfodiestere in un filamento di DNA, questa reazione è reversibile e il legame fosfodiestere si riforma quando la proteina si stacca.

Ogni cellula contiene enzimi specializzati, le topoisomerasi che lavorano per mantenere un adeguato livello di superavvolgimento del DNA; esse catalizzano la rottura temporanea e la ri-unione dei filamenti di DNA introducendo dei tagli (nick) temporanei. Le estremità generate dalla rottura non sono mai libere, ma sono manipolate dentro i confini dell’enzima (l’enzima contiene la parte che viene tagliata); sono enzimi altamente conservati, hanno la stessa funzione anche in organismi molto distanti tra loro, hanno domini che catalizzano le stesse reazioni: tagliano, attaccano ecc. Convertono (isomerizzano) un topoisomero in un altro modificando il numero di legame Lk; non sono dipendenti dalla sequenza del DNA, tagliano e legano senza che ci sia una sequenza specifica. Non usano ATP, ma energia libera.

Caratteristiche:

• Legano covalentemente una tirosina allo scheletro fosfato tramite reazione di transesterificazione fatta dal suo gruppo OH.
• L'intero processo utilizza l'energia libera contenuta nel DNA superavvolto; no ATP.
• Si differenziano in base al meccanismo di azione e alla loro sequenza amminoacidica.

Le topoisomerasi si differenziano per il meccanismo di azione con cui cambiano la topologia del DNA:

• Rotazione controllata: enzima introduce una singola rottura su un filamento a doppia elica e permette la rotazione su se stesso del filamento.
• Strand passage (passaggio del filamento): rottura a doppio o singolo filamento, allarga l’interruzione prodotta e fa passare l’altro filamento o doppia elica attraverso la rottura che viene poi risaldata.

Ci sono due classi di topoisomerasi:

Topoisomerasi I

• Sono monomeri.
• Tagliano un solo filamento di DNA all’estremità 5’, creando un’apertura in cui può passare la doppia elica o l’altro filamento.
• Formano un legame tirosina-5'fosfato.
• Rilassano superavvolgimenti negativi.
• Non richiedono ATP o energia.

Esempio: duplex con 3 superavvolgimenti negativi, taglia un filamento, quello non tagliato ruota e passa nel buco e così non ci sono più 3 superavvolgimenti ma 2.

Meccanismo di azione: enzima si lega al doppio filamento, apre la doppia elica, taglia uno dei filamenti, il filamento non tagliato/integro passa attraverso l’apertura del primo filamento, enzima risalda filamento che non aveva tagliato. Produce una temporanea rottura a singolo filamento (nick), la rottura permette alle due sezioni dell’elica del DNA su entrambi i lati del nick di ruotare liberamente l’una rispetto all’altra, usando il legame fosfodiestere nel filamento opposto al nick come perno. Come risultato la rotazione può avvenire solo in un breve tratto dell’elica (la parte davanti alla forcella). Visto che il legame covalente tra DNA topoisomerasi al gruppo fosfato mantiene l’energia del legame fosfodiestere, la ricucitura è rapida e non richiede ulteriore energia. Il meccanismo di riunione è catalizzato dalla DNA ligasi.

Topoisomerasi II

• Sono dei dimeri o multidimeri (non sono proteine che lavorano da sole, ma si legano a coppie al filamento di DNA).
• Tagliano entrambi i filamenti all’estremità 5’.
• Formano un legame tirosina-5'fosfato.
• Rilassano superavvolgimenti negativi e positivi.
• Richiedono energia ATP per promuovere cambiamenti nella conformazione del complesso enzima-DNA e non per tagliare e risaldare i due filamenti.

Forma un legame covalente con entrambi i filamenti dell’elica di DNA, producendo una rottura a doppio filamento transitoria nell’elica; questi enzimi sono attivati da siti sui cromosomi in cui le doppie eliche si incrociano. Una volta che la molecola di topoisomerasi II si lega a questo sito di incrocio, la proteina usa l’idrosili di ATP per svolgere in modo efficace le seguenti reazioni:

1. Rompe reversibilmente una doppia elica per creare un varco nel DNA.
2. Fa passare la seconda doppia elica vicina attraverso la rottura.
3. Risalda la rottura e si dissocia dal DNA.

In questo modo le topoisomerasi II possono separare in modo efficiente due cerchi di DNA interconnessi.

Segmento G: filamento tagliato

Segmento T: filamento che passa attraverso l’apertura

Meccanismo di azione, a doppio cancello: Il segmento T entra nella parte superiore dell’enzima, che si apre per accoglierlo; dopo l’apertura della doppia elica del segmento G, il segmento T attraversa tutto l’enzima, che si apre nella parte inferiore, rimuovendo due superavvolgimenti alla volta. Enzima ha conformazione aperta pronto per accettare al suo interno il segmento T, mentre ha già al suo interno il segmento G, il legame con ATP genera un cambio conformazionale e il cancello N si chiude; l’idrolisi dell’ATP genera un nuovo cambio di conformazione. Il DNA G viene tagliato e il DNA T passa attraverso il taglio provocando l’apertura del secondo cancello, il DNA T viene espulso dall’enzima.

Topoisomerasi: tolgono superavvolgimenti

• Top 1: hanno un numero dispari (I, III, V)
• Top 2: hanno un numero pari (II, IV, VI)

Girasi: introducono superavvolgimenti

• Girasi: (top II, superavvolgimenti negativi)
• Girasi inversa (top I, superavvolgimenti positivi)

Le topoisomerasi umane sono un bersaglio di studio per la terapia.