Domande Qualità e sicurezza nei sistemi alimentari ed ecologia del microbiota umano

Domande Mora

Criteri molecolari utilizzati per studiare una comunità complessa

Per studiare una comunità microbica complessa posso usare diverse metodologie. Ad esempio, posso identificare un batterio tramite la tecnica senza isolamento con la quale estraggo il DNA di tutti i batteri del campione complesso e quindi amplifico tutti i 16s rRNA. A questo punto li dovrò separare tramite clonaggio in Escherichia coli oppure posso anche utilizzare altre tecniche come la DGGE o la TGGE. Dopo posso confrontare la sequenza del 16s rRNA con quelle in banca dati per associarla a una specifica specie. Posso anche utilizzare la tecnica con isolamento; in questo caso isolo su piastra il batterio che voglio identificare ed estrarrò poi il DNA solo di questo batterio, amplificherò il 16s e poi confronterò la sequenza del 16s con quelle in banca dati. Altre tecniche mi permettono di studiare le comunità microbiche complesse, come altre tecniche basate sulla PCR, ad esempio l'analisi dell'ITS; oppure posso sequenziare direttamente tutto il genoma.

Principi e fasi della tecnica DGGE

È una tecnica di analisi molecolare, meno sofisticata ma dà un buon grado di informazione sul numero di specie presenti nel sistema, da informazione sia sui microrganismi coltivati sia su quelli non coltivati. Questa analisi presuppone che dopo l’amplificazione dei geni si faccia elettroforesi su gel del gradiente di denaturazione. Deve essere accoppiata con PCR. Gli acidi nucleici sono sottoposti ad amplificazione utilizzando primer universali. Consente di separare i vari 16s in base alla differenza di sequenza. Se applico la temperatura la tecnica si chiama TDGGE.

• Si amplificano i 16S dell’intera comunità con primer universali; uno di questi primer ha in posizione 5’ una estensione di GC;
• A questo punto tutti i frammenti amplificati avranno la coda GC all’inizio;
• Si separano i frammenti in un’elettroforesi con un gel particolare; la parte iniziale del gel (presso i pozzetti) è normale; la parte finale invece è satura di urea e formammide, due composti fortemente denaturanti, che fanno separare le due eliche del DNA;
• Scendendo lungo il gel, attirati dal campo elettrico, i frammenti incontrano una concentrazione sempre maggiore di denaturante ed iniziano a denaturarsi;
• A basse concentrazioni di denaturante si iniziano a separare le coppie AT, debolmente legate tra loro e solo a concentrazioni maggiori le coppie GC;
• Al termine della corsa i frammenti sono tutti denaturati eccetto la coda GC che è estremamente resistente; le eliche denaturate si avvolgono su sé stesse bloccando l’avanzata del frammento. La separazione totale del frammento (eccetto la coda GC) avviene in posizione diversa lungo il gel a seconda della sequenza nucleotidica del frammento; una sequenza ricca in AT si bloccherà prima che una ricca in GC.

Spiegare cos'è la PCR

La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica che consente di ottenere rapidamente milioni di molecole identiche di DNA a partire da quantità estremamente ridotte di acido nucleico. Prerequisito fondamentale perché avvenga la replicazione è la conoscenza delle sequenze alle estremità della regione bersaglio. Nella reazione, infatti, sono coinvolti due oligonucleotidi a singolo filamento (i primers) complementari uno al 3’, l’altro all’estremità 5’ del segmento di DNA che si vuole amplificare e che servono da innesco per la DNA polimerasi. Questo enzima, la Taq DNA polimerasi, isolato per la prima volta nel 1988 da un batterio termoresistente (il Thermus acquaticus), è in grado di resistere alle elevate temperature a cui si soppone il DNA per la denaturazione della doppia elica. Oltre alla Taq polimerasi ed ai primers di interesse, è fondamentale la presenza di MgCl₂, cofattore indispensabile all’attività svolta dalla DNA polimerasi. La reazione segue diversi cicli:

• Denaturazione: la doppia elica del DNA stampo si scinde in due filamenti (T = 95°C);
• Appaiamento: i primer si appaiono alle sequenze nucleotidiche a singolo filamento ad essi complementari (T = 50°-70° C);
• Estensione: a partire dai primer la Taq sintetizza la nuova elica complementare al DNA stampo in direzione 5’-3’ (T = 68°-70° C).

Come possiamo sfruttare in laboratorio le conoscenze sul DNA

Le modalità sono molteplici:

• Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche;
• Quantificazione e visualizzazione spettrofotometrica;
• Visualizzazione per via elettroforetica;
• Identificazione tassonomica: %GC e riassociazione molecolare DNA/DNA;
• Amplificazioni di porzioni specifiche del cromosoma;
• Riconoscimento a livello di specie e ceppo in funzione dello studio molecolare delle porzioni amplificate.

Funzioni del microbiota intestinale

• Barriera contro proliferazione dei patogeni (evitano la colonizzazione degli stessi siti intestinali da altri M.O.);
• Regolazione della maturazione del sistema immunitario e sua modulazione;
• Produzione di vitamine (acido folico, K, vitamine del gruppo B);
• Regolazione della motilità intestinale;
• Parziale recupero di energia delle fibre alimentari;
• Prevenzione delle allergie (bifidobatteri e lattobacilli);
• Prevenzione delle malattie infiammatorie intestinali (gli acidi grassi di catena corta derivati dalla fermentazione saccarolitica sono in grado di).