Virologia vegetale

RNA.

Nei virus, allo stesso modo degli mRNA cellulari, la tripletta di basi che specifica l’inizio della sintesi

proteica di solito è 5’-AUG-3’ la quale codifica la metionina che costituisce il residuo N-terminale di un

polipeptide. Il codice AUG può trovarsi anche all’interno di una sequenza che codifica proteine. La

distinzione fra il codone AUG che specifica l’inizio della traduzione e quello interno dipende dal fatto che

essi sono riconosciuti da tRNA diversi. Le triplette di basi che non specificano per amminoacidi, ma

funzionano come segnali per i ribosomi per la terminazione dell’allungamento della catena polipeptidica

sono: UAA, UAG e UGA, indicate anche, rispettivamente, codoni ocra, ambra e opale.

Economia dell’uso degli acidi nucleici

Eucarioti introni 10-30 volte maggiori delle sequenze codificanti:

• Sequenze codificanti impaccate vicine Nicolas Garlatti

• Regioni codificanti di 2 diversi geni possono sovrapporsi o uno contiene l’altro

• Read through di una terminazione leaky

• Prodotti di un gene con più funzioni (coat, vector spec., trasporto…)

• Interazioni con proteine ospite

• Sequenze non codificanti possono essere segnali di riconoscimento ribosomi o replicasi

Infezione virale e genoma

Fitovirus con RNA a singolo filamento

I genomi a RNA a singolo filamento si indicano per convenzione come genomi a polarità positiva (o RNA+)

quelli in cui l’RNA infettante agisce da mRNA e viene direttamente tradotto a livello dei ribosomi della

cellula ospite con la produzione delle proteine virali. In tali virus, la prima funzione che viene espressa

nella cellula ospite è la traduzione in proteine dell’informazione genetica contenuta nell’RNA infettante,

dal momento che almeno una proteina codificata dal virus (RNA polimerasi) è necessaria per la

replicazione dello stesso RNA virale (Figura 3.5, 3.6).

Nel virus con RNA a polarità negativa (o RNA-) l’RNA infettante non funziona da filamento codificante ma

deve essere trascritto nel suo complemento (filamento positivo), il quale agisce da mRNA per la sintesi

proteica. Per la trascrizione dell’RNA infettante in mRNA, questi virus necessitano di un enzima (RNA

trascrittasi) contenuto nel capside. Il processo infettivo inizia solo se si inocula l’intera particella virale

oppure l’RNA assieme alla frazione del capside contenente l’enzima RNA trascrittasi. In questi virus la

trascrizione del genoma virale è la prima funzione che viene espressa nella cellula ospite dopo la sua

liberazione dal rivestimento proteico (Fig. 3.7).

I fitovirus con genoma costituito sia da filamenti di RNA a polarità negativa sia da filamenti ambisenso si

trovano nei generi Tospovirus e Tenuivirus. I filamenti ambisenso contengono una porzione di polarità

3

positiva ed una di polarità negativa, ciascuna con una ORF . In definitiva questi filamenti hanno una ORF

in prossimità della terminazione 5’, mentre l’altra ORF è localizzata nella regione 5’ prossimale dell’RNA

complementare a quello genomico. Le ORF dei segmenti ambisenso sono espresse da mRNA

subgenomici. Dal momento che il ciclo replicativo di questi virus inizia con la trascrizione del filamento di

RNA a polarità negativa in quello complementare a polarità positiva (Fig. 3.9), essi devono avere

incorporata nella particella virale la relativa RNA trascrittasi.

3 ORF: Open Reading Frame è una fase di lettura che consente di codificare un’intera proteina senza incontrare

codoni di stop prematuri e quindi formare una proteina tronca. Nicolas Garlatti

Nicolas Garlatti

Nicolas Garlatti

Nei virus (ssRNA+) i ribosomi si fermano ai codoni di stop, quindi abbiamo bisogno di strategie per

tradurre tutti i geni in modo da tradurre non solo la prima ORF:

1. Genoma multipartito: più componenti di acido nucleico, contenuti in molecole diverse in diversi

componenti o uni-componenti, che viene tradotto dai ribosomi nelle proteine di cui il virus ha

bisogno. Questa è la strategia più utilizzata.

2. Read through protein: genoma policistromico con codone di stop “leaky” che talvolta permette il

continuo della traduzione.

3. Translational frameshift: il ribosoma torna “indietro” e legge anche ciò che c’è dopo il codone di

stop.

4. Poliproteina: RNA messaggero monocistromico che viene tradotto completamente: un’unica

proteina, non abbastanza per rendere operativo il virus. Per autoscissione la proteina si rompe

producendo una proteasi che scinde (entrando o in cis- o in trans-) la proteina iniziale in modo da

produrre le proteine necessarie al virus.

5. RNA subgenomico: il virus sintetizza un pezzo di genoma 5’-3’ subgenomico che può essere

tradotto dal ribosoma. Il genoma viene sintetizzato da una RNA replicasi del virus via RNA-.

Un virus può utilizzare più strategie allo stesso tempo.

Processo di infezione virali – caso RNA positivo nel dettaglio

Schema generale

Subito dopo la penetrazione di una cellula ospite, per inoculazione meccanica o tramite vettori, i virioni

vengono a contatto con i ribosomi; si ritiene che tale interazione determini la rimozione parziale del

capside e l’esposizione dell’estremità 5’ dell’RNA che agisce da messaggero per la sintesi proteica

(disassemblaggio co-traduzionale). Schematicamente la traduzione dell’RNA può avvenire direttamente

o indirettamente, a seconda che l’RNA sia mono- o policistronico. Nella traduzione diretta l’RNA agisce

per intero da messaggero e codifica la sintesi di una poliproteina che viene scissa da una proteasi

contenuta nella stessa, in diversi segmenti, ciascuno dei quali corrisponde a una proteina matura con

attività specifiche concernenti la catalisi enzimatica della replicazione dell’RNA (RNA polimerasi RNA

dipendente ossia la “replicasi”, elicasi, ecc.), il movimento dell’RNA virale o dei virioni all’interno

dell’ospite, la trasmissione dei virioni da una pianta all’altra mediante vettori e la funzione di formare

nuovi capsidi (proteina strutturale). A questo punto, le proteine coinvolte nella replicazione dell’RNA

promuovono la sintesi di un filamento complementare sullo stampo di quello infettante con la formazione

di una struttura a doppio filamento, conosciuta come forma replicativa. Il filamento complementare, a

sua volta, funge da stampo per la sintesi di nuovi filamenti di RNA identici a quello iniziale (forma

replicativa intermedia). Infine, le subunità della proteina del capside e l’RNA genomico di nuova

formazione si riuniscono e formano nuove particelle virali. Nella traduzione indiretta l’RNA genomico si

comporta da messaggero solo per l’ORF (nella regione 5’ terminale) che codifica una proteina, definita

precoce, con i domini necessari sia per la trascrizione dell’informazione genetica contenuta nella regione

centrale e 3’ prossimale dell’RNA genomico in RNA subgenomici, sia per la replicazione dell’RNA. A questo

punto comincia la sintesi di un filamento complementare a quello genomico che contiene sequenze

nucleotidiche (promotori della trascrizione) riconosciute dall’RNA polimerasi virale e che costituiscono i

punti d’inizio per la sintesi dei filamenti subgenomici. Questo filamento funge da stampo per la sintesi sia

di filamenti di RNA identici a quello infettante iniziale sia di RNA subgenomici che codificano le proteine

funzionali non espresse direttamente dall’RNA genomico e quella strutturale. L’ultima fase del processo

replicativo è l’assemblaggio delle subunità della proteina del capside e dei filamenti di RNA genomico in

particelle virali. Qualunque sia il meccanismo di traduzione, le proteine di movimento promuovono la

diffusione di nuovi filamenti di RNA o, in alternativa, di particelle virali nei tessuti dell’ospite e, in moti casi,

altre proteine la trasmissione dei virioni da parte dei vettori. Nicolas Garlatti

• Ingresso del virus nella cellula

• Dacapsidazione

• Traduzione di geni precoci

• Replicazione del genoma virale

• Assemblaggio particelle virali

• Movimento entro l’ospite

• Diffusione

Infezioni virali

Per quanto riguarda l’inoculazione, i virus animali hanno un comportamento tendenzialmente diverso,

tranne quello che riguarda l’infezione tramite vettori. I virus possono essere anche nell’aria e, arrivati negli

organismi, i processi di replicazione animale sono differenti dai fitovirus: i virus animali vengono trasmessi

attraverso l'aria, attraverso gli orifizi o attraverso i vettori, oltre alla trasmissione diretta (verticale) alla

progenie; la maggior parte dei virus delle piante è trasmessa da vettori, soprattutto insetti omopodi; la

maggior parte dei virus fungini viene trasmessa orizzontalmente dalla fusione ipogea.

La prima fase dell’infezione virale prevede l’attacco della cellula ospite. Tecnicamente l’attacco consiste

nel legame specifico di una proteina deputata all’attacco (antirecettore) a un recettore cellulare. I

recettori presenti possono essere proteine (glicoproteine) o residui carboidrati; in genere i primi sono

specifici.

Nella seconda fase, ovvero quella della penetrazione è un processo che richiede energia, e pertanto la

cellula dev’essere metabolicamente attiva. Questo processo dà luogo a tre diversi meccanismi: la

traslocazione dell’intera particella attraverso la membrana citoplasmatica; l’endocitosi del virus

all’interno di vescicole cellulari; oppure la fusione dell’envelope virale con la membrana cellulare.

I virus una volta entrati all’interno della cellula, superando la cuticola e la parete senza danneggiare

l’ospite, danno inizio alla loro replicazione tramite la decapsidazione o uncoating. Essa permette la

fuoriuscita dell’acido nucleico, che verrà successivamente replicato, permettendo il mantenimento della

progenie. In questa fase non c’è intervento di enzimi in particolare ma è dovuto da un insieme di fattori

fra cui il pH e la temperatura. Per quanto riguarda il TMV c’è una disgregazione della struttura all’interno

della cellula in cui il 5’ esposto va nei ribosomi e dalla parte 3’ inizierà la replicazione tramite l’RNA

polimerasi (dipendente) che replica/codifica una catena di replicazione. Nel dettaglio, nel caso del TMV, la

separazione proteina capsidica-RNA procede in due direzioni. Inizialmente si ha il collegamento dei

→

ribosomi all’estremità 5’ dell’RNA virale. Segue il disassemblaggio co-traduzionale in direzione 5’ 3’ che

porta alla liberazione di circa i 2/3 dell’RNA e alla sintesi delle proteine della replicazione codificate dalle

→

ORF 1 e 2. La fase successiva del