Domande aperte esame Biotecnologie microbiche

COLTURA BATCH, FED-BATCH E CONTINUA: PROCEDURE DI

GESTIONE E DIFFERENZE NEL CAMPO DI APPLICAZIONE.

La coltura batch è definita come un sistema chiuso in quando non vi è nessun ingresso di

substrato o fuoriuscita di brodocoltura. Il sistema si blocca solo quando sono stati consumati

tutti i nutriliti.

Durante il processo l’unico ingresso consentito è per acidi e basi per controllare il pH e

l’unico prelievo è per monitorare il processo.

Per questo motivo la formulazione del terreno deve essere specifica per il microrganismo, la

costante che definisce questo concetto è la Ks, ovvero la costante di saturazione del

substrato limitante o di affinità per i terreno.

Viene calcolata in laboratorio tramite varie prove fermentative in beuta con concentrazioni

diverse di terreno culturale, ma le stesse di microrganismi, ed andando a costruire una curva

dei valori ottenuti.

Ha come unita di misura i mg/L e corrisponde alla quantità di substrato limitante in cui la

velocita di crescita è ½ della massima possibile.

Il processo in coltura continua termina quando le risorse nutritive si esauriscono o quando si

raggiunge un determinato tempo di coltura.

Questa tecnica presenta però diverse svantaggi, seppur sia economica e con un minor rischio

di contaminazione, quali sicuramente la gestione dei tempi morti, per diversi motivi:

1) Riempimento

2) Fermentazione

3) Scarico

4) Pulizia

Di questi solamente la seconda è la fase produttiva vera e propria, le altre 3 vanno a

minimizzare il guadagno possibile nello stesso periodo di tempo, per questo motivo nasce a

coltura continua

La coltura continua è una coltura aperta dove si ha un continuo flusso di ingresso di

substrato e un continuo flusso in uscita di brodocoltura caratterizzata da cellule, metaboliti e

residuo. La coltura continua parte inizialmente come coltura batch, quando entra in fase

esponenziale iniziano ad attivarsi il flusso in ingresso e il flusso in uscita.

Una caratteristica fondamentale è lo STEADY STATE che non corrisponde alla fase

stazionaria della coltura batch ma è una condizione di equilibrio dove ciò che cresce è

uguale a ciò che esce, ovvero quanti microrganismi si sviluppano tanti ne vengono prelevati.

È una condizione che deve essere necessariamente raggiunta nella coltura continua e deve

essere mantenuta per più tempo possibile. Per raggiungere lo steady state è necessario che il

tempo di residenza delle cellule sia maggiore di D (Tr>D) per evitare che le cellule vengano

dilavate via prima che possano crescere. 11

Esistono 2 tipologie di colture continue:

• Chemostato, con un fermentatore centrale, due pompe, una in ingresso e una in

uscita, che devono lavorare in sincrono.

Troviamo anche un serbatoio di alimentazione, da cui si pompa il substrato, e un

serbatoio in cui si veicola la cultura in uscita.

Il substrato non è quindi mai in eccesso, ma si trova nel fermentatore a

concentrazioni più o meno ridotte, che influenzano quindi la µ.

Infatti, la concentrazione del S limitante influenza la velocità di crescita: è un sistema

a controllo esterno della velocità di sviluppo, aumentando il flusso aumento la

concentrazione di S e la velocità di crescita.

Il microorganismo, tuttavia, non si sviluppa mai a µ-max.

• Turbidostato, con il solito fermentatore centrale, ma vediamo una sola pompa in

ingresso.

Dotato sempre di un serbatoio di alimentazione e anche un sistema per il recupero

coltura. Il substrato è in eccesso e il microorganismo cresce a µ-max.

Quando la brodocoltura arriva a certa torbidità (misurata in OD da una cellula

fotoelettrica di controllo) un sistema si attiva, scaricando 1/3 del volume

fermentatore.

Lo scarico di brodocoltura è attentamente quantificato, e contemporaneamente si

pompa la stessa quantità di substrato dal serbatoio di alimentazione.

La cellula fotoelettrica fa sì che la torbidità della coltura resti costante (controllo

interno). Lavorando con S in eccesso, il controllo è interno, poiché non c’è S

limitante.

Nonostante con questa tipologia di coltura venga massimizzata la produttività, presenta

delle criticità, tra cui:

• Inquinamento, ad esempio causato da guarnizioni guaste o simili

• Instabilità genetica, modifica spontanea dell’info genetica del microorganismo

coltivato. Es. i plasmidi possono essere persi, e se stiamo producendo un composto la

cui informazione sul plasmide perdiamo la produzione che ci interessa, con un calo

molto veloce di P. 12

La coltura fed-batch è un sistema aperto in ingresso senza scarico continuo. Inizia come una

classica coltura batch con volume V0, quando il microrganismo entra in fase esponenziale

allora inizia il feed con inserimento del terreno colturale e il volume aumenta oltre V0, non

c’è prelievo ma coltura è continuamente alimentata senza alcun tipo di prelievo. L’unica

limitazione è il livello del reattore, ovvero quando si arriva a Vmax, ovvero il massimo

riempimento, il reattore viene scaricato.

Il feed può essere costituito dal solo substrato di interesse (singoli nutriliti) o dal terreno

colturale completo. Quest’ultimo si utilizza più frequentemente per evitare la presenza di

nutriliti limitanti e sbilanciamento del terreno.

Viene usata per:

• Evitare l’inibizione da substrato, come nel caso della produzione di lievito da pane.

• Rimuovere l’inibizione da prodotto (come da antibiotici o metaboliti tossici in

generale per la cellula). Esempio: oltre i 150 mg/L la penicillina inizia a dare fastidio

al microorganismo, che non si sviluppa come dovrebbe. Pertanto, si aggiunge del

terreno colturale fresco, si aggiunge volume, e la concentrazione del prodotto risulta

diluita. Le aggiunte di substrato a step permettono di diluire i metaboliti tossici nel

terreno colturale e mantenere alta la produzione del metabolita stesso da parte del

microorganismo.

Il principale difetto della coltura batch è la grande quantità di tempi morti che possono

essere ridotti utilizzando la coltura continua.

La coltura batch può essere versatile, può essere interrotta in base a ciò che si vuole

ottenere.

La fermentazione viene fermata prima di poter iniziare nella fase di decelerazione, in questo

caso si ha la produzione di biomassa e prodotti semplici che arrivano direttamente dalla

produzione primaria

La produzione di prodotti che derivano indirettamente dal metabolismo primario, la

fermentazione viene bloccata prima che si possa arrivare al prodotto finale durante il

metabolismo primario

La produzione di prodotti provenienti dalla produzione secondaria, questo può essere fatto

mandando avanti la fermentazione durante la fase di decelerazione e stazionaria in cui il

substrato è limitante e si possono sviluppare metaboliti secondari come ad esempio

antibiotici.

La coltura continua trova applicazione in una vasta gamma di settori, grazie alla sua

capacità di mantenere una produzione costante e ottimizzata nel tempo. Un campo di grande

rilievo è quello della produzione industriale di metaboliti primari, come bioetanolo, acido

lattico e altri composti biochimici utilizzati in ambito energetico e chimico. La possibilità di

operare in modo continuo permette di ottenere rese elevate e di minimizzare i costi

operativi, risultando ideale per soddisfare le esigenze di mercati su larga scala.

Un altro importante utilizzo si trova nel trattamento delle acque reflue e nella gestione di

processi di bioremediation. Qui, la coltura continua consente di mantenere attive

popolazioni microbiche capaci di degradare composti organici o rimuovere sostanze

inquinanti, garantendo una depurazione efficace e sostenibile. 13

In ambito biotecnologico e farmaceutico, questa tecnica è utilizzata per la produzione di

biomassa microbica o cellulare, necessaria come materia prima per la sintesi di vaccini,

enzimi e proteine terapeutiche.

La coltura continua è particolarmente apprezzata per la sua capacità di mantenere le cellule

in una fase di crescita costante, massimizzando la produttività.

Infine, nel settore alimentare, la coltura continua è impiegata nella produzione di additivi e

fermentati, come aminoacidi, vitamine o probiotici. Questi processi beneficiano della

possibilità di operare su grandi volumi con alta efficienza e continuità, garantendo standard

qualitativi elevati per i prodotti finali.

Nella coltura fed-batch è possibile avere una fase di sviluppo dove si ha la crescita cellulare

e una fase biosintetica dove viene fornito il substrato necessario alla formazione di un

determinato prodotto, in sostanza modificando il feed è possibile shiftare il metabolismo a

piacimento. Questo mi permette di poter sviluppare dei prodotti che non sono associati allo

sviluppo microbico. Il feed può essere fornito diluito creando una forte variazione di volume

oppure concentrato creando una minima variazione di volume e permettendo un

prolungamento della coltura.

La coltura fed-batch viene utilizzata principalmente per evitare l’inibizione da substrato e

l’inibizione da prodotto. Per quanto riguarda l’inibizione da substrato un esempio è la

produzione del lievito da pane, si sa che Saccharomyces cerevisiae è un microrganismo che

ha sia metabolismo fermentativo che ossidativo. È importante controllare la concentrazione

di substrato in quanto i due metabolismi sono regolati dall’effetto crabtree: se c’è ossigeno e

c’è eccesso di substrato allora il lievito fermenta, se c’è substrato limitante allora il

microrganismo entra nel metabolismo ossidativo e si ha formazione di tante cellule. Grazie

alla coltura fed-batch evito l’instaurarsi del metabolismo fermentativo aggiungendo

substrato tenendo conto della velocità di consumo del substrato stesso. Per quanto riguarda

l’inibizione da prodotto invece come esempio vi è la produzione di penicillina, quando il

microrganismo ne produce tanta questa può diventare tossica nei suoi confronti; quindi, con

la continua aggiunta di substrato riesco a diluire e quindi ad abbassare la concentrazione di

questo prodotto evitando che arrivi alla sua concentrazione tossica.

Questi fenomeni non possono essere evitati nella coltura batch in quanto il substrato è

aggiunto tutto subito, mentre nella continua non è possibile in quanto è difficile gestire i

flussi ed è necessario un controllo rigoroso della portata. 14

PROCESSO DI PRODUZIONE DI ACIDO CITRICO: COLTURA

STAZIONARIA O SOMMERSA

Storicamente, le prime produzioni sono state messe appunto tramite l’utilizzo di Aspergillus

niger e solo in tempi piu recenti e stato sviluppato i