Fondamenti di biochimica applicata

Analisi dei tempi di dimezzamento

Per analizzare i tempi di dimezzamento, è necessario prendere i valori a intervalli costanti e conoscere l'intervallo considerato. In questo caso, i valori sono presi ogni 6.25 secondi, partendo da circa 3 secondi.

Traccia	Log	Tempo
1	0.7924	6.7
2	0.8261	5.9
3	0.7709	9.35
1	0.7243	5.3
2	0.7160	4.2
3	0.6232	15.6
1	0.6532	4.5
2	0.6021	3.0
3	0.4771	21.85
1	0.5798	3.8
2	0.4914	2.1
3	0.3222	28.1
1	0.4914	3.1
2	0.3802	2.4
3	0.1761	34.35
1	0.4314	2.7
2	0.2788	1.9
3	0.0414	40.6
1	0.3424	2.2
2	0.1461	1.4
3	-0.0969	0.8

Successivamente, si può tracciare il grafico dei logaritmi dei centimetri rispetto al tempo. Si può notare come le tracce siano rettilinee, permettendo di calcolare i tempi di dimezzamento.

In questo caso, i tempi di dimezzamento vengono calcolati tra 0.6 (cioè 3.98) e 0.3 (cioè 1.99). Questi rappresentano le costanti apparenti di pseudo I.

Dai tempi di dimezzamento è possibile ricavare ulteriori informazioni.

Quindi le k’ appordine: = 0.693/25=0.028 /s)traccia 1 t ½ = 25 s (k’ apptraccia 2 t ½ = 17 s (k’ = 0.693/17=0.041 /s)app= 0.693/13=0.053 /s)traccia 3 t ½ = 13 s (k’ app verso le concentrazioni della specie B (in M)Quindi si mettono in grafico le k’app VODLQWHUFHWWDH¶N RII 0VODSHQGHQ]DH¶N RQ&,1(7,&$(1=,0$7,&$0,&+$(/,60(17(1Nel saggio di attivita’ della LPO sono stati ottenuti i seguenti dati:µM=O ] 13 13 26 26 52 130 260 520 1300 ;Gruppo 1: [ H2 2µM/min[P] = 0.72 1.1 1.3 2.0 9.2 10.6 10.9 10.6 19.4µM=O ] 13 26 52 130 260 520 1300 ;Gruppo 2: [ H2 2µM/min[P] = 1.0 1.9 4.6 7.4 5.9 10.1 10.6E’ stato quindi effetuato il fit non lineare scartando il punto a piu’ alta concentrazione del gruppo1, perche’ evidentemente fuori dalla curvaE’ stato fatto quindi il plot dei doppi reciproci:127$5(I dati sperimentali ottenuti dal Gruppo 1 sono maggiormente viziati dall’erroresperimentale.

Per questo motivo il fit non lineare dell'equazione di Michaelis & Menten ha comunque potuto trovare una soluzione soddisfacente, mentre il grafico dei doppi reciproci di Lineawever-Burke non ha potuto fornire una soluzione soddisfacente.

(7,&$(1=,0$7,&$,167$7267$=,21$5,2H&DOFRODUH.PH9PD[ SURGRWWR P0FP >6XEVWUDWR@ P0∆ODA) Calcolare le pendenze in /min (tenere presente che si deve linearizzare il primo tratto delle tracce)

)DUHXQDWDEHOOD XQLWD¶GLPLVXUDP0'2'PLQP0PLQ Attenzione perche' le tracce non sono in ordine con le concentrazioni decrescenti del substrato

'2'PLQ6 P0PLQ 9WUDFFLD 6XEVWUDWR C) fare il grafico Prima su tutti i punti, per apprezzare la pendenza, poi solo su quelli iniziali per evidenziare le intercette La intercetta sull'asse delle ordinate e' 14 quindi Vmax= 0.071mM/min La intercetta sull'asse delle ascisse e' - 0.8 quindi Km= 1.25 mM1% Confrontare i dati

ottenuti con il fit non lineare/(*$0(',266,*(12$//$(02*/2%,1$µM)

Dati gli spettri della Emoglobina (concentrazione di Hb=10 alle diverse pressioni parziali diossigeno, calcolare il P½ e l’n (coefficiente di Hill)

P= 0 10 20 23 27 50 150 mm Hg

Per prima cosa occorre identificare la lunghezza d’onda in cui e’ massima la differenza tra la Hbossi e la Hb deossi. Quindi, contare i mm tra la ossi e la deossi

ossi – deossi = 46 mm :

successivamente, i mm tra la Hb deossi e gli altri spettri alle differenti pressioni di O2

mmP O2 mmHg

A questo punto si puo’ fare una proporzione tra i cm ed il grado di saturazione(se 46 mm Y=1; 34 mm Y= 0.74; 27 mm Y=0.59 cioe’ Y= x mm/46)

Fare percio’ una tabella per ricavare i dati per il plot di Hill

log mm Y 1-Y Y/1-Y log(Y/1-P O2 mmHg PO Y)

2 0 0 0 1.0000 --- ----

10 11 0.2391 0.7609 0.3143

20 18 0.3913 0.6087 0.6429

23 22 0.4783 0.5217 0.9167

27 27 0.5870 0.4130 1.4211

50 34 0.7391 0.2609

2.8333150 46 1.0000 0 ---1%,QUHDOWD¶DGUHEEHURSUHVLLYDORULDWUHGLIIHUHQWLOXQJKH]]HG¶RQGD H H DQGUHEEHIDWWDODPHGLDWUDLYDORULGL<RWWHQXWLFare quindi il plot di Hill trascurando il primo e l’ultimo punto (tutta Hb ossi e tutta Hb deossi)La linearizzazione per ottenere il P ½ e l’n di Hill pero’ va fatta solamente sui punti piu’ vicini aY=0.5, escludendo quindi i due punti alle estremita’: n (slope) = 2.6log P ½ = 1.37P ½ = 23.7 mmHg/(*$0(',8168%675$72$'81$3527(,1$µM)Dati gli spettri della proteina (concentrazione di proteina =15 alle diverse concentrazioni disubstrato, calcolare la Kd. ed il grado di saturazione ottenuto alla massima concentrazioneutilizzata di substrato Concentrazioni di substrato= 0 2 4 7 11 15 19 30 50 mM (N.B. non e’ dettoche 50 mM substrato sia saturante)La prima cosa da fare e’ identificare dove sia massima la differenza tra lo spettro della proteinasenza substrato e gli

spettri della proteina in presenza di substrato e dove sia più facile prendere le OD.

A) Poiché siamo nella condizione in cui Kd >> [proteina], si può approssimare la concentrazione di substrato libero a quella del substrato totale.

B) Poiché l'assorbimento ottico è proporzionale alla concentrazione delle specie, è sufficiente mettere in grafico le differenze di OD a 485 nm (∆OD) verso le concentrazioni di substrato totale. Si possono anche utilizzare direttamente i mm di distanza tra il punto a 485 nm dello spettro della proteina senza substrato e i punti a 485 nm della proteina alle differenti concentrazioni di ∆OD substrato. Infatti, i mm sono proporzionali alle a 485 nm. Per una maggior precisione bisognerebbe prendere due o tre lunghezze d'onda e fare la media.

TABELLA

[S] tot mm a 485 (mM) nm /W (concentrazione /5.G 5W (asintoto

Quindi abbiamo sia di substrato totale) che (i mm a 485 nm), mentre dobbiamo trovare sia (costante di

dissocuazione) che della isoterma di legame,cioe’ massima differenza in mm a 485 tra la proteina senza substrato e quella completamentesatura). Sapendo Rt si puo’ anche calcolare la saturazione raggiunta a 50 mM substrato (<)A questo punto si puo’ procedere sia con il grafico dei doppi reciproci che con il grafico diScatchardJUDILFRGHLGRSSLUHFLSURFL SORW>/5@YV>/W@1/[LR]= 1/[Rt] + Kd/[Rt] * 1/[Lt]JUDILFRGL6FDWFKDUG slope = Kd/[Rt] int=1/[Rt] SORW>/5@>/W@YV>/5@[LR]/[Lt]= [Rt]/Kd – 1/Kd * [LR]slope = -1/Kd; int= int (x)Facciamo dapprima la solita tabellina per fare i calcoli e trovarsi i valori necessari>6@ PP(LR) >6@(1/Lt) PP PP>6@(Lt) (1/LR) (LR/Lt) 3/27'(,'233,5(&,352&,.G=5W= slope*Rt=0.0214*46.6= 9.05 mM1/int = 1/0.0214 = 46.6(sono i mm di distanza tra lo spettro della proteinasenza substrato e quello della proteina completamente<satura che osserverei a 485 nm)40.5/46.6=

0.87Rapporto tra il punto osservato alla concentrazione di substrato=50 mM (40.5 mm) ed il punto a saturazione completa (46.6 mm)3/27',6&$7&+$5'.G=5W int-1/slope= - 1/0.10= 10 mM< 40.5/47.8=(x) = 47.8 0.84notare come il grafico di scatchard fornisca dei valori più vicini a quelli ottenuti con il fit nonlineare.'(7(50,1$=,21('(/30',3527(,1(&216'63$*(Determinare il peso molecolare delle proteine P1,P2,P3 e P4, sapendo che i pesi molecolari (MW) delle proteine Markers sono:116 ; 77 ; 38 ; 26 ; 18N.B. Tutti i pesi molecolari sono espressi in kDa.Si devono dapprima misurare le mobilità relative delle bande (Rf). La procedura più semplice è di misurare i centimetri con un righello. Questi vanno misurati dal limite tra l'upper (stacking) gel e il lower (resolving) gel, fino al centro dello spessore della banda.Si ottengono i seguenti valori (in cm):Rf (MW markers): 1.35 3.15 5.2 6.35 8.2 cmQuindi si fa logaritmo (qui in

base 10) dei rispettivi pesi molecolari. Ovviamente al pesomolecolare maggiore corrispondera’ la banda a mobilita’ inferiore.

Log(10) peso molecolare markers: 2.0645 1.8865 1.5798 1.4150 1.2553

A questo punto vengono messi in grafico i valori di Rf verso il logaritmo dei rispettivi pesimolecolari dei markers.

Viene quindi fatta passare una retta tra i punti e perinterpolazione si ricaveranno i log(10) dei pesimolecolari delle proteine:

Rf(P1 P2 P3 P4): 2.6 4.2 3.2 6.2 cm

log (10) P1 P2 P3 P4:1.9183 1.7205 1.8442 1.4733

Da qui si ricava poi il peso molecolare:

P1 P2 P3 P4: 83; 52; 70; 30; (6(5&,=,2

Calcolare l’estinzione molare di una proteina a 280 nm sapendo che il suo peso molecolare e’ 12500 e che unasoluzione 1mg/ml ha i seguenti valori di assorbimento a 280 nm dopo diluizione in un tampone che contieneuna molecola che assorbe anch’essa a 280 nm. Lo spettrofotometro era stato azzerato contro acqua). Ladiluizione 0:1 (controllo) significa che e’

stata fatta la lettura a 280 nm dell'assorbimento del solo tampone, senza la proteina. La lunghezza del cammino ottico della cuvetta è di 0.2 cm.

LOXL]LRQH DVVRUELPHQWRQPWT FRQWUROOR 5,68/7$72

Occorre prima di tutto calcolare la concentrazione molare della proteina, facendo una tabellina, considerando che dopo diluizione avremo 1, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2 e 0 mg/ml e rapportando tutto ad un cammino ottico di 1 cm

LOX]LRQH FRQFHQWUD]LRQH FRQFHQWUD]LRQH DVVRUELPHQWRQP DVVRUELPHQWRQPPRODUH PLFURPRODUH LQFP LQFPt.q 1/12500=8e-5 80 0.310 1.55160.8:1 0.8/12500=6.4e-5 64 0.285 1.42550.6:1 0.6/12500=4.8e-5 48 0.217 1.08880.4:1 0.4/12500=3.2e-5 32 0.156 0.77960.2:1 0.2/12500=1.6e-5 16 0.132 0.65890:1 (controllo) 0/12500=0 0 0.064 0.3184

Successivamente fare il grafico e linearizzare tra tutti i punti (evidenziati in grassetto): l'intercetta (0.344) rappresenta l'assorbimento del tampone, dovuto alla presenza di una molecola che assorbe a 280 nm. L'estinzione

La pendenza della retta è rappresentata da: 0.0156 1/micromolare 1/cm, ovvero 15600 1/M 1/cm(6(5&