Esercitazione di Virologia vegetale

Riassumendo, il virus si avvale per lo più di strutture già presenti nella cellula ospite per il suo

movimento: si limita a sintetizzare le MP, che vengono convogliate verso i plasmodesmi (dove

esplicheranno la loro funzione) a spese delle strutture cellulari dell’ospite (solitamente, il citoscheletro

assieme ai sistemi di trasporto endomembrana convogliano le MP verso i plasmodesmi, passando

attraverso il reticolo endoplasmatico).

Le MP producono anche strutture tubolari in protoplasti infetti, pertanto alcune specie virali possono

avvalersi anche di tali strutture tubolari (oltre ai plasmodesmi come illustrato in precedenza) per

muoversi a brevi distanze.

Esercitazione virologia – 5 aprile 2023

4. I virus usano diverse strategie di espressione genica. Quali sono secondo voi le più efficienti?

I virus devono adattarsi al sistema di produzione eucariotico pur mantenendo un genoma breve e

compatto, pertanto hanno sviluppato diverse strategie.

a. Sintesi di mRNA subgenici: in tal modo la regione in prossimità del 3’ funge da stampo per la

sintesi di RNA più corti, che fungono a loro volta da stampo per la trascrizione di mRNA. Questa

trascrizione inizia da promotori che possono essere presenti in numero di uno o più dando

così origine a uno o più mRNA cistronici. Alcuni mRNA subgenomici virali possono essere

incapsidati.

b. Sintesi di poliproteine: l’RNA virale viene tradotto come monocistronico producendo un’unica

grande proteina che può essere scissa in diversi prodotti proteici tramite attività proteolitica.

Se nel virus non intervengono ulteriori processi, verranno generate frazioni equimolari di

prodotti proteici. Le frazioni inutilizzate verranno impiegate per formare inclusioni proteiche.

c. Leaky scanning: in questo caso, l’attività del complesso di iniziazione della traduzione può

portare a delle imperfezioni. Può verificarsi quindi che il codone iniziale di avvio della sintesi

proteica non venga correttamente riconosciuto: allora il complesso dovrà trovare un codone

sostitutivo, ma questo può non essere in frame (cioè non inizierà nello stesso punto). Si

originerà quindi una proteina diversa. Ciò accade spesso nei virus privi di CAP, dove l’attacco

al ribosoma è mediato dalla struttura secondaria e terziaria.

d. Ribosomial frameshift: possono esservi dei punti di scarsa affidabilità di lettura, con

conseguente “scivolamento” del ribosoma e ignoramento del codone di stop. Si produrrà così

una proteina più grande, che terminerà al codone di stop successivo.

Queste quattro sono le strategie di espressione genica più frequentemente impiegate dai virus. È

difficile valutare con precisione quale sia la tecnica più efficiente, poiché ognuna presenta vantaggi

e svantaggi. Tuttavia, le modalità leaky scanning e ribosomial frameshift presentano forse una

maggior incidenza di anomalie che portano a delle alterazioni nella sintesi proteica. Invece, nei

primi due metodi (sintesi mRNA subgenici e sintesi di poliproteine) si ha una maggior affidabilità

ed efficienza.

5. Quali sono i principali limiti e problemi della diagnosi tramite test ELISA? Quali di questi possono

essere tenuti sotto controllo grazie all'introduzione di controlli nell'esecuzione dei test diagnostici?

E quali sono superabili con la diagnosi tramite PCR?

ELISA è l’acronimo di un metodo d’analisi immunologica, per cui una sostanza si lega ad un’altra (di

solito un anticorpo) che ne segnala la presenza. Pertanto, tramite questo test si può identificare la

presenza di una particolare sostanza all’interno del campione in analisi.

Il vantaggio principale di questo metodo d’analisi è l’alta sensibilità e specificità diagnostica. Inoltre, è

un processo facilmente riproducibile ed automatizzabile. Tuttavia, si possono ottenere solo

informazioni riguardanti la presenza o meno di determinate molecole nel campione, e questo è un

grosso svantaggio, soprattutto se si vuole analizzare dal punto di vista biochimico ciò che il test ha

rilevato.

Durante la conduzione del test, vi sono due parametri fisici il cui stretto controllo è fondamentale per

la corretta riuscita del test. Tempo e temperatura sono infatti cruciali per determinare la quantità di

proteina adsorbita durante la fase di coating. Anche la qualità delle plastiche che costituiscono le

piastre dove il test viene condotto è importante: materiali di cattiva qualità possono causare un

“effetto uovo” (distribuzione disomogenea del contenuto nel pozzetto).

Un altro problema frequente nei test ELISA è il cosiddetto “effetto uncino”, limitabile tramite un

intervento dell'operatore che andrà ad effettuare dei test di prova (fase di setting).

Esercitazione virologia – 5 aprile 2023

Nella fase di blocking si vanno a limitare i siti idrofobici sulla plastica non occupati dall’anticorpo. Per

fare questo si utilizzano dei detergenti oppure delle proteine. I detergenti hanno diversi svantaggi

poiché distruggono le interazioni idrofobiche, vengono eliminati nei lavaggi e alterano l'attività

enzimatica. È più conveniente quindi impiegare albumina, latte disidratato, siero.

Il test PCR si basa invece sulla duplicazione e sull'analisi di specifiche sequenze di DNA. il metodo PCR,

in generale, può essere considerato superiore ai test ELISA poiché è più specifico (rileva il DNA e non

le proteine), non si incorre in cross-reazioni, i risultati sono qualitativi e non quantitativi come nel caso

di ELISA ed è un processo totalmente automatizzabile. Anche il test PCR non è esente da svantaggi: ha

un costo abbastanza elevato e richiede tempistiche superiori per lo svolgimento.

Per tali motivi, molte volte il test PCR viene considerato come complementare ad ELISA, poiché può

essere impiegato come test di conferma o rilevare determinati parametri grazie alla sua elevata

specificità e sensibilità.

6. I virus sono distinguibili in 7 gruppi per quanto riguarda l'acido nucleico di cui sono costituiti e la

strategia di replicazione. Delineare le differenze tra i 7 gruppi e ipotizzare i motivi per cui i virus

vegetali sono prevalentemente ssRNA, a differenza di quanto avviene negli animali.

In base all’acido nucleico di cui sono costituiti e alla strategia di replicazione adottata, i virus possono

essere distinti in sette gruppi diversi. Esistono due gruppi di virus a DNA che tramite replicazione

incapsidano all’interno del capside virale ssDNA oppure dsDNA, due gruppi di virus a trascrizione

inversa che creano genoma di tipo (+)RNA o dsDNA, tre gruppi di virus a RNA la cui progenie virale ha

genoma (+)RNA, (-)RNA, dsRNA. Nei virus a (+)RNA, l’acido nucleico (per la replicazione) funge

direttamente da mRNA, quindi viene subito tradotto in proteine. Ora l’RNA polimerasi produce il

filamento (-) di RNA usando come stampo l’RNA genomico, poi il filamento (-) viene utilizzato come

stampo per sintetizzare il filamento (+) che verrà utilizzato per creare la progenie virale. Nei virus a

(-)RNA l’acido nucleico dev’essere prima trascritto nel filamento complementare che funge da mRNA,

poi quest’ultimo può essere tradotto in proteine virali. Dopodiché l’RNA polimerasi interviene come

già spiegato sopra, soltanto che prima realizza il filamento positivo, poi quello negativo (componente

della progenie virale). Nei virus a dsRNA l’informazione per la replicazione è contenuta soltanto nel

filamento negativo, che dev’essere in primis trascritto nel filamento positivo, che verrà tradotto in

proteine virali. Ora il (+)RNA, dopo aver interagito con diverse proteine virali, viene utilizzato come

stampo per sintetizzare il filamento (-) di RNA, quindi i due filamenti vengono utilizzati per creare il

dsRNA della progenie virale. Nei virus che svolgono la trascrizione inversa, le particelle virali

contengono un dsDNA, il cui filamento (-) viene trascritto in un filamento (+) di RNA che funge da

mRNA. Avviene poi la trascrizione inversa, per la quale il (+)RNA funge da stampo per la sintesi di un

(-)DNA. A questo punto il (-)DNA viene utilizzato come stampo per la sintesi del (+)DNA, a questo punto

entrambi i filamenti vengono assemblati per formale il dsDNA della progenie virale. Infine, nei virus

che non sono interessati dalla trascrizione inversa il genoma virale è costituito da (+)DNA, che viene

utilizzato come stampo per la sintesi del filamento complementare (-), dopodiché entrambi i filamenti

vengono uniti per formare il genoma a dsDNA della progenie virale. I virus delle piante sono

prevalentemente a ssRNA, perché hanno una maggiore rapidità d’azione rispetto quelli a DNA (che

invece interessano gli animali). Appena introdotti nella cellula vegetale, i virus a ssRNA iniziano subito

a produrre le proteine virali, mentre nel caso di un virus a DNA questo processo è più complesso e

lento, infatti, quando entra nella cellula il virus a DNA deve raggiungere il nucleo della stessa, e per far

ciò si deve decapsidare. Quindi, una volta rimosso il capside il virus a DNA non può subito replicarsi,

perché prima deve raggiungere il nucleo. Il problema principale sta nel fatto che la decapsidazione

rende il virus maggiormente esposto alle difese attuate dalla cellula ospite. Invece, i virus a ssRNA

mentre si decapsidano iniziano subito a replicarsi, evitando questa situazione molto pericolosa per la