Appunti Chimica dei fitofarmaci

ESERCITAZIONE

✓ Determinazione dei residui di fitofarmaci nel suolo, nelle acque e nei vegetali

✓ Estrazione e determinazione dei residui di Chlorpyrifos e Spinosad nel terreno

✓ Interferenze reciproche tra fitofarmaci e biomassa microbica nel suolo e in materiali organici di diversa

provenienza

✓ Ecotossicologia da fitofarmaci e biomarker

Determinazione dei residui di fitofarmaci in matrici ambientali quali suolo, acqua, vegetali e in matrici viventi

quali animali o prodotti animali

Ci sono dei passaggi comuni da effettuare per determinare i residui:

1. Estrazione del campione

2. Purificazione dell’estratto

3. Identificazione e analisi quantitativa del composto estratto

4. Messa a punto del metodo analitico

Fase 1: Estrazione del campione

L’estrazione del campione consiste nella separazione del composto da analizzare dalla matrice, tramite un

estraente (solvente). Le caratteristiche del solvente sono: massima solubilità del pesticida nel solvente, minima

affinità del solvente per le sostanze endogene della matrice (impurità o impurezze, ad esempio nel suolo sono

presenti i colloidi che potrebbero essere estratti per affinità con il solvente).

Deve trattarsi di una estrazione quantitativa, cioè bisogna garantire l’estrazione del 100% del prodotto presente

nella matrice: non è possibile raggiungere completamente il massimo ma si può assumere che lo sia quando si

fanno esperimenti che durano nel tempo.

Il principio base dell’estrazione è la polarità, anche se inevitabilmente si estrae anche parte delle impurezze:

bisogna scegliere il solvente che, pur estraendo la totalità del fitofarmaco, estrae la minima parte della matrice.

Estraenti comunemente usati in

ordine crescente di polarità

1. Etere di petrolio (miscela

di idrocarburi leggeri)

2. Tetracloruro di carbonio

3. Benzene

4. Diclorometano

5. Cloroformio

6. Etere etilico

7. Acetato di etile

8. Acetone

9. Alcool etilico

10. Alcool metilico

11. Acqua

Si possono utilizzare delle miscele dei vari solventi, in percentuali diverse a seconda dei casi pratici; si cerca il

compromesso utile per garantire l’estrazione del campione e il minimo di impurezze. Nota: il diclorometano è

stato revocato con Regolamento 1107/2009.

• Estrazione da suolo: si usano solventi che sono miscele di alcol e acqua o alcol puro (alcol metilico). Per altre

matrici si usano solventi diversi.

• Estrazione dall’acqua: si usa un solvente non miscibile in acqua per creare le due fasi e mettere in agitazione.

Prevalentemente si utilizza cloroformio da mettere in acqua (1:1) e si agita per creare emulsione; questo

determina l’estrazione del fitofarmaco e, a riposo, si separano le due fasi (il cloroformio è più pesante dell’acqua).

È importante l’estrazione, anche se si trova in acqua, perché è necessario fare purificazione e poi evaporazione

del solvente: il cloroformio è basso bollente e tende ad evaporare completamente a 40°C, l’acqua dovrebbe

essere portata a 100°C e questo comporterebbe anche una degradazione del campione, oltre che una perdita di

parte del fitofarmaco.

• Estrazione dai vegetali: si macina finemente il tessuto, pestare in mortaio ed estrarre con acetone.

• Estrazione in liquidi o sostanze organiche di materiale vivo: diversi procedimenti. Nei liquidi (latte) si procede

con la centrifugazione e conseguente separazione della crema, poi si estrae con etere di petrolio. Nelle polveri

(latte in polvere e derivati) è necessario fare prima la ricostituzione e poi l’estrazione in imbuto separatore con

mezzo estraente metanolo, dietiletere o etere di petrolio. Nei prodotti solidi (formaggi, carne, pesce, uova) si

omogeneizza la matrice per ottenere un fluido e poi l’estrazione con Soxtherm esano-acetone.

Fase 2: Purificazione dell’estratto

L’estratto con solvente porta con sé anche delle impurezze derivate dalla matrice. La purificazione consiste

nell’eliminazione delle impurezze dalla soluzione estratta ed è una ripartizione:

• liquido/liquido = consiste nel passaggio del fitofarmaco dalla soluzione estratta ad un liquido (non miscibile con

il primo) per il quale è più affine. Due vantaggi: purificazione del fitofarmaco e poter evaporare facilmente la fase

cloroformica a 40 °C a bagnomaria.

La ripartizione liquido/liquido si effettua all’interno dell’imbuto

separatore: è un contenitore in vetro con un tappo in posizione

superiore e un restringimento inferiore che termina in un

rubinetto. L’imbuto raccoglie l’estratto e il liquido con cui si deve

purificare (cloroformio); le due fasi sono quasi del tutto

immiscibili e si pone in agitazione per circa 1 minuto, il

fitofarmaco viene trasferito nel cloroformio mentre le impurezze

permangono in acqua metanolo. Alla fine della purificazione, si

scaricano il solvente e l’acqua e si procede con cloroformio-

fitofarmaco. La fase cloroformica viene messa in evaporatore a

40 °C, ovvero il Rotovapor che fa ruotare il contenitore con

soluzione cloroformica.

La separazione tra i due solventi avviene in base alla densità: solventi meno densi dell’acqua sono etere etilico e

benzene, solventi più densi sono cloroformio e diclorometano. L’operazione va quindi ripetuta 2-3 volte perché

parte di un solvente si trova nell’altra fase e viceversa.

• liquido/solido = il componente in cui viene ripartito il fitofarmaco è in fase solida, consiste nel far passare

l’estratto liquido in una colonnina e ottenere un eluito. Se gli interferenti permangono nella colonnina, allora si va

avanti con l’eluito, altrimenti si recupera il fitofarmaco dalla colonnina. Si dice “in fase solida” perché i passaggi

sono determinati da una resina solida.

L’estrazione per adsorbimento è un processo fisico tra una fase solida e una fase liquida in cui la fase solida ha

una affinità maggiore per il composto da isolare rispetto al solvente in cui lo stesso composto è sciolto. Quando il

campione passa attraverso la fase solida gli analiti vengono concentrati sulla superficie del materiale adsorbente

mentre gli altri composti presenti nel campione eluiscono senza interagire. Il risultato è la purificazione e la

concentrazione delle sostanze isolate dal materiale adsorbente. Ciò può essere ottenuto grazie ad interazioni

specifiche tra i gruppi funzionali dei composti e il substrato della fase solida.

La fase solida adsorbente viene impaccata in una cartuccia (SPE cartridges). Il campione viene fatto passare

attraverso la cartuccia, alla cui base c’è una sostanza bianca che è la resina di separazione, in modo che i diversi

composti in esso presenti possano interagire con la superficie adsorbente venendo trattenuti o meno a seconda

della loro capacità di stabilire interazioni. Si ha ritenzione quando la fase solida riesce ad immobilizzare alcuni dei

composti presenti nel campione; la ritenzione cambia in funzione del tipo di adsorbente o del solvente utilizzato.

L’eluizione è il processo di rimozione delle sostanze isolate dall’adsorbente mediante il passaggio nella cartuccia

di un opportuno solvente (da usare nel minor volume possibile): maggiore è l’interazione tra adsorbente e analita,

minore è il rischio che questo venga eliminato dalla cartuccia durante le fasi di lavaggio utilizzate per eliminare

molecole interferenti coadsorbite.

Se si dovesse eluire un fitofarmaco apolare, sarebbe necessario utilizzare una resina apolare (polimeri a 8-12-18

atomi di carbonio, per questo C8-C12-C18) che quindi non lo trattiene ma trattiene gli interferenti. Se gli

interferenti permangono nella cartuccia si crea un orizzonte giallognolo, il fitofarmaco è stato eluito. Quindi si

raccoglie il fitofarmaco alla base.

Se invece volessi trattenere il fitofarmaco nella cartuccia si usa resina polare, cioè silica (fatte di silanolo, ovvero

silicio con terminazioni OH e possono essere derivatizzate, cioè etilate o metilate). Questo determina il

trattenimento del fitofarmaco che poi va eluito assieme alla cartuccia, con la giusta soluzione affine al fitofarmaco

e che lo riporti in fase liquida.

Per la purificazione del campione sono necessari quindi 5 steps:

1. Scelta della cartuccia → Cartucce da 1 ml per campioni < 1 ml, da 3 ml per volumi 1-250 ml, da 6 ml per volumi

> 1 ml ma più veloci.

2. Condizionamento della cartuccia → Consiste nell’aggiunta di un solvente adatto alla fase stazionaria che non

deve andare a secco tra il condizionamento e l’addizione del campione; si tratta di una preparazione della

cartuccia ad accettare il passaggio del campione.

3. Aggiunta del campione → Far passare la soluzione campione applicando il vuoto o una pressione positiva.

4. Lavaggio della cartuccia → Tale tecnica viene utilizzata in base alle caratteristiche della fase stazionaria, del

composto di interesse e delle impurezze.

5. Eluizione dei composti di interesse → Consiste nel risciacquo della cartuccia con un piccolo volume di

soluzione che rimuova i composti di interesse ma lasci le impurezze sulla cartuccia.

Fase 3: Identificazione e analisi quantitativa dell’estratto

L’identificazione è facoltativa perché si fa solo quando non si conosce la natura delle sostanze presenti.

Il pallone messo nel Rotovapor contiene solo il fitofarmaco, vi si aggiunge di nuovo una minima quantità di

solvente per poter estrarre con una pipetta il fitofarmaco e si mette in una provetta graduata. Quindi si porta a

volume di 1 ml in provetta, per riferire al totale il risultato finale.

Per identificare e quantificare il fitofarmaco si usano tecniche cromatografiche: liquida HPLC - High Performance

Liquid Chromatography o gassosa GC – Gas Cromatografia.

Cromatografia (“separazione sulla colonna”) consiste in un metodo fisico di separazione nel quale i componenti

da separare si distribuiscono tra due fasi: una fissa, detta stazionaria tendenzialmente apolare, costituita da un

letto attraverso il quale di muove l’altra fase, detta mobile. Il fitofarmaco deve instaurare una temporanea

relazione con la fase stazionaria ma contemporaneamente deve essere eluito lentamente (rotola lentamente

nella colonnina). Il solvente invece scorre molto velocemente e viene eliminato.

HPLC – High Performance Liquid Chromatography

Il flusso della fase mobile viene ottenuto mediante pompe ad alta pressione (High Performance o High Pressure)

che devono garantire una portata perfettamente costante e riproducibile. In fase normale, il letto stazionario è di

natura fortemente polare e la fase mobile non è polare; in fase inversa avviene il contrario. Le analisi dei

fitofarmaci si fanno in fase inversa, cioè la fase stazionaria ha sempre una apolarità maggiore di quella del