Anteprima
Vedrai una selezione di 3 pagine su 6
Domande Qualità e sicurezza nei sistemi alimentari ed ecologia del microbiota umano Pag. 1 Domande Qualità e sicurezza nei sistemi alimentari ed ecologia del microbiota umano Pag. 2
Anteprima di 3 pagg. su 6.
Scarica il documento per vederlo tutto.
Scarica
Domande Qualità e sicurezza nei sistemi alimentari ed ecologia del microbiota umano Pag. 6
1 su 6
D/illustrazione/soddisfatti o rimborsati
Disdici quando
vuoi
Acquista con carta
o PayPal
Scarica i documenti
tutte le volte che vuoi
Estratto del documento

Tecnica di analisi molecolare

E una tecnica di analisi molecolare, meno sofisticata ma dà un buon grado di informazione sul numero di specie presenti nel sistema, da informazione sia sui microrganismi coltivati sia su quelli non coltivate. Questa analisi presuppone che dopo l’amplificazione dei geni si faccia elettroforesi su gel del gradiente di denaturazione. Deve essere accoppiata con PCR.

Gli acidi nucleici sono sottoposti ad amplificazione utilizzando primer universali. Consente di separare i vari 16s in base alla differenza di sequenza. Se applico la temperatura la tecnica si chiama TDGGE.

  1. Si amplificano i 16S dell’intera comunità con primer universali; uno di questi primer ha in posizione 5’ una estensione di GC;
  2. A questo punto tutti i frammenti amplificati avranno la coda GC all’inizio
  3. Si separano i frammenti in un’elettroforesi con un gel particolare; la parte iniziale del gel (presso i pozzetti) è normale; la parte finale invece è satura di urea e formammide,
duecomposti fortemente denaturanti, fanno separare le due eliche del DNA4. Scendendo lungo il gel, attirati dal campo elettrico, i frammenti incontrano una concentrazione sempre maggiore di denaturante ed iniziano a denaturarsi5. A basse concentrazioni di denaturante si iniziano a separare le coppie AT, debolmente legate tra loro e solo a concentrazioni maggiori le coppie GC6. Al termine della corsa i frammenti sono tutti denaturati eccetto la coda GC che è estremamente resistente; le eliche denaturate si avvolgono su sé stesse bloccando l'avanzata del frammento. La separazione totale del frammento (eccetto la coda GC) avviene in posizione diversa lungo il gel a seconda della sequenza nucleotidica del frammento; una sequenza ricca in AT si bloccherà prima che una ricca in GC3. Spiegare cos'è la PCR. La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica che consente di ottenere rapidamente milioni di molecole identiche di DNA a partire da quantità estremamente.ridotte di acidonucleico. Prerequisito fondamentale perché avvenga la replicazione è la conoscenza delle sequenze alle estremità della regione bersaglio. Nella reazione, infatti, sono coinvolti due oligonucleotidi a singolo filamento (i primers) complementari uno al 3', l'altra all'estremità 5' del segmento di DNA che si vuole amplificare e che servono da innesco per la DNA polimerasi. Questo enzima, la Taq DNA polimerasi, isolato per la prima volta nel 1988 da un batterio termoresistente (il Thermus acquaticus), è in grado di resistere alle elevate temperature a cui si soppone il DNA per la denaturazione della doppia elica. Oltre alla Taq polimerasi ed ai primers di interesse, è fondamentale la presenza di MgCl2, cofattore indispensabile all'attività svolta dalla DNA polimerasi. La reazione segue diversi cicli: - Denaturazione: la doppia elica del DNA stampo si scinde in due filamenti (T = 95°C); - Appaiamento: i primer si appaiono alle estremità del filamento stampo (T = 55-65°C); - Estensione: la DNA polimerasi sintetizza un nuovo filamento di DNA complementare al filamento stampo (T = 72°C). Questi cicli vengono ripetuti per un numero di volte variabile a seconda della quantità di DNA desiderata. Alla fine della reazione, si ottengono numerose copie del segmento di DNA di interesse.

sequenze nucleotidiche a singolo filamento ad essicomplementari (T = 50°-70° C); Estensione: a partire dai primer la Taq sintetizza la nuova elicacomplementare al DNA stampo in direzione 5’-3’ ( T = 68°-70° C).

4. Come possiamo sfruttare in laboratorio le conoscenze sul DNA

Le modalità sono molteplici:

  1. Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche
  2. Quantificazione e visualizzazione spettrofotometrica
  3. Visualizzazione per via elettroforetica
  4. Identificazione tassonomica: %GC e riassociazione molecolare DNA/DNA
  5. Amplificazioni di porzioni specifiche del cromosoma
  6. Riconoscimento a livello di specie e ceppo in funzione dello studio molecolare delle porzioni amplificate

5. Funzioni del microbiota intestinale

  • Barriera contro proliferazione dei patogeni (evitano la colonizzazione degli stessi siti intestinali da altri M.O)
  • Regolazione della maturazione del sistema immunitario e sua modulazione
  • Produzione di vit.( ac. Folico, K, vit del gruppo B)
  • Regolazione
Poi somministrato al ricevente per bocca o per via rettale. Viene usata contro infezioni intestinali potenzialmente letali.

7. Vantaggi e limiti dell'operone ribosomiale 16S per l'identificazione batterica

Vantaggi: il gene che codifica per il 16S rRNA è multicopia (perché di fondamentale importanza), è altamente conservato e quindi è considerato un ottimo orologio molecolare, in quanto ci permette di stabilire le distanze filogenetiche tra i diversi gruppi tassonomici batterici. Sono infatti presenti regioni più conservate, regioni semi-conservate e regioni variabili, e, a seconda di dove sono avvenute le mutazioni, si può calcolare il grado di parentela tra diversi microrganismi, cioè determinare a che punto dell'evoluzione due organismi si sono differenziati, poi potrà determinare la diversità tra organismi e identificare il batterio in base a sequenze specifiche; se due organismi hanno un 16s rRNA con più del 97% delle basi omologhe,

isolare un campione complesso posso utilizzare la tecnica con isolamento, cioè da un campione complesso isolo il mio batterio su piastra, successivamente lo faccio crescere in cultura e poi estraggo il DNA; a questo punto faccio l'amplificazione del 16s rRNA, lo sequenzio, e vado poi a confrontare la sequenza ottenuta con quella presente in banca dati identificando così il mio batterio. 9. Spiegare meccanismo di trasferimento genico Il meccanismo di trasferimento genico è un processo attraverso il quale i geni possono essere scambiati tra organismi. Esistono diversi modi in cui ciò può avvenire: - Trasferimento genico orizzontale: in questo caso, i geni possono essere trasferiti tra organismi della stessa generazione, senza che ci sia una relazione di parentela diretta. Questo può avvenire attraverso la trasformazione, la coniugazione o la trasduzione. - Trasferimento genico verticale: in questo caso, i geni vengono trasmessi dagli organismi genitori alla loro progenie, attraverso la riproduzione sessuale o asessuale. - Trasferimento genico laterale: in questo caso, i geni possono essere trasferiti tra organismi di specie diverse, attraverso il contatto diretto o l'assunzione di materiale genetico da parte di un organismo da parte di un altro. Questi meccanismi di trasferimento genico sono importanti per la diversità genetica e l'evoluzione degli organismi. Possono contribuire alla diffusione di caratteristiche vantaggiose, come la resistenza agli antibiotici, ma possono anche causare problemi, come la diffusione di geni patogeni.

Per trasferire il materiale genetico, come plasmidi o sequenze genomiche, i batteri hanno elaborato tre diversi meccanismi, chiamati: trasformazione, coniugazione e trasduzione.

  1. Trasformazione: Passaggio di frammenti di DNA libero, originati dalla lisi batterica, ad un batterio ricevente. Per poter ricevere materiale genetico, la cellula deve essere in una particolare condizione, detta "di competenza", in cui possiede sulla superficie cellulare delle proteine pronte a legare DNA esterno.
  2. Coniugazione: Trasferimento genico attraverso il contatto fisico tra due batteri (un donatore e una ricevente). Il protagonista è un plasmide coniugativo, che possiede informazioni per trasferire se stesso in un'altra cellula. Dopo il trasferimento all'interno della cellula ricevente avviene la replicazione dello stesso. In alcuni casi il plasmide può mobilitare se stesso ed un altro. Il plasmide trasferito può o non può integrarsi nel genoma.
  3. Trasduzione: Il trasferimento genico avviene attraverso un vettore, che può essere un batteriofago, un virus che infetta i batteri. Durante il ciclo di replicazione del batteriofago, possono verificarsi errori che portano all'inserimento di frammenti di DNA batterico nel capside del virus. Quando il virus infetta un altro batterio, il DNA batterico può essere trasferito e integrato nel genoma del batterio ricevente.

trasferimento è mediato da un virus dei batteri chiamato batteriofago. È caratterizzata dalle seguenti fasi:

  1. le fimbrie del batteriofago si legano alla parete del batterio, grazie a degli antirecettori che riconoscono specifici siti di adesione sulla parete cellulare;
  2. la piastra aderisce alla parete del batterio e viene liberato un enzima, detto lisozima, che va a ledere il peptidoglicano che costituisce la parete batterica;
  3. La coda si contrae ed il DNA del virus viene spinto all'interno del DNA batterico. A questo punto il DNA virale può seguire due vie, una prima chiamata ciclo litico ed una seconda detta ciclo lisogeno.

10. Criteri di identificazione tradizionale

Ci sono 2 criteri di riconoscimento dei microrganismi: i criteri di riconoscimento tradizionali e i criteri di riconoscimento innovativi. I criteri di riconoscimento tradizionale prevedono lo studio dell'habitat, del genotipo e del fenotipo; ovvero, si definiscono le specie batteriche come insieme di

ceppi isolati in habitat diversi e in tempi diversi che posseggono: - un'elevata similarità fenotipica, con almeno una delle proprietà distintive nei confronti delle altre specie (macromorfologia, micromorfologia, reazione di gram, metabolismo energetico, esigenze nutrizionali, esigenze colturali, pattern enzimatico, caratteristiche strutturali) - un'elevata omologia genetica (omologia DNA/DNA > 70%) (per ogni specie batterica descritta esiste un ceppo di riferimento mantenuto in collezioni internazionali) 11. Criteri di identificazione innovativa I criteri di identificazione innovativa sono tecniche di indagine genetica, basate sulla possibilità di amplificare regioni specifiche del cromosoma batterico in breve tempo, ad esempio attraverso la PCR. È il caso degli studi genetici e filogenetici: si valuta l'appartenenza alla specie in tempi ridotti ed in modo specifico, anche per un numero elevato di campioni isolati da identificare. Le caratteristiche fenotipiche.vengono studiate in un secondo tempo, solo sugli isolati di interesse, per permetterne il riconoscimento a livello di biotipo. 12. Attività cariogenica / Quale ruolo ha attività ureasica nell'ecologia del microbiota della cavità orale? Quali organismi possiedono questa attività? La carie è una patologia infettiva nella quale microrganismi normalmente non nocivi provocano danni. Nella nostra cavità orale le fonti di carbonio e le fonti di azoto devono essere bilanciate; dopo un pasto ricco di carboidrati (fonte di C disponibile), alcuni microrganismi possono andare incontro a limitazione di fonti di azoto, situazione che porta, attraverso una serie di processi, a un generale abbassamento di pH e di conseguenza alla demineralizzazione dello smalto dentale. Normalmente però questi microrganismi, grazie alle loro attività enzimatiche, riescono a sfruttare la componente consistente di urea che c'è nella saliva per alcalinizzare l'ambiente. Im.oche ostacolano l'insorgenza di carie

La carie dentale è una patologia che colpisce i denti a causa dell'azione dei batteri presenti nella bocca. Tuttavia, esistono alcuni fattori che possono ostacolare la sua insorgenza.

Una corretta igiene orale è fondamentale per prevenire la formazione di carie. Spazzolare i denti almeno due volte al giorno, utilizzare il filo interdentale e sciacquare la bocca con un collutorio antibatterico possono aiutare a rimuovere i residui di cibo e a ridurre la presenza di batteri.

Una dieta equilibrata può contribuire a prevenire la formazione di carie. Limitare il consumo di zuccheri e cibi ricchi di amido può ridurre la produzione di acidi da parte dei batteri presenti nella bocca, che sono responsabili della demineralizzazione dello smalto dentale.

Le visite regolari dal dentista sono fondamentali per individuare eventuali problemi dentali in fase precoce e per effettuare pulizie professionali. Il dentista può anche consigliare l'applicazione di sigillanti dentali, che creano una barriera protettiva sulle superfici dei denti più suscettibili alla formazione di carie.

Infine, evitare il fumo e limitare il consumo di alcol può contribuire a mantenere una buona salute orale e a prevenire la formazione di carie.

Dettagli
Publisher
beatrice.ianno
A.A. 2022-2023
6 pagine
SSD Scienze agrarie e veterinarie AGR/16 Microbiologia agraria
I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher beatrice.ianno di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Qualità e sicurezza microbiologica nei sistemi alimentari ed ecologia del microbiota umano e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Università degli Studi di Milano o del prof Mora Diego.