Domande Aperte Biologia molecolare

DOMANDE APERTE DI BIOLOGIA MOLECOLARE

1. Hai isolato da E.coli un plasmide di 10.500 pb (superavvolto, cccDNA). Il plasmide contiene un unico sito di riconoscimento per EcoRI, un enzima di restrizione. Gli enzimi di restrizione riconoscono una sequenza specifica e tagliano entrambi i filamenti del DNA a livello di quella sequenza.

Hai brevemente incubato il cccDNA a 37°C in quattro reazioni diverse contenenti i componenti indicati sotto. Poi hai fatto correre la reazione in un gel di agarosio e visualizzato il DNA usando il bromuro di etidio e la luce UV. Le miscele di reazione contenevano un tampone adeguato e l'ATP, quando era necessario. In figura è mostrato un gel di agarosio con quattro canali dove sono rappresentati i possibili prodotti. Per ogni reazione, indica quale canale contiene i prodotti che ti aspetteresti di vedere sul tuo gel di agarosio e motiva la scelta con una spiegazione.

A seguito della reazione con solo plasmide tale e quale e tampone...

aspetterei di ottenere su gel di agarosio una situazione analoga a quella nel canale uno, nel quale il plasmide è superavvolto, occupa un minor ingombro sterico, per cui si trova verso il basso del gel. A seguito della reazione di digestione enzimatica con EcoRI, il quale scindendo il plasmide in un singolo punto lo linearizza, mi aspetterei di osservare una situazione simile a quella nel canale tre dove il plasmide linearizzato e che occupa quindi un maggior ingombro sterico rispetto al plasmide superavvolto si trova più in alto, riscontrando maggiore difficoltà durante la migrazione. A seguito della reazione di digestione parziale con DNAsi la quale è in grado di tagliare il plasmide in varie parti mi aspetterei di osservare una situazione simile a quella del canale due, con tante bande corrispondenti alle diverse porzioni del plasmide ottenute in seguito ai tagli subiti a carico della DNAsi; le porzioni più lunghe si troveranno più in alto mentre quelle più corte si troveranno più in basso.

più corte e meno ingombrantiverso il basso. Infine, la topoisomerasi è in grado di svolgere ilsuperavvolgimento del plasmide, conferendogli quindi un maggioringombro sterico, maggiore anche di quello occupato dallo stessoplasmide ma linearizzato, per cui mi aspetterei di osservare unasituazione simile a quella del canale 4 in cui la migrazione, essendofortemente contrastata dall’ingombro sterico del plasmide interorilassato, lo trattiene in alto.

2.Spiega come si forma l'appaiamento diHoogsteen e in quale strutture lo si ritrova

L’appaiamento di Hoogsteen è una particolare struttura alternativadel DNA che si ritrova in brevi tratti di doppia elica di circa 20nucleotidi dove, in tale tratto, si trovano solo purine su un filamentoe solo pirimidine sull’altro. L’appaiamento di Hoogsteen consiste nelformarsi di un terzo filamento alloggiato nel solco maggiore delladoppia elica contenente le stesse pirimidine del filamento dal latoopposto ma

in direzione invertita, (se il primo filamento dipirimidine è in direzione 3'-5' il secondo sarà in direzione 5'-3' e viceversa). Le purine che si trovano al centro sono in grado di formare legami a idrogeno con entrambe le pirimidine dei filamenti contrapposti, formando quindi un breve tratto di DNA a tripla elica.

3. Descrivi struttura e funzione delle molecole di RNA evidenziandone la relazione

L'RNA è un acido nucleico che differisce funzionalmente e strutturalmente dal DNA. Strutturalmente: lo zucchero pentoso dell'RNA è il ribosio e non il desossiribosio, contenente quindi un gruppo ossidrile sul carbonio 3; l'RNA si trova principalmente a singola elica e non a doppia elica; ed infine la purina timina, sull'RNA viene sostituita da un'altra purina, l'uracile, che differisce solamente per la mancanza di un gruppo metilico sul carbonio 5 della purina. L'RNA viene sintetizzato sullo stampo di un

Il filamento di DNA è in grado di attraversare il nucleo per arrivare nel citoplasma dove svolge gran parte delle sue funzioni. Le funzioni dell'RNA sono: di codifica per la traduzione in proteine; di struttura, per esempio, l'RNA ribosomiale; di regolazione; e di catalisi enzimatica.

I centromeri sono la porzione di cromosoma situata tra il braccio q e p, sulla quale si aggrega il complesso proteico del cinetocore, al quale si attaccano i microtubuli provenienti dal fuso mitotico al fine di una corretta separazione dei cromosomi fratelli durante la divisione cellulare. La sezione di DNA che costituisce il centromero è composta da eterocromatina contenente brevi sequenze di basi azotate ricche in AT ripetute in tandem. La grandezza e composizione dei centromeri è differente tra specie differenti, conservando tuttavia somiglianze. Difetti genetici a livello dei centromeri provocano difetti della segregazione cromosomica.

indivisione cellulare causando aneuploidie.

5. Che cosa sono le proteine SMC. Descrivine la struttura ed il loro ruolo?

Le proteine SMC sono proteine impiegate nel mantenimento strutturale dei cromosomi durante la replicazione cellulare. Le proteine SMC sono composte da due domini terminali uno N ed uno C collegati tra loro da una lunga struttura ad elica; queste proteine si combinano formando dimeri che creano siti per l'idrolisi di ATP impiegato per la loro interazione con il DNA. Le SMC formano una specie di cerniera in grado di compattare e rafforzare la struttura dei cromosomi portando ad un superavvolgimento positivo del DNA.

6. Come è organizzata la fibra cromatinica? Quali livelli di organizzazione conosci?

La fibra cromatinica è un livello di organizzazione del DNA che permette la compattazione di esso rendendolo fino a 50000 volte più corto rispetto al DNA lineare rilassato. La fibra cromatinica si serve di diverse proteine in grado di interagire con il DNA, tra cui

leproteine istoniche; le proteine istoniche sono 5 che si combinano traloro formano un ottamero, due coppie di proteine H2A e H2B e duecoppie di H3 e H4, sul quale si avvolge il DNA compiendo due giri,quest’ultimo viene poi bloccato e tenuto in posizione dalla proteinaH1. Il livello di organizzazione che consiste nel DNA ripiegato sugliistoni prende il nome di nucleosoma; questa fibra a sua volta vieneulteriormente organizzata in una struttura a zig-zag da 30nm, lafibra cromatinica. La fibra cromatinica può venire ulteriormentecompattata nella struttura cromosomica per mezzo delle proteineSMC che sono in grado di formare una specie di cernieramantenendo stabili i cromosomi.

Sequenze ripetute: come sono state scoperte,descrivi le diverse classiLe sequenze ripetute sono caratteristiche del DNA eucariote econsistono nella ripetizione di una determinata sequenza all’internodel genoma. Le sequenze ripetute occupano la metà del genomaumano e possono variare sia

Per lunghezza delle paia di basi che contiene l'unità ripetente sia per il numero di volte che la sequenza viene ripetuta. Sono state scoperte studiando la riassociazione del DNA e si è notato che negli eucarioti comparivano picchi insoliti che si è poi dimostrato essere DNA con la stessa sequenza. Le classi delle sequenze ripetute sono: sequenze altamente ripetute (più di 100000 ripetizioni), sequenze mediamente ripetute (da 100000 a 1000 ripetizioni), e sequenze uniche (meno di 1000 ripetizioni). Le sequenze altamente ripetute prendono il nome di DNA satellite che non è codificante e presenta variazioni durante l'evoluzione, quindi, è caratteristico di ogni specie, per questo motivo viene utilizzato negli studi evoluzionistici e tassonomici.

Come viene classificato il DNA Eucariotico?

Il DNA eucariotico viene classificato analizzando le sequenze ripetute. Le sequenze ripetute sono sequenze di varie dimensioni che vengono ripetute diverse volte.

Si dividono in sequenze: altamente ripetute come il DNA satellite (più di 100000 ripetizioni) e non codificanti, sequenze mediamente ripetute (dalle 100000 alle 1000 volte), e sequenze uniche (ripetute meno di 1000 volte) solitamente codificanti. Le sequenze ripetute compongono gran parte del genoma eucariotico, nell'uomo il 50% circa, e si sono mutate durante l'evoluzione sia in lunghezza dell'unità ripetente che in numero di ripetizioni. Le sequenze ripetute risultano essere uniche per ogni specie per questo motivo vengono utilizzate per classificare il DNA eucariotico e quindi anche per condurre studi evoluzionistici e tassonomici. 9. Descrivi quali sono le principali proteine istoniche e quale ruolo hanno nel nucleosoma. Basandosi su quanto hai studiato spiega quali sono gli istoni più conservati. Infine spiega perché sono importanti le code istoniche e cos'è il CODICE ISTONICO. Le principali proteine istoniche sono 5 di cui 4 fanno parte del nucleosoma: H2A, H2B, H3 e H4. Queste proteine si avvolgono attorno al DNA formando una struttura a forma di disco chiamata nucleosoma. Il nucleosoma è l'unità fondamentale della cromatina e svolge un ruolo cruciale nell'organizzazione del DNA all'interno del nucleo. Gli istoni sono altamente conservati evolutivamente, il che significa che le loro sequenze aminoacidiche sono molto simili tra diverse specie. Questa conservazione suggerisce che gli istoni svolgano un ruolo essenziale nella struttura e nella funzione del DNA. Le code istoniche sono le estremità delle proteine istoniche che sporgono dal nucleosoma. Queste code possono essere modificate da processi come l'acetilazione, la metilazione e la fosforilazione. Queste modificazioni delle code istoniche possono influenzare l'accesso al DNA e regolare l'espressione genica. Il codice istonico si riferisce alla combinazione specifica di modificazioni delle code istoniche che può influenzare l'attività dei geni. In sintesi, le proteine istoniche svolgono un ruolo cruciale nell'organizzazione del DNA all'interno del nucleo e le loro code istoniche possono influenzare l'accesso al DNA e regolare l'espressione genica.

Parte dell'ottamero istonico mentre una, la proteina H1 serve come una sorta di "bloccante" del DNA dopo aver compiuto due giri attorno all'istone. L'ottamero istonico è formato da due coppie di proteine H2A e H2B e da due coppie di proteine H3 e H4. Le proteine istoniche e quindi i geni che le codificano sono altamente conservati, in particolar modo le proteine H4 e H2B; mentre le proteine H3 e H2A presentano qualche piccola variante dell'ordine di pochi amminoacidi della catena proteica che conferiscono particolari funzionalità ad essa, in genere rendendo più accessibile il DNA legato agli istoni. Le code degli istoni sono filamenti proteici facenti parte delle proteine istoniche che si estendono dal core dell'istone e possiedono vari siti necessari al controllo dell'espressione genica rendendo più o meno accessibile il DNA tra cui i siti di metilazione, acetilazione, fosforilazione e ubiquitinazione. Con codice istonico

Si intende il meccanismo di riconoscimento e risposta con il quale vengono letti i vari siti delle code istoniche cui segue un silenziamento o una attivazione del gene; il codice istonico è quindi ciò che sta alla base dell'epigenetica.

Gli pseudogeni sono geni non funzionali simili a geni che codificano per proteine funzionali che differiscono per piccole cose come l'assenza di promotori o l'anticipata presenza di codoni di stop. Gli pseudogeni possono originarsi a seguito di retrotrasposizione o per duplicazione.

Le polimerasi che hanno la proprietà di svolgere proofreading sono le DNA polimerasi replicative. Il proofreading consiste nel meccanismo di correzione degli errori di replicazione del DNA, in cui la polimerasi riconosce e rimuove eventuali basi appaiate in modo errato durante la sintesi del nuovo filamento di DNA.