Domande aperte di Biologia molecolare

Replicazione del DNA e controllo dell'accensione dell'origine di replicazione

I filamenti del DNA vengono separati dall'elicasi; a questo punto i singoli filamenti vengono tenuti aperti dalle proteine SSB. Successivamente, si attacca la primasi sul singolo filamento che sintetizza una breve sequenza di RNA primer necessario ad innescare l'attività della DNA polimerasi III. La DNA polimerasi è in grado di avanzare solo in direzione 5'-3', quindi sulla rispettiva forcella replicativa su un filamento la replicazione sarà continua, mentre su quello in direzione 3'-5' la DNA polimerasi sintetizzerà sempre in direzione 5'-3', creando tanti piccoli frammenti chiamati frammenti di Okazaki che vengono poi uniti tra loro dalla DNA ligasi.

Le proteine coinvolte in ciascuna tappa della replicazione del DNA sono:

1. Elicasi - separa i filamenti del DNA
2. Proteine SSB - tengono aperti i singoli filamenti
3. Primasi - sintetizza gli RNA primer
4. DNA polimerasi III - sintetizza il nuovo filamento di DNA
5. DNA ligasi - unisce i frammenti di Okazaki

L'accensione dell'origine di replicazione viene controllata inizialmente dalla topoisomerasi.

hanno il compito di svolgere i superavvolgimenti del DNArendendolo più accessibile.

Una volta linearizzato le proteine ORI si attaccano aspecifici siti di replicazione e permettono all’elicasi di separare il DNA in due filamenti;su questi filamenti si attaccano le proteine SSB in grado di stabilizzare il singolofilamento ed evitare che si richiuda.

A questo punto la primasi sintetizza una breve sequenza di RNA primer complementare al sito di inizio della trascrizione così da favorire l’attaccamento della DNA polimerasi ad esso per iniziare la replicazione del DNA vera e propria.

La DNA polimerasi può polimerizzare nucleotidi solamente correndo sul filamento stampo in direzione 5’-3’ per cui si formano due forcelle replicative in cui per entrambe su di un filamento l’andamento sarà continuo, mentre sul filamento 3’-5’ si creeranno vari frammenti di DNA chiamati frammenti di Okazaki che verranno poi successivamente uniti.

Dalla DNA ligasi, che rimuoverà anche l'RNA primer del sito di origine della replicazione.

18. Descrivi il replicone

Durante la replicazione del DNA il doppio filamento viene aperto in uno o più specifici siti di inizio di replicazione creando due forcelle replicative, la replicazione continua in entrambi i sensi fino a quando non si arriva ad altri specifici punti nei quali si interrompe la replicazione. Il tratto di DNA compreso tra i due punti di arresto della replicazione viene definito replicone.

19. Quali sono i principali enzimi del replisoma, descrivone la funzione

I principali enzimi del replisoma sono: topoisomerasi, proteine ORC, elicasi, proteine SSC, primasi, DNA polimerasi e DNA ligasi. Le topoisomerasi sono in grado di svolgere i superavvolgimenti del DNA; le proteine ORC si attaccano al sito di inizio di replicazione e aumentano l'affinità dell'elicasi al DNA; l'elicasi separa i filamenti del DNA stampo; le proteine SSC stabilizzano i

singoli filamenti evitandone il riappaiamento; la prima si sintetizza una iniziale breve sequenza di RNA primer che dà il via alla replicazione; la DNA polimerasi sintetizza il nuovo DNA seguendo il filamento stampo solamente in direzione 3’-5’; e infine la DNA ligasi rimuove gli RNA primer sostituendoli con DNA e lega tra loro i frammenti di Okazaki creati in direzione 3’-5’.

20. che cosa si intende per rimodellamento dellacromatina? descrivi come avviene

Il rimodellamento della cromatina è un processo che tramite il consumo di ATP è in grado di rimodellare fisicamente la cromatina spostando i nucleosomi sul DNA oppure interagendo nel legame tra il DNA e le proteine che compongono la fibra cromatinica.

Il rimodellamento della cromatina può avvenire tramite la sostituzione di proteine dell’ottamero istonico che compone il nucleosoma con altre varianti proteiche che ne modificano l’affinità con il DNA; possono avvenire tramite

scivolamenti istonici sul DNA; tramite eliminazioni di interi istoni; o anche per mezzo della formazione di ansedi DNA nell'impacchettamento del nucleosoma.

21. che cos'è e perché è importante il codice istonico

Gli istoni sono ottameri di proteine la cui funzione principale è la compattazione del DNA; il DNA si avvolge attorno all'istone e quest'ultimo possiede delle code aventi specifici siti di legame: siti di metilazione, siti di acetilazione, siti di fosforilazione e siti di ubiquitinazione. Le interazioni con i siti presenti sulle code istoniche rendono più o meno accessibile il DNA, controllando di fatto l'espressione dei geni in esso contenuti.

Il codice istonico è il meccanismo di riconoscimento e di risposta con il quale vengono letti i vari siti delle code istoniche cui segue un silenziamento o una attivazione genica. L'importanza del codice istonico è quindi che esso rappresenta il linguaggio

del DNA contenente l'errore, l'enzima DNA polimerasi riempie il vuoto con i nucleotidi corretti e infine l'enzima ligasi sigilla il nuovo frammento di DNA. Le mutazioni che alterano il mismatch repair possono causare diverse malattie. Ad esempio, la sindrome di Lynch è una malattia ereditaria caratterizzata da un aumento del rischio di sviluppare tumori del colon, dell'endometrio e di altri organi. Questa sindrome è causata da mutazioni nei geni che codificano per le proteine coinvolte nel mismatch repair. Senza un corretto funzionamento di questo meccanismo di riparazione, gli errori di appaiamento nel DNA non vengono corretti e possono accumularsi, aumentando il rischio di mutazioni e di sviluppare tumori. Inoltre, alterazioni nel mismatch repair possono essere coinvolte anche in altre malattie, come il cancro ovarico ereditario non poliposico (HNPCC) e alcune forme di cancro del colon-retto sporadico. La comprensione dei meccanismi di riparazione del DNA, come il mismatch repair, è fondamentale per lo studio delle malattie genetiche e per lo sviluppo di terapie mirate.formazione di un filamento di RNA che funge da primer per l'inizio della sintesi del nuovo filamento di DNA. Nei batteri, questo primer è sintetizzato dall'enzima primasi, mentre negli eucarioti è sintetizzato dall'enzima primasi associato alla DNA polimerasi α. Inoltre, nei batteri il filamento di RNA viene rimosso dall'enzima RNasi H, mentre negli eucarioti viene rimosso dall'enzima FEN1. Un'altra differenza riguarda la correzione degli errori di mismatch. Nei batteri, il meccanismo di mismatch repair coinvolge gli enzimi MutS, MutL e MutH, che riconoscono e rimuovono il filamento di DNA errato. Negli eucarioti, invece, il meccanismo di mismatch repair coinvolge gli enzimi MSH2, MSH6, MLH1 e PMS2. Infine, nei batteri è presente un meccanismo di riparazione del DNA chiamato escissione di nucleotidi, che rimuove e sostituisce una porzione di DNA danneggiato. Negli eucarioti, questo meccanismo è sostituito dalla riparazione per escissione di base, che rimuove e sostituisce una singola base danneggiata. In conclusione, i meccanismi di riparazione del DNA sono essenziali per mantenere l'integrità del genoma e prevenire l'accumulo di mutazioni. Nonostante alcune differenze tra batteri ed eucarioti, entrambi gli organismi possiedono sistemi di riparazione altamente efficienti che contribuiscono alla stabilità genetica.coupled repair sono due vie di riparazione del DNA negli eucarioti. Global Genome Repair (GGR) è responsabile del riconoscimento e della riparazione degli errori nel genoma intero. Questo meccanismo coinvolge una serie di proteine che scansionano il DNA alla ricerca di lesioni o distorsioni nella struttura del filamento. Una volta individuato un danno, un complesso proteico si forma attorno all'area danneggiata e rimuove il segmento di DNA contenente l'errore. Successivamente, la DNA polimerasi e la ligasi intervengono per ripristinare la sequenza corretta. Transcription coupled repair (TCR) è un meccanismo di riparazione specifico per le regioni trascritte dalla RNA polimerasi. Durante la trascrizione, l'RNA polimerasi può incontrare ostacoli nel DNA, come lesioni o distorsioni. In questo caso, una proteina chiamata CSB (Cockayne syndrome group B) riconosce il danno e recluta altre proteine per avviare il processo di riparazione. Il segmento di DNA danneggiato viene rimosso e sostituito con un frammento di DNA nuovo e corretto. Entrambi i meccanismi di riparazione sono essenziali per mantenere l'integrità del genoma e prevenire l'accumulo di mutazioni che potrebbero portare a malattie o disfunzioni cellulari.

Coupled repair sono meccanismi di riparazione di errori del DNA nella replicazione facenti parte dei meccanismi di riparazione per escissione dei nucleotidi. Il Global Genome repair controlla l'intero genoma alla ricerca di lesioni, mentre il Transcription coupled repair controlla solo le regioni trascritte dalla RNA polimerasi e localizza la lesione in seguito all'arresto di essa. Una volta riconosciuti gli errori, questi due meccanismi seguono la medesima via di riparazione che consiste nell'apertura del doppio filamento, nella stabilizzazione dei singoli filamenti separati, nella rimozione di un tratto di 60 nucleotidi sul filamento contenente l'errore e nella nuova sintesi del tratto da sostituire.

25. Descrivi il meccanismo per escissione delle basi e quali errori ripara

Il meccanismo per escissione delle basi è un meccanismo di riparazione del DNA che avviene durante la replicazione del DNA e consiste nel riconoscimento e sostituzione di una base azotata danneggiata.

1. Per esempio per la perdita di un gruppo funzionale. Il meccanismo consiste nel riconoscimento del danno da parte di una DNA glicosilasiche interagisce con la base azotata danneggiata rimuovendola scindendo il legame tra di essa e lo zucchero; a questo punto viene eliminato anche lo zucchero ed una DNApolimerasi attacca l'intero nucleotide mancante.
2. Quali sono le attività biochimiche relate alla ricombinazione della proteina RecA? La proteina RecA è una macroproteina che interviene durante la ricombinazione ed ha il compito di riconoscere le porzioni di DNA omologhe leggendo le sequenze nucleotidiche uguali, e di scambiare i filamenti.
3. Considera una giunzione di Holliday? Quali sono i due modi in cui può essere risolta per generare due doppie eliche indipendenti? Prova a disegnare il meccanismo. Una giunzione di Holliday è la struttura incrociata che si forma quando due filamenti di DNA a doppia elica omologhi stanno ricombinando. Nella giunzione di Holliday

si lega nella parte centrale ed è in gr