Domande aperte di Biologia molecolare

Le polimerasi che hanno la proprietà di svolgere proofreading sono le DNA polimerasi replicative.

Il proofreading è un'attività di correzione di errori di appaiamento durante la replicazione del DNA che consiste nella rimozione del singolo nucleotide appaiato erroneamente da parte della DNA polimerasi che corregge l'errore istantaneamente; questo meccanismo è in grado di diminuire il tasso di errore di 100-1000 volte.

Cosa si intende per processività della DNA polimerasi? Indica la processività dei diversi enzimi

Per processività della DNA polimerasi si intende la lunghezza media del filamento sintetizzato, ovvero il numero di nucleotidi che l'enzima è in grado di appaiare dopo essersi legato al primer. La processività delle varie DNA polimerasi può variare molto, la più alta è quella DNA polimerasi III che è di circa 5000000 nucleotidi.

Spiega in cosa consiste l'esperimento

"replica plating"

L'esperimento "replica plating" è stato utilizzato per studiare l'origine di replicazione del DNA di E. coli. Il genoma di E. coli contiene una sola origine di replicazione quindi per studiarla si è tagliato il genoma con enzimi di restrizione e sono stati impiantati i vari frammenti in plasmidi che non contenevano nessuna origine di replicazione, ma possedevano un gene resistente ad un antibiotico. L'esperimento consiste nel trasferire tutte le diverse colonie contenenti ognuna un frammento di genoma di E. coli differente in un terreno di coltura contenente l'antibiotico e dopo incubazione, studiare le colonie cresciute. Le uniche colonie cresciute contengono quindi un frammento di genoma di E. coli nel quale si trova l'origine di replicazione. Analizzando questi frammenti si può quindi risalire a quale sia la sequenza di innesco per la replicazione di E. coli.

14. Descrivi il saggio di complementazione e...

complementazione genetica è una metodica utilizzata per comprendere e studiare le proteine coinvolte nella replicazione del DNA. Questo saggio prevede la purificazione dei mutanti delle proteine del replisoma utilizzando batteriofagi che richiedono il replisoma ospite di E. coli per replicare il proprio DNA. Sono stati creati ceppi mutanti che possono crescere solo a 37°C, mentre quelli normali possono crescere sia a 37°C che a 42°C. I ceppi mutanti vengono isolati utilizzando la tecnica di replica plating e successivamente vengono aggiunti substrati necessari per identificare i possibili motivi di blocco della replicazione. I risultati ottenuti hanno permesso di comprendere che le proteine che si denaturano a 42°C e che bloccano la replicazione sono le proteine del replisoma.complementazione è una metodica che è stata utilizzata per comprendere e studiare le proteine del replisoma. Il saggio di complementazione consiste nel purificare i mutanti delle proteine del replisoma mediante l'uso di batteriofagi che necessitano di utilizzare il replisoma ospite di E. coli per replicare il proprio DNA; sono poi stati creati ceppi mutanti in grado di crescere solo a 37°C, mentre quelli normali sia a 37°C che a 42°C. I ceppi mutati vengono isolati tramite la tecnica di replica plating e successivamente addizionando substrati necessari ai vari possibili motivi del blocco della replicazione. I risultati hanno permesso di comprendere che le proteine che si denaturavano a 42°C e che bloccavano la replicazione erano le proteine del replisoma. 16. Descrivi i vari passaggi coinvolti nell'inizio della replicazione negli Eucarioti La replicazione negli eucarioti inizia da diversi siti (nell'uomo sono circa 10000) dove, in seguito alrilassamento dei superavvolgimenti ad opera delle topoisomerasi, si legala proteina ORC iniziatrice della replicazione. Una volta legata ORC, i due filamenti DNA vengono separati dall'elicasi; a questo punto i singoli filamenti vengono tenuti aperti dalle proteine SSB ed a questo punto si attacca la primasi sul singolo filamento che sintetizza una breve sequenza di RNA primer necessario ad innescare l'attività della DNA polimerasi III. La DNA polimerasi è in grado di avanzare solo in direzione 5'-3' quindi sulle rispettive due forcelle replicative su di un filamento la replicazione sarà continua mentre su quello in direzione 3'-5' la DNA polimerasi sintetizzerà sempre in direzione 5'-3' creando tanti piccoli frammenti chiamati frammenti di Okazaki che vengono poi uniti tra loro dalla DNA ligasi.

17. Quali proteine sono coinvolte in ciascuna tappa e quando avvengono nel ciclo cellulare. Spiega come viene formattato il testo fornito utilizzando tag html.

controllata l'accensione dell'origine di replicazione. L'accensione dell'origine di replicazione viene controllata inizialmente dalle topoisomerasi che hanno il compito di svolgere i superavvolgimenti del DNA, rendendolo più accessibile. Una volta linearizzato, le proteine ORI si attaccano a specifici siti di replicazione e permettono all'elicasi di separare il DNA in due filamenti. Su questi filamenti si attaccano le proteine SSB in grado di stabilizzare il singolo filamento ed evitare che si richiuda. A questo punto, la primasi sintetizza una breve sequenza di RNA primer complementare al sito di inizio della trascrizione, così da favorire l'attaccamento della DNA polimerasi ad esso per iniziare la replicazione del DNA vera e propria. La DNA polimerasi può polimerizzare nucleotidi solamente correndo sul filamento stampo in direzione 5'-3', per cui si formano due forcelle replicative in cui, per entrambe, su di un filamento.l'andamento sarà continuo, mentre sul filamento 3'-5' si creeranno vari frammenti di DNA chiamati frammenti di Okazaki che verranno poi successivamente uniti dalla DNA ligasi, che rimuoverà anche l'RNA primer del sito di origine della replicazione. 18. Descrivi il replicone Durante la replicazione del DNA il doppio filamento viene aperto in uno o più specifici siti di inizio di replicazione creando due forcelle replicative, la replicazione continua in entrambi i sensi fino a quando non si arriva ad altri specifici punti nei quali si interrompe la replicazione. Il tratto di DNA compreso tra i due punti di arresto della replicazione viene definito replicone. 19. Quali sono i principali enzimi del replisoma, descrivine la funzione I principali enzimi del replisoma sono: topoisomerasi, proteine ORC, elicasi, proteine SSC, primasi, DNA polimerasi e DNA ligasi. Le topoisomerasi sono in grado di svolgere i superavvolgimenti del DNA; le proteine ORC siutilizzo di complessi proteici chiamati complessi di rimodellamento della cromatina. Questi complessi possono agire in diverse modalità, come ad esempio spostando i nucleosomi lungo il DNA o rimuovendo completamente i nucleosomi da specifiche regioni del DNA. Durante il processo di rimodellamento della cromatina, i complessi di rimodellamento della cromatina utilizzano l'energia fornita dall'ATP per modificare la struttura della cromatina. Questo può avvenire attraverso l'apertura della struttura compatta della cromatina, consentendo l'accesso alle regioni del DNA per l'attività di trascrizione o replicazione. Inoltre, il rimodellamento della cromatina può coinvolgere anche modifiche chimiche delle proteine che compongono la cromatina, come ad esempio l'aggiunta o la rimozione di gruppi chimici. Queste modifiche possono influenzare l'interazione tra il DNA e le proteine, alterando così l'accessibilità del DNA alle proteine coinvolte nei processi cellulari. In conclusione, il rimodellamento della cromatina è un processo dinamico che consente alla cellula di regolare l'accesso al DNA e di modulare l'espressione genica in risposta a segnali interni ed esterni.sostituzione di proteinedell'ottamero istonico che compone il nucleosoma con altre varianti proteiche che non modificano l'affinità con il DNA; possono avvenire tramite scivolamenti istonici sul DNA; tramite eliminazioni di interi istoni; o anche per mezzo della formazione di anse di DNA nell'impacchettamento del nucleosoma.

21. Che cos'è e perché è importante il codice istonico

Gli istoni sono ottameri di proteine la cui funzione principale è la compattazione del DNA; il DNA si avvolge attorno all'istone e quest'ultimo possiede delle code aventi specifici siti di legame: siti di metilazione, siti di acetilazione, siti di fosforilazione e siti di ubiquitinazione. Le interazioni con i siti presenti sulle code istoniche rendono più o meno accessibile il DNA, controllando di fatto l'espressione dei geni in esso contenuti.

Il codice istonico è il meccanismo di riconoscimento e di risposta con il quale

1. Vengono letti i vari siti delle code istoniche cui segue un silenziamento o una attivazione genica. L'importanza del codice istonico è quindi che esso rappresenta il linguaggio del controllo dell'espressione genica, ed essendo quindi alla base nella comprensione e nello studio dell'epigenetica.
2. Spiega in cosa consiste il mismatch repair e quali malattie derivano da mutazioni che lo alterano.

Il mismatch repair è uno dei metodi di riparazione degli errori commessi durante la replicazione del DNA. Il mismatch repair agisce durante la fase S di replicazione cellulare riconoscendo i nucleotidi mal appaiati. Gli errori di appaiamento provocano una distorsione della struttura del DNA che specifiche proteine del meccanismo mismatch repair sono in grado di riconoscere ed interagire con esso formando un'ansa che comprende l'errore. Una volta formata l'ansa, un'endonucleasi è in grado di tagliare il filamento neosintetizzato contenente.

l'errore di appaiamento viene riconosciuto dalla DNA polimerasi durante la replicazione del DNA. Nel caso in cui si verifichi un errore di appaiamento, la DNA polimerasi rimuove il nucleotide errato e lo sostituisce con il nucleotide corretto. Nei batteri, il meccanismo di riparazione del mismatch coinvolge la proteina MutS, che riconosce l'errore di appaiamento, e le proteine MutL e MutH, che coordinano l'eliminazione e la sostituzione del nucleotide errato. Negli eucarioti, il meccanismo di riparazione del mismatch coinvolge le proteine MSH2 e MLH1, che svolgono una funzione simile a MutS e MutL nei batteri. In entrambi i casi, una volta riconosciuto l'errore di appaiamento, viene attivato un complesso di proteine che rimuove la porzione di DNA contenente l'errore e la sostituisce con il nucleotide corretto. Questo processo è chiamato riparazione del mismatch. Le mutazioni ai geni che codificano per le proteine coinvolte nel meccanismo di riparazione del mismatch possono portare al malfunzionamento di tale meccanismo, causando l'accumulo di errori di appaiamento durante la replicazione del DNA. Questi errori possono a loro volta causare ulteriori mutazioni che possono portare allo sviluppo di tumori, in particolare a livello del colon.ossiedono meccanismi meno complicati che richiedono meno proteine ed enzimi rispetto ai meccanismi degli organismi più complessi.