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pianta e con queste micro lesioni possono entrare i virus, ma questo avviene in natura tranne questi

2 casi, la trasmissione per contatto è molto importante per la sperimentazione, per la ricerca, è un

modo che a me serve solo da un punto di vista sperimentale perché inoculo le mie piante e dopo di

che posso farci le ricerche, l’unica importanza che ha è in questi 2 virus, nel PVX che non ha vettori

e si trasmette solo per tubero e anche per contatto nel senso che una volta quando si usava tagliare i

tuberi, il taglio da un tubero infetto poteva infettane un altro, non è una forte contaminazione, non è

come il mosaico del tabacco o del pomodoro che li basta toccare una piantina infetta anche

lavorando e toccarne un’altra che sicuramente si trasmette, in questo caso nel PVX è molto +

leggero; il mosaico del tabacco nelle manipolazioni che si facevano in serra potevano infettare le

piante sane, è un virus al contrario della maggior parte estremamente resistente e capace di

trasmettersi anche per contatto, ma i casi sono rarissimi, c’è anche la possibilità per qualche virus la

trasmissione attraverso le radici e quindi questo è molto importante da tenere conto per 2 o 3 virus,

sono molto pochi e dal punto di vista epidemiologico non ha molto significato. Adesso entriamo in

un altro capitolo della trasmissione per seme: quando si dice che il bin comon cioè il mosaico

comune per fagiolo si trasmette per seme è vero, però si trsmette nel seme nel fagiolo vulgaris e in

un’altra specie, questo è un brutto esempio perché non è un virus che va su molte specie, prendiamo

il virus del mosaico del cetriolo che è un virus polifago che ha circa 800/900 specie identificate

infettate da questo virus, si trasmette per seme per una quindicina o una ventina di quelle specie,

quindi quando un virus si trasmette per seme non vuole dire che si trasmette per seme in tutte le

specie che infetta, qualche volta può succedere, ma non solo all’interno delle specie che infetta c’è

anche una variabilità delle cultivar, magari ne infetta 9 su 10, devo andare a vedere in quali specie

dalle ricerche che sono state fatte e poi c’è anche la variabilità dei ceppi del virus, in genere quando

si dice che un virus si trasmette per seme bisogna vedere le ricerche che sono state fatte, ad esempio

il CMV è un virus multi componente, quelli che sono multi componente sono quelli che sono

maggiormente soggetti a ricombinazione e quindi estremamente variabili e questo spiega perché è

stato capace di infettare forse 1.000 specie perché questa ricombinazione gli ha permesso una

variabilità enorme che gli ha permesso anche di trovare delle condizioni in tanti specie su cui

svilupparsi, quindi questo è da sapere. Dal 51’ al 87’ se uno guarda le ricerche bibliografiche da 8 a

+ di 100 virus identificati, questo numero relativamente basso all’inizio, aveva portato la

convinzione che la trasmissione per seme non era così importante, era importante solo per alcuni

virus, era stata sottovalutata, poi man mano sono andata avanti le ricerche, perché come faccio a

dire che un virus si trasmette per seme? Naturalmente devo infettare la pianta, fare produrre del

seme, ma non una piantina e non è che questa sia una pratica che si fa sempre, si fa quando c’è il

sospetto che quel virus si trasmette per seme, ma non è che se il CMV infetta 1.000 specie e ne sono

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state identificate 15 o 20 si trasmette per seme non è che io sono sicuro che su tutte le altre 900 la

ricerca è stata fatta, magari è stata fatta su una parte, quindi queste considerazioni sono da tenere

presente. Attualmente circa il 20% dei virus delle piante noti si trasmettono attraverso il seme di

qualche pianta ospite, i generi + importanti nella trasmissione per seme sono quelli che vi hop

segnalato: il cucumovirus: il virus del mosaico del cetriolo appartiene ai cucumovirus, gli ilarvirus

che è un gruppo piccolo nel quale però ci sono alcuni virus delle drupaceae, allora le drupaceae si

trasmettono per propagazione vegetativa potremmo anche ignorale da un punto di vista della pratica

colturale però ci sono i piedi per gli innesti che quelli derivano da seme quindi si devono controllare

e in + in questo caso negli ilarvirus ci può essere anche una trasmissione per polline che vedremo.

I nepo virus è un gruppo di virus che si trasmettono per nematodi, sono virus isodiametrici che

hanno come vettori i nematodi, il cucumovirus oltre che per seme si trasmettono anche per afidi

nella modalità della non persistenza, anche i tobra virus si trasmettono per nematodi e poi c’è il

grandissimo gruppo dei poti virus dove la trasmissione è per afidi con la modalità della non

persistenza. Ilo seme rappresenta il mezzo di conservazione e di disseminazione delle infezioni, da

una parte il conservare il seme magari da un danno all’altro gli permette al virus una conservazione,

si conserva il virus assieme al seme e poi la disseminazione perché i semi viaggiano molto

facilmente, durante l’infezione del seme tante volte c’è la morte del seme e questa è una difesa delle

piante diciamo, per quella pianta malata che non riesce a maturare, a produrre il seme in qualche

modo produce meno seme infetto, una volta che in seme è prodotto, a volte può essere un seme che

ha delle malformazioni, può avere anche degli effetti diretti sul seme però l’effetto + importante che

ha è quello della trasmissione. Da un punto di vista epidemiologico è molto importante la

trasmissione per seme, qui vi ho riassunto in una vecchia tabella dove vi divedo che si passa da 8 a

+ di 150, queste sono segnalazioni riportate alle fine degli anni 80’, poi questi sono circa 300, ma

perché sono aumentati tanto questi virus? Semplicemente perché c’è un po’ + di indagine.

La localizzazione del virus nel seme: è sempre embrionale, la contaminazione l’ho messa ma è un

fatto che avviene solo per uno o 2 virus, la vera localizzazione è a livello embrionale ed è quella che

consente la trasmissione dei virus alla progenie. È chiaro che negli anni 50’/60’ le prime indagini

avvenivano per sintomi, poi magari dai sintomi si arrivava a identificare i virus, dopo c’è stato

questo progresso notevole perché non ci si è riferiti solo ai sintomi delle piante derivate da seme

perché tante volte possono essere anche latenti, quindi le indagini non sono solo visive dipende

anche dalle varietà, questa è una pianta di canapa nella quale noi abbiamo trovato una malattia che

non abbiamo identificato, non è che questa pianta sia infetta però a volte ci sono delle emergenze

che potrebbero fare pensare e poi in realtà non c’è niente.

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Contaminazione: vi ho fatto vedere questo pomodoro perché è affetto dal mosaico del pomodoro,

prima mosaico del pomodoro e mosaico del tabacco erano una unica specie, poi sono stati suddivisi

in 2 però tanti comportamenti sono simili, il mosaico del pomodoro è un virus che ha una

grandissima capacità di resistere, la maggior parte dei virus ad di fuori delle cellule vengono

assolutamente non conservati mentre questo all’interno delle cellule di materiale essiccato è capace

di conservarsi e quindi da pomodori infetti, nella polpa c’è il virus, si attacca ai rivestimenti dei

semi, quando si seminano l’apertura del seme può provocare delle micro lesioni, cmq anche la +

banale manipolazione di un sementaio per cui questo provocava delle epidemie di questa malattia

fino a 20 anni fa, era una malattia importante nel pomodoro da tavola, adesso non lo è +. Qui c’è la

trasmissione per contatto unita alla contaminazione del seme, ma non è una vera trasmissione per

seme questa, questo virus non ha vettori per cui le uniche modalità di trasmissione sono le

contaminazioni, i contatti, questo è stato risolto 20 anni fa, erano tra l’altro anche trovati dei metodi

di disinfezione, ma probabilmente danneggiavano anche lo sviluppo e alla fine si è trovato che con

queste metodi con percentuale di fosfato trisolico per 15’ oppure + bassa per + tempo, oppure con

ipoclorito di sodio poi anche nel peperone si riesce a inibire il virus quindi il problema si è risolto, è

un problema nel tabacco, ma non nel pomodoro. Questa è un disegno molto vecchio che fanno

vedere la localizzazione dei virus, perché io vi ho detto che i virus sono localizzati nell’embrione,

ma non è che sempre sono localizzati nell’embrione, a volte può essere localizzato anche in altre

parti, ad esempio endosperma, rivestimento e la contaminazione che come vedete è del mosaico del

tabacco; non è che il virus non ossa infettare altri tessuti, ma quello che determina la trasmissione è

l’embrione, negli altri tessuti non riesce. Come avviene la trasmissione embrionale? Ci sono 2

modalità, ma quella indiretta è la + importante, quella diretta è rara, indiretta in che modo: indiretta

perché i tessuti riproduttivi sono già infetti prima di formarsi l’embrione perché se una pianta è

infetta prima della fioritura, il virus vede viaggiare all’interno della pianta e invade tutti i tessuti o

quasi tutti, quei meristemi che si differenzieranno in fiorali, se sono infetti poi c’è la possibilità di

avere il gametofito femminile ma anche maschile all’interno del polline infetto e quindi è probabile

che se la fecondazione riesce perché nel caso di tessuti infetti avremo seme infetto, per alcuni tipi di

piante e per qualche virus ci può essere anche il fatto che il seme si infetti dopo la fecondazione

attraverso il sospensore dell’embrione ma questo è abbastanza raro perché quello che rende difficile

l’infezione dell’embrione è il fatto che dopo la fecondazione c’è un isolamento di tutti i tessuti che

sono attorno all’embrione, le connessioni citoplasmatiche si interrompono, è una protezione per cui

il virus è meno facilitato a muoversi quindi se non è riuscito a infettare prima sarà difficile che ci

riesca dopo, questo non vuole dire che in alcuni casi non ci riesca, però quello che conta è

l’infezione della pianta prima della fioritura. Qui è rappresentato in modo schematico l’arrivo del

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polline nelle varie fasi per la fecondazione, non è comunissimo ma può succedere che arrivi polline

infetto su una pianta sana, non sono molti i virus che si trasmettono per polline.

Semi infetti possono essere prodotti anche in piante esenti da virus, un esempio il virus del nanismo

del susino che è il prunus born e la maculatura anulare necrotica ‘’dei faggi’’ sono quegli ilarvirus

che vi ho detto prima, questi possono essere avere anche il polline infetto, anche in altri virus, ma in

questo caso può succedere questo problema e naturalmente per il discorso dei porta innesti se nel

prunus derivati da seme, cioè i porta innesti devono essere controllati.

Questo è un riassunto di un esperimento che hanno fatto dei colleghi inglesi prendendo un virus del

pisello che si chiama pisid born che noi non abbiamo, è uno di quei virus di cui si esige il controllo

perché il materiale ne sia libero e hanno fatto un esperimento con una varietà dove il virus non è in

grado di infettare l’embrione, quello che dicevamo prima, nella maggior parte si trasmette, in quella

non si trasmetteva, quindi hanno usato queste 2 varietà per vedere e anche analizzare

istologicamente cosa succedeva per questo virus che è uno dei pochi che si trasmette in modo

diretto cioè non entra nei tessuti del gametofito, ma entra dall’esterno attraverso la comunicazione

esterna, attraverso il sospensorio. Quindi qui hanno visto che nel caso della varietà dove il virus si

trasmette c’è il passaggio del virus attraverso i tessuti, mentre nel caso di questa varietà che non si

trasmette si forma una barriera, una barriera anche istologicamente differenziata con del callosio, le

ricerche che hanno fatto sono lunghe e complesse e interessanti, cmq istologicamente hanno visto

questa cosa e quello che è interessante è che cmq c’è una proteina, un helper component che sembra

che abbia una funzione, una proteina del genoma virale, che abbia una funzione nella diffusione del

virus a lunga distanza, non entro in dettaglio, questo lo troveremo spesso.

Questo è un riassunto di alcuni virus trasmessi per seme: il tomato black vin è un nepovirus, il

CMV, il pisid born, nel descrivere il genoma nel primo abbiamo 2 particelle, nel CMV ne abbiamo

tre, il pides born in una sola e hanno segnalato con un trattino le zone del genoma che si

conoscevano all’ora che erano coinvolte nella trasmissione per seme.

Questo è il tabacco ring spot, un nepo virus che si trasmette anche per seme, furono ricerche

vecchissime queste però furono quelle ricerche dalle quali partirono molte informazioni dove gli

inglesi hanno visto che 3 varietà diverse di soia ecco che l’inoculazione è differente prima e dopo la

fioritura, le percentuali di infezione sono molto diverse, prima della fioritura sono consistenti, dopo

la fioritura solo in un caso avviene; questi sono semi di soia che in questo caso hanno assunto

questa colorazione, non è detto che assumano questa colorazione, anzi spesso non si vede, questo è

il mosaico della soia, la soia fu introdotta in Italia 25 anni fa, dal gruppo ferrucci, perché la soia

aveva un grande monopolio negli stati uniti e anche in asia, per quello che riguarda l’esportazione

per i mangimi gli stati uniti avevano il monopolio in Europa si faceva fatica a produrla, ferrucci la

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introdusse e nel giro di 2 anni fu introdotto anche in virus del mosaico della soia perché sicuramente

i controlli non erano abbastanza rigorosi, questo è un virus che va soia sulla soia e in + si trasmette

anche pere afidi.

La trasmissione embrionale è quella importante da un punto di vista di diffusione della malattia, per

molti virus che si trasmettono per seme in natura hanno anche dei vettori animali che sono afidi

nella maggior parte con la modalità della non persistenza e nematodi; quindi i semi infetto svolgono

un mezzo di sopravvivenza dell’infezione dalla stagione vegetativa all’altra, disseminazione e

sorgente di infezione. Ho segnalato un caso importante in alcuni circostanze, nei semi delle piante

spontanee e il caso + conosciuto, da manuale è il CMV virus del mosaico del cetriolo che si

trasmette per seme in una pianta molto comune soprattutto in coltivazioni di tipo orticolo, succede

che noi possiamo avere tutto il seme certificato, ci capita nelle vicinanze un seme infetto dal CMV,

poi arrivano gli afidi visto che è trasmesso nella modalità della non persistenza e ce lo becchiamo,

tante volte non si capiva bene come arrivano queste infezioni. Disseminazione da un’area all’altra

quello che ho detto per la soia è un esempio, sorgente di infezione precoce interna della coltura per

la trasmissione nel senso che oltre al discorso della spontanea invece può essere che i semi di

fagiolo abbiano una infezione è chiaro che dalle prime piante infette avremo la diffusione della

malattia. Tuttavia è abbastanza importante quello che ho messo sotto da un punto di vista pratico,

tanti virus possono infettare l’embrione, ma non è detto che il tasso di trasmissione, di infezione sia

lo stesso perché nel processo di conservazione, di maturazione e di germinazione il virus può non

farcela per inattivazione etc. allora da un punto di vista pratico quello che interessa è la stima dei

tassi di trasmissione per creare malattia.

Questo è una tabella dove fa vedere alcuni dei virus + importanti trasmessi per seme, il mosaico

striato dell’orzo, è un virus da quarantena, e può arrivare al 100% perché se io ho una coltivazione

di grano o di orzo dove il seme è molto infetto, posso arrivare a produrre una elevata percentuale di

semi, questo è un virus che non ha vettori quindi con la quarantena questo virus non lo diffondo

perché i semi che arrivano dai paesi presenti, ne deve essere certificata l’assenza ed è facile da

contenere, non ha vettori si tratta di produrre seme sano e quindi negli stati uniti e in Canada hanno

risolto il sistema, è stato un virus molto studiato dai virologi, ha fatto capire tante cose; 3 anni fa un

produttore di semente di grano di Bologna che vendeva grano duro in Turchia si è visto rifiutare una

nave di una varietà che aveva tutti i certificati che garantivano l’essenza di questo virus, in Turchia

alla frontiera hanno scritto una dichiarazione dicendo che avevano riscontrato barley strai mediante

Elisa, la nave è tornata indietro, il servizio fito sanitario era molto preoccupato, allora si sono rivolti

a noi e non lo abbiamo trovato e sarebbe stato rarissimo il contrario perché come fa un virus che si

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trasmette solo per seme in una varietà locale a infettarsi, è stata una ripicca dei turchi per motivi

politici, queste problematiche a livello di gestione dei servizi fito sanitari sono complicati.

In virologia non si trattano mai i trattamenti perché il virus vive nelle cellule, ci sono dei prodotti

curativi che consentono di agire su enzimi di replicazione, in virologia non esistono i trattamenti si

parte sempre da materiale sano.

Un altro fattore importante è la longevità, cioè quanto tempo persiste in un seme, in alcuni casi sono

state fatte prove e si sa però si sa per quella specie, per quel ceppo, non ci sono tantissimi dati in

realtà, non si fanno quasi mai a meno che uno non lavori tutta la vita su quell’argomento, sui quel

seme e ha dei lotti e lo fa, oppure nelle collezioni di germoplasma dove magari uno sa che ha del

materiale infetto altrimenti sono studi che non si fanno, ad esempio nel bin common ice 30 anni, è

una varietà in cui ci sono dati, sulla longevità non si sa molto.

Esempio della trasmissione per seme del bin yellow che è un altro poti virus: è un mosaico del

fagiolo, non è il mosaico comune, questo va su molte specie, poi in + questo virus va su piante

perenni che possono mantenere l’infezione per molto tempo, sul gladiolo a volte si sono riscontrate

infezioni del 100%.

Trasmissione per vettori: è fondamentale perché è quella che ci trasmette il virus a volte anche

trasmesso da seme, ma può anche venire da altre piante infette, i vettori sono animali e

fondamentalmente insetti i + importanti di tutti, anche i nematodi e acari, ma quantitativamente per

il numero di virus che vengono trasmessi sono gli insetti e di questi gli afidi, vegetali c’è

l’’’olpiunco’’ e dei protozoi la polimixa; il processo di trasmissione in tutte le modalità studiate è il

risultato di una interazione specifica tra i virus e il vettore cioè ci sono delle regolazione nel genoma

del virus che inducono quella trasmissione. Vanno ricordate la specificità del vettore, un virus viene

trasmesso da un determinato tipo di vettore, mettiamo un afide o da un protozoo e da una o alcune

specie non da tutti gli afidi, e poi l’efficienza della trasmissione. Quindi la trasmissione consiste da

una parte nell’acquisizione del virus da parte del vettore da una pianta infetta e questo viene + o –

trattenuto e poi viene inoculato alla pianta ospite durante le funzioni che in genere riferiti agli

animali sono nella nutrizione. Ci sono delle variabili temporali che sono da considerare che sono il

tempo di acquisizione e il tempo di inoculazione che sono i tempi di alimentazione perché sia negli

afidi, ma anche nei nematodi e altri animali questa acquisizione avviene durante la nutrizione

oppure di assaggio prima della nutrizione e poi il tempo per l’inoculazione, c’è un periodo di

ritenzione dell’infettività che a volte c’è e a volte non c’è oppure c’è in modo molto veloce, è il

periodo durante il quale quell’animale è infettivo, e poi c’è un periodo di latenza riscontrabile solo

in una modalità di trasmissione che noi chiamiamo persistenza però per questa persistenza è legata

al periodo di latenza, cioè un periodo nel quale in virus è trattenuto dal vettore e in quel periodo il

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vettore non lo trasmette, è un periodo di latenza della trasmissione. In base a queste caratteristiche

temporali noi abbiamo 2 grandi modalità che sono la non persistente e la persistente, ce ne è una

intermedia e qualche altra che è una modifica di queste, però fondamentalmente abbiamo una

modalità di trasmissione non persistente che persiste, dura da una o poche ore al massimo, seme

persistente qualche gg e persistente che possono anche durare tutta la vita dell’infezione.

Nello schema a sx è rappresentata la modalità della non persistenza, l’afide punge l’epidermide e

assaggia la bontà di quei tessuti, se non è buona cambia e quindi prima di nutrirsi fa tante punture,

quando prende una pinta malata prende anche il virus e ne infetta successivamente una sana e così

con queste punture di assaggio può trasmettere tante volte il virus e questa modalità di trasmissione

è molto comune in quei virus che si trasmettono anche per seme, molti virus che si trasmettono per

seme e per afidi hanno questa modalità di trasmissione, mentre a dx abbiamo la modalità di

trasmissione della non persistenza cioè l’afide acquisisce il virus dal tessuto floematici, sono quei

virus che si chiamano nuteo virus che sono localizzati solo nel floema e l’afide quando va a nutrirsi

e quindi va a nutrirsi dal floema e acquisisce il virus e lo trasmette dopo un periodo di latenza,

quindi sono 2 modi completamente diversi.

Trasmissione non persistente: le particelle virali sono acquisite e inoculate dagli afidi vettori nel

corso di punture di assaggio della durata di pochi secondi, gli afidi perforano la cuticola, la parete e

la membrana plasmatica dove c’è l’epidermide senza danneggiare le cellule perforate, anche questa

è una cosa a vantaggio degli afidi in qualche modo non danneggiano e le particelle sono acquisite

con il succo introdotte nel canalicolo di suzione e adsorbite, non entrano in circolo e anche se

entrano in circolo non sono quelle che vengono trasmesse, quelle che vengono trasmette sono quelle

che stano nel canalicolo, allora primo quesito che era venuto era quello di dire: allora qualunque

afide può trasmettere il TMV o il mosaico del pomodoro che è così persistente come abbiamo detto

e non si trasmette per afidi, come mai? Si era capito che c’era un meccanismo che determinava che

tanti virus erano trasmessi per afidi e che c’erano dei rapporti specifici e in effetti è così, c’è una

specificità che viene codificata dal genoma virale che codifica per determinate proteine oppure

addirittura sono contenute nelle proteine del capsidio, ci sono 2 grandi strategie: una che si basa

nella codifica da parte del virus di una proteina che favorirà la trasmissione oppure la stessa

proteina del capsidio che favorisce la trasmissione. Abbiamo visto che il periodo di acquisizione è

veloce, sono dei secondi, il periodo di infettività cioè il periodo nel quale dopo la puntura l’afide è

infettivo è breve, una o due ore è già molto e viene perduta rapidamente effettuando le punture di

assaggio però in quelle punture lui trasmette. Questo è uno schema dove si vede come le particelle

rappresentate dai puntini neri, i canalicoli formati dagli stiletti boccali penetrano dentro il

protoplasto e nella suzione, in questa puntura di assaggio trattiene le particelle virali, quando poi va

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a finire in un’altra pianta introduce le particelle del protoplasto però è un fenomeno legato solo agli

stiletti boccali, non entra in circolo, ci sono quindi 2 strategie che danno la specificità: una capsidica

che fa si che le particelle virali aderiscano al canalicolo dell’afide e c’è un fenomeno, un

assorbimento specifico di riconoscimento, questa è la strategia capsidica, poi c’è un’altra strategia

della componente di trasmissione (helper component) che è basata sull’assorbimento alla parete

degli stiletti mediato da proteine non strutturali che sono indotte dai vettori.

Teniamo in considerazione che le caratteristiche della modalità della non persistenza sono una

durata nel periodo di acquisizione breve, di minuti ore al massimo, non c’è un periodo di latenza e

non c’è una elevata specificità nel senso che c’è quella specificità che vi ho detto del

riconoscimento del capsidio oppure della helper component però il numero di vettori che possono

trasmettere questo virus è elevatissimo, ad esempio per il CMV sono u 60 i virus, quindi diciamo

che è una modalità che permette una grandissima diffusione di queste malattie e in + spesso è + alta

dalla trasmissione per seme, quindi sono malattie che si diffondono molto facilmente, mentre invece

nell’altra modalità di trasmissione quella a dx, dove l’afide si nutre dal floema, solo nei nuteo virus

che non sono tanti, sono un gruppo di virus dove ci sono 2 virus importanti che sono

l’accartocciamento fogliare della patata che si trasmette anche per afidi nella modalità della

persistenza e in nanismo giallo dell’orzo, in questo caso il meccanismo è molto + specifico, i vettori

sono un numero minore ed è + specifica la trasmissione: il virus entra in circolo, viene ingerito,

giunge nel floema, viene acquisito entrando nell’intestino dell’afide dove avviene una selezione:

alcune particelle a seconda del virus possono essere espulse, altre passano in modo con dei legami

specifici, con la membrana plasmatica all’emocele e dal liquido dell’emocele arrivano alle

ghiandole salivari e dalle ghiandole salivari quando farà un’altra puntura di nutrizione inietterà nel

floema, il tempo di latenza quindi è il tempo necessario a fare questo percorso, in + questi virus

permangono, c’0è tutto un sistema per cui hanno la possibilità di non essere degradati, rimangono

attivi e in alcuni casi propagativi, quindi sono circolativi e propagativi quindi possono anche

moltiplicarsi nell’interno anche se questo è raro, l’emolinfa funziona come serbatoio per la

conservazione in forma infettiva delle particelle virali del periodo di vita del vettore successivo

all’acquisizione durante il quale la loro degradazione è rallentata dall’interazione con una proteina

che è prodotta da un batterio endo simbiotico, questo è stato studiato per un virus. Come avviene

questo passaggio? La parte sotto è lo schema che lo spiega, queste sono ricerche condotte in

California da un virologo-entomologo cominciate + di 20 anni fa, ed è arrivato ad una

comprensione di questi meccanismi: le particelle virali ingerite con la linfa, a contatto con la

membrana plasmatica dell’intestino si legano a specifici recettori proteici presenti nella membrana e

provocano dei meccanismi di endo citosi come avviene per tanti altri fenomeni a livello cellulare, si

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dovevano tutte queste vescicolette fino a che si è visto che erano gli stessi meccanismi e quindi con

questo meccanismo dell’endo citosi si creano delle vescicolette che comprendono le particelle virali

e le inglobano, questa è la cavità dell’intestino dove sono state ingerite le particelle, vengono

inglobate e vengono passate all’emocele, poi il passaggio dall’emocele alle ghiandole salivari è un

po’ a rovescio, ma è la stessa cosa. Quindi dall’intestino lo attraverso a va a finire nell’emocele

dove avviene un altro processo simile, anche qui c’è il riconoscimento del virus, c’è il passaggio

delle particelle alle ghiandole salivari, quindi tutto questo periodo che può essere 1-2-3 gg è il

periodo di latenza che varia a seconda del virus,m a seconda delle condizioni ambientali, di T etc.

Questo è uno schema di un afide che ha ingerito per esempio il nanismo giallo dell’orzo che una

volta si considerava, era una specie con tanti ceppi, adesso si è capito che sono specie di virus

diversi e addirittura possono provocarla in generi diversi, qui apparentemente fa vedere che in

quella pianta c’è una infezione mista, quindi ogni particella rappresenta una specie diversa, l’afide

ingerisce queste particelle diverse, abbiamo visto che passano nell’intestino, ma quando arrivano

alla fine dell’intestino succede che alcune vengono eliminate altre passano l’emocele perché ci sono

i siti di riconoscimento, non tutte passano, si è scoperto che c’è una specificità molto stretta,

dall’emocele devono entrare nelle ghiandole salivari e anche qui c’è un’altra selezione, quindi in

questa trasmissione abbiamo una elevata specificità che nel caso di questo virus si è visto così.

Il nanismo giallo dell’orzo ad esempio, quest’anno è abbastanza presente, è una malattia nell’orzo

importante che provoca ingiallimenti e del nanismo, se l’infezione avviene dopo la semina siccome

è un virus che va su tutte le graminaceae note, gli afidi possono prenderlo anche fuori dalla coltura e

lo può portare dentro alla coltura e quindi partono dei primi focolai, se arriva il freddo le piante si

bloccano e gli afidi muoiono e quando ritorna la bella stagione cominciano a vegetare le piante e

poi arrivano gli afidi, quest’anno sembra che sia successo che probabilmente la stagione mite

invernale ha fatto si che gli afidi non siano masi morti, quindi da quei primi focolai ne hanno poi

certi molti altri e che adesso si vedono già, se la malattia è molto estesa può creare problemi molto

gravi. Questo è il nanismo del frumento che è trasmesso da un cicadellide, è un gemini virus, un

virus fatto da 2 particelle, come virus di questo gruppo c’è questo e il tomato yellow ‘’herk’’ che

noi non ce l’abbiamo, ma è soprattutto diffuso in Sicilia, sardegna, in zone abbastanza calde.

Ci sono anche le trasmissioni da acari che da noi sono importanti per 2 virus: striatura del frumento

che è trasmesso da un ‘’eliofile’’ che non si vede a occhio nudo, è visto al microscopio a scansione

e si deve vedere con il binoculare se è presente, questo è un virus che normalmente si può trovare in

autunno e raramente lo si vedeva a maggio, quest’anno l’abbiamo trovato che è un po’ presto,

quindi è legato al cambiamento della stagione. Tutte queste cose che vi sto dicendo adesso sono

tutto il risultato tra le connessioni che coi sono tra la pianta ospite, vettore e ambiente, è tutto un

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intreccio, si conoscono le condizioni sperimentali, le condizioni di campagna sono meno facili da

fissare. Un altro gruppo di vettori importanti sono i nematodi, i nematodi hanno una modalità di

trasmissione che potremmo chiamare semi persistente, ci sono 2 gruppi: i nepo virus e i tobra virus

le specie che sono vettori sono soprattutto 3, le particelle virali che vengono prese dalle radichette

delle piante infette rimangono negli stiletti, non sono persistenti, però in questi stiletti c’è un odonto

stilo che è una parte abbastanza profonda in cui possono rimanere parecchie settimane, anche dei

mesi. La cosa che si è vista con i nepo virus è che sono anche trasmessi per seme, compiscono i

piccoli frutti e certi ricercatori inglesi hanno visto che sono presenti nei meristemi, una volta si

diceva che i virus non invadevano i tessuti meristematici e in base a questo c’era il risanamento

mediante coltura di meristemi, questo non è vero sempre, per alcune specie e per alcuni virus può

essere così, ma in questo caso loro hanno visto ed era logico: siccome pungono le radichette molto

giovani, pungono anche nei tessuti meristematici, quei tessuti erano infetti, poi hanno visto che le

piante anche a livello apicale avevano i meristemi infetti e uno dei sintomi non diagnostico è che

quando tu inoculi un chenopodium con un virus che non sai che cosa è, se quel chenopodio prende

una distorsione apicale forte noi sappiamo che potrebbe essere un nepo virus perché quella

distorsione è provocata dal fatto che l’apice vegetativo, ma anche meristematico è infetto, è anche

logico pensare che anche i seme possano essere infetti.

Loro fecero delle indagini su tante piante spontanee che erano nelle colture che a loro interessavano

dove hanno trovato che per questi nepo virus infettavano anche piante spontanee e in +

producevano seme infetto, i nematodi ci mettono degli anni ad allargare il cerchio però siccome

queste erano colture legnose come la vite, veniva fuori che il virus si salvava.

Questo è per fare vedere che una dispersione di seme infetti in un campo rappresenta tanti sorgenti

di inoculo per afidi vettori, questo è uno schema applicabile al virus del mosaico del cetriolo CMV,

quello che ha tantissimi specie, genoma quadripartito, facilmente ricombinato, vorrebbe fare vedere

da una specie spontaneo ci siano tutte queste possibilità, ha tante opportunità di incontrare anche

ceppi diversi e qualcuno può avere una ricombinazione particolare che fa si che in una specie

sopravvive che magari prima non sopravviveva oppure diventa + aggressivo.

Questa è una lattuga affetta dal mosaico della lattuga che è un virus che si trasmette per seme e per

afidi nella modalità della non persistenza, è una malattia abbastanza importante che non si riusciva a

debellare e in California dove il clima è mite avevano dei problemi enormi, nonostante facessero un

seme selezionato con piante seme e hanno visto con una indagine che bastava un seme su 30.000

per creare malattia, siccome erano condizioni ottimali per gli afidi bastava un seme nella coltura per

avere una sorgente di inoculo che diffondeva la malattia, quindi vuol dire che non dipende solo

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dalla percentuale di trasmissione perché + bassa di così non si poteva avere, nonostante questo in

determinate condizioni e in determinati ambienti causa malattia.

Ultima modalità di trasmissione: trasmissione per polimixa, il virus si trova all’interno del protozoo,

il protozoo si attacca alla radichetta e rovescia all’interno il contenuto e inizia l’inversione, la

sintomatologia è a chiazze e la malattia è nelle zone dove c’è + acqua perché i protozoo necessitano

di acqua.

Rizomania: bin necrortic yellow beng che ha il genoma suddiviso il 4 particelle, a volte 5 e questo è

un sintomo molto forte.

Orzo con altri virus sempre con la stessa modalità di trasmissione della polimixa graminis, dx

varietà resistente, sx suscettibile.

(prof. Stefani) è importante sapere come i virus si moltiplicano nella cellula vegetale, con quale

modalità e queste cose sono utili per quanto riguarda la lotta ai virus e il fatto del silenziamento

genico, la volta scorsa avevamo iniziato a parlato delle localizzazioni all’interno della cellula, i dna

virus vanno nel nucleo gli rna virus vanno nel citoplasma, principi generali di trascrizione: il dna

viene trascritto in mrna, viene poi tradotto nella proteina, è necessario poi avere una sequenza

promotrice, promoter, avere una o + regioni codificanti e un segnale che vada a terminare la

trascrizione, queste cose sono necessarie anche a livello dei virus, nulla cambia come principi

generali, quello che cambia è la struttura biochimica degli acidi nucleici. Di norma l’mrna, quello

che è a disposizione nelle cellule vegetali è un mrna caratterizzato per avere un cap all’estremità 5’,

mentre ha una coda poli adenilata nella estremità 3’, in questo modo l’mrna può venire

riconosciuto, ma non solo in questo modo viene anche stabilizzato, il fatto di avere queste 2

conformazioni lo stabilizza e non lo fa degradare e rende la traduzione molto + efficiente.

L’rna virale, i fito virus sono in genere a singolo filamento rna plus, non è vero che non abbiano il

cap e non abbiano la coda poliadenilata, ci sono parecchi virus che non hanno ne l’una ne l’altra, ma

abbiamo altri virus che hanno la cuffia e non hanno la loda poliadenilata o viceversa, abbiamo tutte

le possibili situazioni. Vediamo di vedere cosa succede normalmente quando abbiamo la presenza

di una cuffia e di una coda poliadenilata: la traduzione dell’mrna ad una proteina segue

normalmente questi passaggi: abbiamo la regione codificante 5’3’, poi abbiamo un codone di

partenza AUG che codifica per la metionina, ma abbiamo anche un codone stop e il codone stop

*** non è uno solo, sono almeno tre, l’efficienza di questo codone stop non è sempre al 100%, c’è

un codone stop che stoppa sempre, altri codini hanno efficienza inferiore al 100% e questo avviene

proprio nei virus, alcuni codini terminali a seconda dei nucleotidi che hanno a monte possono essere

baipassati, quindi continua ancora la traduzione, un altro fatto importante dal punto di vista

conformazionale c’è interazione molecolare tra la cuffie e la coda poliadenilata, questa interazione

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c’è sempre anche quando non c’è’ la cuffia, ma c’è la coda o viceversa, è una interazione questa che

rende la molecola molto + stabile, di norma avviene che nella zona della cuffia una unità

ribosomiale, una unità con alfa esse, riconosce e si lega a questa porzione e inizia a scorrere lungo a

questa sequenza nucleotidica fino a raggiungere e a riconoscere il codone di partenza, a questo

punto si forma un complesso che attira un secondo ribosoma un po’ + grosso 60S e si forma un

complesso ribosomiale che può iniziare la traduzione della proteina, inizia con l’AUG scorre via via

producendo un polipeptide sempre + grande fino ad arrivare al codone finale, in questo caso UAA,

una volta arrivato allo stop la traduzione si interrompe e il complesso ribosomiale a 2 subunità si

staccano e si separano e sono pronti per una nuova traduzione. Questo avviene nella normalità delle

cellule eucariote, avviene anche quando l’rna virale è provvisto di cap, è provvisto di coda

adenilata, ovviamente di cosa ha bisogno un virus all’interno della cellula vegetale? Ha bisogno di

ribosomi, dei nucleotidi tutte cose che trova dentro alla cellula, lui fornisce solo lo stampo nella

normalità, le modalità di traduzione dell’mrna sono almeno 8, alcune molto comuni altre + rare,

sono strategie che i virus hanno sviluppato durante l’evoluzione e sono strategie che dipendono non

solo dal tipo di rna virale, ma dipendono anche da che cosa la cellula vegetale mette a disposizione

e dalle modalità infettive del virus, vedremo che i virus si spostano da cellula a cellula e hanno

bisogno di proteine di movimento, altri virus non si spostano, quindi non hanno bisogno di queste

proteine di movimento, la traduzione del loro rna deve essere fatta in base all’ecologia.

In ogni caso sia la struttura della cuffia che quella della coda poli adenilata sono essenziali per una

traduzione che sia efficiente e ottimale, queste strutture dove sono formate? Uno potrebbe pensare

che un rna virale non ha cuffia, non ha coda, arriva dentro e la può acquisire, non è vero perché

cuffia e coda poliadenilata vengono attaccate normalmente all’interno del nucleo e noi sappiamo

che all’interno del nucleo vanno solo i virus a dna perché hanno il segnale che permette a questi di

passare la membrana nucleare, gli altri non vengono ne trasportati, quindi esiste anche un sistema di

ciaperonine per la stabilizzazione degli acidi nucleici, abbiamo anche qui la formazione di

complessi nucleico-proteici però non esistono in nessuna cellula vegetale delle ciaperonine che

portino questo rna virale in qualche modo a contatto con il nucleo per utilizzare delle potenzialità

presenti all’interno del nucleo come quella della poliadenilazione, gli altri a rna rimangono dentro al

citoplasma però hanno delle strategie che adesso vediamo subito che possono essere

tranquillamente tradotti, in ogni caso questo rna virale deve essere in qualche modo modificato, così

non viene riconosciuto come mrna e una delle modificazioni è quella della stabilizzazione della

molecola di rna, qui abbiamo una visione di insieme: il solito virus a dna che va dentro al nucleo, il

solito virus a rna che va dentro al citoplasma, nel nucleo l’mrna viene fornito di una cuffia e viene

fornito di una coda poliadenilata perché solamente all’interno del nucleo abbiamo la metil

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transferasi e a gualinin transferasi, non le abbiamo fuori, a questo punto noi dobbiamo fornire

queste 2 addizioni all’rna virale. Ci sono diversi siatemi, qui ne sono indicati solo 3, i principali

sono questi, alcuni rna virali hanno al loro interno la possibilità di trascrivere la guanilin transferasi

e la metil trasferasi, quindi l’informazione ce l’hanno già al loro interno e in questo caso non c’è

bisogno di andare a cercare il nucleo, una volta che l’rna è iniettato o è presente nelle cellule si

attivano questi 2 enzimi e forniscono la cuffia, il cap; un’altra cosa molto carina è chiamata cap

snatching: alcuni rna virali hanno la possibilità di rubare la cuffia ad altri rna questo per una

questione di affinità con un enzima di taglio che ha una elevatissima affinità verso altre sequenze

ribosomiali, quando le incontrano tagliano e la cuffia viene inserita in quell’rna che è fornito per

l’enzima di taglio, sempre all’interno del citoplasma questo, quindi vediamo questi rna anche

vegetali che vengono portati fuori dal nucleo forniti di cap e coda poliadenilata, abbiamo che alcuni

rna virali hanno la capacità di tagliare questa cuffia e auto inserirla. Poi abbiamo una modalità che è

molto comune nei virus perché hanno la possibilità di legare alle estremità 5’ alcune proteine che

come conformazione hanno la funzione di cuffia, la mimano è proprio una questione

conformazionale, sterica ed elettrica, le codificano loro all’interno del citoplasma, è una proteina

loro e questo ancora per stabilizzare la sequenza nucleotidica e per rendere la trascrizione molto +

efficiente, è chiaro che la trascrizione può avvenire comunque, senza cap non è detto che non ci sia

trascrizione però non è efficiente, dura poco, la molecola di rna va incontro a degradazione, ad

interazione con altre molecole. Questo avviene quindi all’estremità 5’, abbiamo un cap che viene

formato, lo snatching e il mimetismo di questo sito 5’, per quanto riguarda l’estremità 3’ noi

abbiamo la necessità di avere qualcosa che assomigli ad una coda poli adenilata, diversi virus non

hanno la cuffia, ma hanno la coda poliadenilata, altri invece hanno la possibilità di creare una

struttura che non è una poli adenilazione, ma è una sequenza nucleotidica molto strana che va a

stabilizzare la coda e va ad interagire con la parte iniziale, questo avviene solo all’estremità 3’, è

una struttura simile al t-rna, essenzialmente serve per proteggere la parte finale.

Poi ci sono queste anse omega anche se non sono comunissime nei fito virus, possono essere

formate sia all’estremità 5’ sia all’estremità 3’, il meccanismo per cui queste anse ad omega

funzionino come stabilizzatrici e come fattori di efficienza della traduzione non lo sappiamo ancora,

sappiamo che ci sono, qui è citato il virus del nanismo giallo dell’orzo che è uno di quelli che

abbiamo visto, è un virus abbastanza particolare insieme al modo di trasmissione, da vettore a

pianta sia come modo di trasmissione da pianta a pianta, per esempio questo lo possiamo trovare

anche nello xilema, è uno dei rarissimi virus xilematici, comunque non sappiamo se queste note

epidemiologiche possono essere importanti e legate alla presenza di queste anse ad omega.

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Vediamo le strategie genomiche e partiamo dall’esempio + conosciuto che è quello dei geni

vegetali: qui abbiamo un classico gene vegetale, 4.500 nucleotidi, i geni vegetali tipicamente hanno

4/5.000 nucleotidi, come al solito c’è una sequenza promotrice, c’è una regione codificante e in

codone terminale, qui abbiamo l’rna, l’mrna che viene ottenuto, la solita cuffia, la coda poli

adenilata, noi notiamo degli introni, elementi spaziatori che dividono gli esoni, avviene lo splicing

con la rimozione degli introni e si ottiene così sequenza e questa è la normale procedura che noi

conosciamo dalla genetica. La prima differenza da notare è che i virus hanno queste sequenze

policistroniche, poligeniche, mentre nelle piante no e questo è uno dei problemi quando dobbiamo

parlare di traduzione dell’mrna, come facciamo ad avere diverse proteine e in momenti diversi.

Partiamo quindi dai virus a dna e già qui abbiamo una cosa diversa, i virus hanno la necessità

certamente di esprimere + di una proteina, come minimo esprimono 3 proteine ma in gente sono

5/6/7/15/12 e in questo caso vediamo un gemini viride, un virus a genoma bipartito quindi possiamo

avere 2 componenti di dna che possono essere espresse partendo da delle zone promotrici, quindi i

virus a dna hanno diverse regioni promotrici, qui il problema è dove partire e dove terminare, qui

abbiamo l’rna che viene ottenuto e qui vediamo lo splicing e anche qui è il caso di un virus a rna

tripartito, anche i virus a rna spesso hanno il genoma segmentato però sui tre frammenti possiamo

avere in ciascuno + di una zona promotrice e + di una zona sterminatrice (codone di stop), strategie

di traduzione: la prima strategia è quella di tradurre una nota sequenza in una poli proteina, in

pratica l’rna virale inizia ad essere tradotto a destra, continua la traduzione fino a che non arriva alla

fine, quindi produce una sequenza aminoacidica chiamata poliproteina dove all’interno ci sono le

sequenze di + di una proteina, all’interno però abbiamo anche una proteasi, in pratica una volta

prodotta questa poliproteina la proteasi si mette in funzione e per auto proteolisi si frammenta la

poliproteina in + di un frammento 2/3/4/5/6, quale è il problema di questo modo di traduzione? Il

problema è che abbiamo delle proteine prodotte nello stesso momento e nella stessa qnt, mentre

nell’ecologia virale potremmo avere necessità di avere una proteina prodotta al momento

dell’inoculazione, un’altra proteina al momento della replicazione, un’altra proteina al momento del

trasferimento da una cellula all’altra, un’altra proteina al momento dell’incapsidamento quindi

questo meccanismo va bene in alcuni casi, non va bene in altri casi quando dobbiamo avere una

proteina a disposizione in un momento diverso rispetto alla sintesi di un’altra proteina. A volta

quando le proteine servono in momenti diversi e sono prodotte contemporaneamente alcune di

queste sequenze polipeptidiche vengono bloccate, quindi si verificano casi in cui una poliproteina

va incontro ad auto proteolisi, uno o 2 polipeptidi vengono usati immediatamente, altri rimangono

quiescenti e in questo caso li blocca delle ciaperonine che le tengono bloccate per esempio durante

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il trasferimento di un virione o di rna fintanto che non è stato trasferito e magari la seconda proteina

si mette in attività perchè magari serve per produrre il vaccino.

La scansione scorrevole: abbiamo in questo caso la solita sequenza che deve venire tradotta,

possiamo avere all’interno + di un codone stop, ne abbiamo 3, il codone UAA ha il 100% di

efficienza quindi comunque e dovunque lo si trovi lì si interrompe la traduzione, poi abbiamo altri 2

codoni di stop UGA e UAG che non hanno il 100% di efficienza cioè quando la traduzione arriva a

quel codone stop può darsi che si interrompa e può darsi che non si interrompa, dipende dal codone

precedente, se abbiamo GC dopo e abbiamo un particolare codone AUG prima può baipassare, può

scorrere lo stesso e non tenere in considerazione il codone di stop, quindi viene prodotta in questo

caso una poliproteina, questo è un meccanismo molto utile perché non avviene sempre l’uno o

l’altro avviene per esempio per l’80% della proteina prodotta si interrompe, il 20% continua, quindi

possiamo avere nello stesso momento una poliproteina e la proteina 1, la poliproteina poi verrà

scissa in 2 proteine in un momento successivo, in questo modo possiamo avere a disposizione

sempre delle proteine in momenti diversi e soprattutto in quantità diverse. Quando parleremo di

proteine di movimento, queste devono essere prodotte dal virus perché deve muoversi e spostarsi da

una cellula a un’altra e lo fa tramite proteine di movimento, proteine che legano l’rna, formano

questi complessi nucleo proteici, quindi il fatto di avere come proteine di movimento come

traduzione di una sequenza per le proteine di movimento che possa dare origine a diverse proteine

tutte però con la stessa funzione è utile perché una proteina 1 può legarsi all’rna, l’altra invece dà i

segnali di attaccamento alla membrana del reticolo endoplasmico, e le percentuali di queste proteine

all’interno della cellula determinano la velocità e l’efficienza del trasferimento di un virione o di un

rna virale da una cellula all’altra. Qui vi dà un dato che questo meccanismo di scorrimento compare

dall’1 al 10% delle traduzioni, quindi è una cosa che accade abbastanza regolarmente.

Qui abbiamo il nostro rna con un codone stop UAG, UAA e UAA, quindi UAA ha il 100% di

efficienza quindi sicuramente qui si ferma, l’efficienza di UAG dipende da un lato dai codoni che

precedono e che seguono, da un altro lato anche dalle condizioni e dalle interazioni che ci sono a

livello del citoplasma sulla efficienza della traduzione. Quindi abbiamo che la stessa tipologia di

frammento presente contemporaneamente nel citoplasma in una abbiamo proteina 1 e proteina 2,

nell’altra abbiamo la poliproteina, tutte nello stesso momento tutto mediato da fattori citoplasmatici.

Il primo evento che accade quando un virus è iniettato dentro a una cellula è la decaspidazione che

avviene in tempi diversi e in modelli diversi e mette a contatto ambiente del citoplasma con

sequenze virali. Quale può essere la utilità di avere questi 2 scorrimenti contemporaneamente?

Avere per esempio una proteina o delle proteine che servono per il capside, ma avere anche una

piccola percentuale, il 2/3/4% di una poliproteina che termina con la coda poliadenilata perché nella

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formazione del capside la poliadenilazione serve per il riconoscimento del virus-vettore cioè c’è una

specificità dell’interazione virus-vettore e il vettore deve riconoscere il virus e il riconoscimento

avviene tramite queste code, quindi il fatto che nel capside ci siano queste unità che saranno il 95-

98% + qualche poliproteine che finisce con una coda poliadenilata permette alla struttura del

capside permette di avere delle molecole, dei determinanti esterni di riconoscimento.

Frame schift: è un altro tipo di scorrimento che si chiama +1 o –1 frame schift, in pratica possiamo

avere delle regioni che si sovrappongono, è simile a quello di prima ma prima non avevamo

sovrapposizione, qui nella sovrapposizione abbiamo un esanucleotide di sovrapposizione,

l’esanucleotide è caratteristico perché contiene 4 uracili, poi prima o dopo ha altre cose a seconda,

quando inizia la traduzione con il solito codone di inizio si produce la proteina 1, arriva fino alla

fine e il polipeptide viene staccato e non succede nulla, durante questi frame schift può avvenire che

arrivando a queste 4 U, passando indietro e in avanti cioè +1 e –1 non cambia la sequenza cioè 3 U

rimangono 3 U quindi è sempre la fenilalanina, quindi quando arriva a questo esanucleotide può

continuare la sua traduzione nella parte superiore, quindi si forma una poliproteina, una proteina 1 +

la proteina 2 con in comune la fenilalanina, questo sarà poi un sito di digestione.

Poi abbiamo un’altra modalità chiamata leaky scanning che avviene quando abbiamo 2 ORF una

sovrapposta all’altra, quindi non è solamente come qui un problema di una brevissima sequenza

condivisa, ma abbiamo invece una sovrapposizione di ORF e anche qui possono avvenire diversi

casi, un caso in cui la traduzione inizia con la solita AUG e termina e si produce la proteina 1,

l’altro caso in cui si inizia solamente la traduzione del secondo ORF oppure abbiamo la possibilità

di una separazione, c’è una interazione a livello di questo primo codone, sono delle interazioni

molecolari per cui qui avviene una separazione.

Poi l’ultimo caso, finora abbiamo visto che tutte queste sequenze venivano tradotte

indipendentemente da dove e come erano, c’era la possibilità che queste proteine vengono bloccate,

vengano legate alle ciaperonine, ma i virus fanno anche un’altra cosa molto caratteristica, abbiamo

la nostra sequenza e i virus possono tradurre la prima parte, ma non tradurre la seconda, cioè

produrre nella seconda parte o nella terza quello che chiamiamo rna sub genomico, questo è

caratteristico di quei virus che necessitano di trasferirsi una volta inoculati nel mesofillo, hanno

bisogno di andare completamente da un’altra parte, per esempio le ultime proteine ad essere

espresse sono quelle del capside,m succede che vengono espresse all’inizio delle metil esterasi,

delle elicasi, ma non le proteine del capsidio, quindi c’è la produzione continua di rna negativo sub

genomico mano a mano che le prime ORF vengono tradotte e solamente in un secondo memento

quando il virus si trova in altre cellule viene tradotto l’rna sub genomico, questa è una caratteristica

molto diffusa dei virus. 28

Trasmissione e traslocazione dei virus: la trasmissione dei virus cioè come i virus si propagano da

una pianta all’altra, la diffusione anche a livello geografico e da considerare innanzitutto la modalità

di propagazione vegetativa, quindi marze, gemmi, bulbi, tuberi, stoloni, il seme, ovviamente questo

dipende da virus a virus, non tutti i virus si trasmettono per seme, non tutti virus di trasmettono per

bulbi, vedremo nella parte speciale 2 o 3 malattie e come questi virus specifici come la sciarka

come si trasmette, ci sono dei virus della patata che non si trasmettono attraversi tuberi, altri si.

Poi vettori animali, oltre il 50% si trasmettono con questa modalità, non tutti, afidi, cicadellidi,

acari, nematodi, funghi inferiori, tenendo presente che alcuni virus sono in grado di moltiplicarsi

all’interno del loro vettore, poi ci sono altri modi di diffusione per esempio il polline, innesto, ferite

durante temporali vento, le foglia che si strofinano possono creare micro ferite e il virus può

penetrare e manipolazione degli operatori come la scacchiatura del pomodoro per esempio (togliere

i germogli ascellari). Volevo parlare della diffusione dei virus nella pianta: i virus sono in genere

riconosciuti come micro organismi che causano malattie sistemiche, in genere sono malattie

sistemiche, quindi il virus è vero che può produrre delle proteine di patogenecità che possono essere

traslocate e diffuse nelle diverse parti della pianta, ma è anche vero che il virus stesso tende a

diffondersi dalla cellula in cui è penetrato alle altre cellule, bisogna capire come fa a diffondersi, noi

possiamo avere tre casi per quanto riguarda l’infezione virale: l’infezione localizzata (tabacco ring

spot virus) come vedete fa delle macchie che non diffondono, poi abbiamo l’infezione sistemica

come il potato hot top virus che comincia a diffondersi da foglia a foglia, non è localizzata.

L’infezione localizzata è una infezione che assomiglia una interazione incompatibile, il virus

penetra viene riconosciuto c’è una HR in pratica, le cellule vegetali muoiono e causano questa

necrosi, questa è certamente una malattia ma non sistemica, sono lesioni localizzate, quindi è

assimilabile all’interazioni incompatibile. Altre volte noi abbiamo delle infezioni localizzate che

non sono necrotiche, ma sono solo clorotiche, punteggiature clorotiche, agnellature clorotiche, ma

sempre localizzate, in questo caso non si parla di HR, ma si parla di reazioni incompatibile

localizzata perché probabilmente almeno uno dei virus che è stato riconosciuto non ha la capacità di

muoversi perché non ha la capacità di sintetizzare le proteine di movimento e rimane finchè la

foglia non va in senescenza, ma non causa mai necrosi, sono virus che causano maculature,

macchiettature clorotiche diffuse sempre ben localizzate. Poi abbiamo la infezione subliminale che

sono infezioni molto leggere, la patate ne ha almeno 2 o 3, c’è ad esempio il virus del mosaico

leggero della patata, in pratica noi notiamo delle piccole aree appena appena clorotiche, ma da lì

non succede nulla, infezione subliminale può essere dovuta alla incapacità del virus di diffondersi,

dalla incapacità di produrre efficienti molecole di patogenecità, dalla assenza di proteine di

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movimento oppure dalla incapacità di relazionarsi con i plasmodesmi, quindi sono infezioni

subliminale per esempio le infezioni virali in ospiti un po’ strani, non usuali.

La reazione subliminale può avvenire quando le cellule contigue vanno incontro a silenziamento

genico, frammenti di dna possono stimolare il processo di silenziamento genico, quindi entra un

virus in una cellula e inizia a trasferire l’rna virale nella cellula contigua, l’rna virale da origine

nella cellula contigua il silenziamento genico e il virus su blocca solo a quella cellula o a quelle

poche cellule coinvolte. Poi abbiamo l’infezione sistemica o generalizzata, sono infezioni che

causano nanismi, mosaici estesi, deformazioni e tutte quella alterazioni gravi della pianta, ci sono 2

fasi nel movimento del virus, il virus viene per esempio inoculato tramite un cicadellide, un cixide,

un afide in una zona molto ristretta di un mesofillo o di un germoglio e il virus può trasferirsi a

breve distanza da cellula a cellula oppure può anche trasferirsi a lunga distanza e la chiamiamo in

questo caso diffusione sistemica e a lunga distanza si trasferisce attraverso i tessuti conduttori,

essenzialmente il tessuto floematici, quindi attraversi i fasci cribrosi, ma alcuni virus hanno la

possibilità di essere trasferiti attraverso trachee e tracheidi, questo è uno dei pochi casi in cui il virus

si può trovare in un ambiente che non è vivo, una cellula non viva, vediamo la rappresentazione:

questa è una cellula vegetale schematizzata: questo è un tessuto fogliare, la cellula vegetale che non

è isolata, ma sono tutte in comunicazione e in comunicazione con degli elementi floematici, quindi

questa particelle virali tramite il solito vettore afide o cixide viene inoculato all’interno di una

cellula ha la possibilità anche dopo breve tempo di muoversi o da una cellula a una cellula vicina

oppure da una cellula all’interno del floema, questa immagina è un po’ fuorviante perché sembra

che il virus in blocco con tutte le sue strutture passi da una cellula all’altra, non è così, questa è una

rappresentazione schematica ma il virus può passare come rna, come complesso rna proteico, come

virione, in diversi modi. E come fa a passare? Essenzialmente la capacità di diffusione è data dal

fatto che sono possibili interazioni con i plasmodesmi, strutture di comunicazione da cellula a

cellula, utilizzando questo passaggio il virus o parte di esso può trasferirsi da una cellula all’altra,

oppure alcuni virus hanno delle proteine che mimetizzano strutture tubulari, sono proteine tubulari

che riescono ad infilarsi attraverso le micro fibrille della parete vegetale e creare dei tubi dove

questi virus possono passare, sono dei virus molto piccoli a struttura tondeggiante. Quindi la

maggior parte passa attrarsi i plasmodesmi, un plasmodesmi è una canale ci sono delle molecole di

astina dentro, è tenuto in tensione, non è un tunnel e il plasmodesmi ha la possibilità anche di

allargarsi o restringersi.

il trasferimento di un virus da cellula a cellula: c’è un micro ogni ora, però quando il virus si

trasferisce lungo il sistem,a floematico la sua capacità è molto maggiore di alcuni cm per ora, quindi

in una giornata il virus percorre diverse decine di cm, i virus per regolare il trasferimento producono

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delle proteine di movimento, è una delle prime cose che fanno i virus e una delle prime proteine

prodotte è la replicasi e poi proteine di movimento. Ecco lo schema: abbiamo uno schema che

indica una cellula, la seconda cellula in comunicazione con un plasmodesma che è una apertura

all’interno della prete cellulare, c’è il desmo tubulo collegato con il reticolo endoplasmico e ci sono

delle molecole di actina che tendono a mantenere pervio il plasmodesma e in ogni caso lo possono

modificare come diametro, come apertura, il movimento di particelle virali da una cellula all’altra

avviene come complesso, complesso proteina di movimento-rna quindi un complesso nucleo

proteico, esistono anche altre proteine accessorie che hanno diverse funzioni, alcune indirizzano

questo complesso verso strutture che poi si collegano con il citoscheletro che indicano la via per il

plasmodesma, altre legano questo complesso al reticolo endoplasmico e al desmo tubulo quindi

effettuare uno scorrimento lungo queste membrane, sono proteine queste che molto spesso formano

un loop che si collega all’interno della membrana e segue la membrana e porta all’interno, queste

proteine di movimento sono proteine che hanno delle forti interazioni con le molecole di actina che

avvolgono in questo modo il desmo tubulo e permettono la modifica della conformazione, quindi

allargamento o restringimento del desmo tubulo, se non si allargasse un po’ non passerebbe. Una

volta passato questo complesso nucleo proteico, si ritrova quindi nella cellula sana e nella cellula il

complesso si separa e può iniziare la traduzione dell’rna virale.

Questo è il movimento all’interno della cellula a breve distanza, a lunga distanza invece c’è un

problema diverso da superare: mentre da cellula a cellula l’ambiente è idoneo, identico, da cellula a

tubo cribroso l’ambiente è diverso come osmolarità, come biochimismo, il trasferimento delle

particelle virali all’interno del fascio cribroso avviene come complesso, un complesso ternario di tre

subunità dove è presente una proteina di movimento, il solito rna ed è presente anche una proteina

del capside, quindi è un complesso molto + compatto e molto + stabile perché l’ambiente all’interno

del fascio floematico o tubo cribroso è un ambiente molto + selettivo, in + è presente associato a

questo complesso un polipeptide di origine vegetale che conferisce stabilità a tutto il complesso e

permette un attaccamento veloce e la non attaccabilità, la non degradabilità di questo complesso

all’interno del floema mentre viene traslocato. C’è il problema inverso su cui stanno lavorando i

virologi e vedono ancora chiarire, come fa il virus o quelle parti di esso a passare dal tubo cribroso

di nuovo alle cellule, è poco chiaro, probabilmente passa attraverso delle vie dove passano i soluti,

oppure passa quando vengono formate le cellula accessorie dei fasci cribrosi, un’altra cosa da dire

per quanto riguarda la lotta alle virosi ed è interessante notare e anticipare che la struttura dei

plasmodesmi è sicuramente diversa da cellule meristematiche in attiva divisione, da cellule mature,

noi sappiamo da tempo che gli apici meristematici in genere non hanno virus, i virus non ci vanno

perché non è possibile questo trasferimento, il tessuto fogliare per esempio ha 2 momenti, un

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momento di consumo, non riescono a produrre nulla e un secondo momento produzione,

produzione di energia, questi 2 momenti che individuano la fase giovanile del tessuto vegetale da

una fase matura, adulta sono differenziabili anche dalla morfologia e dalla struttura dei

plasmodesmi, mentre le cellule meristematiche, quelle giovani, indifferenziate hanno dei

plasmodesmi molto stretti non penetrabili da questi complessi, la cellula quando va incontro a

distensione e a maturazione in queste cellula avviene la fusione di +è plasmodesmi in una struttura

molto + complessa, quindi c’è un reticolo di plasmodesmi con numerose zone di fusione tra un

plasmodesma e l’altra che sono molto + larghe, ecco allora che nel tessuto già differenziato è molto

+ facile per i virus il trasferimento da una cellula all’altra, nel tessuto giovane il virus non va arriva

fino a un certo punto e poi si ferma, questo è uno dei motivi per cui nella lotta alle virosi si

utilizzano le tecniche di micropropagazione per risanare il materiale vegetale.

La formazione dei fasci vascolari in alcune piante fa si che il tubo cribroso e la trachea traggano

origine da una stessa zona, questo è un punto di contatto che permette ad alcuni virus, sono

pochissimi, di passare nelle trachee in via di formazione, abbiamo detto che ci sono alcuni virus che

possono essere presenti anche nello xilema e diffondersi attraverso lo xilema, questi virus

utilizzando questa localizzazione vanno a colonizzare le trachee o le tracheidi in via di formazione,

quando sono ancora prive di lignina, poi queste cellule muoiono e il virus rimane incastrato e si

muove attraverso queste trachee e può andare a localizzarsi in altre zone.

Seminario dott. Prodi: parleremo del fenomeno dell’iper virulenza, vedremo anche le applicazioni

di una tecnica di gene silencing per uno studio di una chinasi CPKK1 e CPKK2, bisogna prima

conoscere il patogeno che è un ascomicete filamentoso, questa è la tipica colorazione della piastra,

gli elementi riproduttivi sono sia conidi quindi una riproduzione asessuata che sessuata: peritecio

struttura globosa, formato da aschi composti da 8 asco spore, entrambi provocano la malattia, il

micelio in determinate condizioni invadono la sotto corteccia, entrano nel cambio e provocano

enormi problemi di tipo vascolare, nel giro di 50 anni questo fungo ha devastato le coste est

dell’america, 3.5 milioni di ettari sono stati devastati da questo fungo, in Europa è stato importato

nel 38 nel porto di Genova e si diffuse anche in Europa, si notò che non si sviluppava come negli

Stati Uniti, tutti i tentativi di contenimento da un punto di vista agronomico sono risultati inefficaci

fino a che si è scoperto il fenomeno dell’ipo virulenza nel 62’, si scoprì che alcuni cancri venivano

risanati, ovviamente tutta la comunità scientifica contestò questa ipotesi, nel 75’ scoprirono che

questo fenomeno dell’ipo virulenza era associato alla presenza di un rna a doppio filamento, negli

anni 80 e 90 fu caratterizzato in dettaglio, ha le caratteristiche di un virus, fu classificato nella

famiglia ipoviridea genere ipovirus, in realtà fu molto discusso perché non abbiamo presenza di

capside, non abbiamo proteine capsidiche, quindi ha un comportamento + simile a un plasmide,

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quindi l’organizzazione genomica è di un virus a doppio rna, abbiamo 2 ORF, ORF A e ORF B che

poi producono per auto catalisi varie proteine che poi vedremo, in realtà questo è il virus modello

perché in natura sono presenti attualmente tanti virus con caratteristiche generali abbastanza simili e

creano ipovirulenza, questo è il virus modello che viene studiato nei laboratori, è il CHV1

crifonectria ipovirus 1, la cosa interessante è che è in grado di trasmettersi da ceppo a ceppo, quindi

è una caratteristica che può passare da un ceppo a un altro, l’anastomosi è un fenomeno per il quale

avviene tra 2 ceppi diversi una fusione ifale con passaggio citoplasmatico, questo processo è

regolato da geni VIC che determinano la compatibilità o meno di 2 ceppi, nel caso di crifonectria

parasitica è controllato da 6 loci differenti, scambiando il materiale citoplasmatico si passa anche il

virus, quindi il virus che rende ipovirulento il fungo viene passato da un ceppo all’altro e il secondo

ceppo viene reso ipovirulento anch’esso, ovviamente la compatibilità deve essere totale, quando

non avviene questo si crea un setto e quindi non c’è passaggio citoplasmatico, quindi si sono

iniziate anche a livello di campo tentativi di risanamento del castagno, con varie tecniche

agronomiche per cercare di inserire il ceppo ipo virulento, negli ereali americano questo non è

avvenuto, gli areali americani non si sono risanati, 4/5 anni fa avevamo 150 gruppi di compatibilità

vegetativa differenti, quindi questi vari ceppi si incontravano, ma non riuscivano a passarsi il virus,

in Italia andavano dai 30 ai 40 e in questo caso si è riuscito ad avere una situazione di latenza, ormai

in Italia la malattia è endemica, è presente, ma senza danni eccessivi. Un ceppo ipovirulento non è

che non infetti la pianta, o si ferma nella sua diffusione o non crea danni eccessivi, la fitness del

fungo rimane buona però la pianta sopravvive, quali sono gli effetti fenotipici dell’espressione del

virus in crifonectria parasitica? Ridotta espressione della virulenza, una ridotta sporulazione,

fortissima riduzione della pigmentazione, e sono tutti sintomi non accompagnati da una riduzione

della velocità di crescita e la fitness del fungo rimane identica, torniamo alla reazione dinamica del

virus: i 2 prodotti sono la P29 e la T40, dei esperimenti in CHV1 in cui avevamo una delezione o

della P29 o della T40 hanno riportato cmq l’ipovirulenza quindi evidentemente questi non sono

davvero la fonte dell’ipovirulenza, ma nello stesso tempo abbiamo avuto tutti gli altri sintomi:

quindi variazione della colorazione e diminuzione della sporulazione che hanno un ruolo molto

importante, al contrario ceppi di crifonectria parasitica trasformato per la produzione di P29 si è

ottenuta ipovirulenza e tutti gli altri sintomi quindi l’idea è che ci ha una influenza forte però cmq

un effetto pleiotropico, cioè sono stati caratterizzati alcuni geni la cui espressione è modificata dalla

presenza del fungo, ma in realtà i geni coinvolti sono tantissimi per questo parliamo di effetto

pleiotropico, sulla sx abbiamo un ceppo di crifonectria parasitica infetto da un CHV1 chiamato 713,

sulla dx abbiamo un ceppo di crifonectria parasitica infettato con un CHV1 chiamato euro 7, l’uno

modifica l’espressione, sia una sovra espressione che una inibizione di 295 geni, quello di dx 166 e

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solo 80 sono geni di entrambi i virus, quindi è un fenomeno abbastanza complicato. In + di 20 anni

le ricerche non hanno fatto chiarezza quale sia l’elemento e l’attenzione negli ultimi anni si è

soffermata sulle vie di interazione del segnale, si è detto siccome ci sono delle vie che influenzano

su vari processi, in questo caso su saccaromices cerevisie essendoci un effetto pleiotropico e alcuni

geni fanno parte di queste cascate proteiche potrebbe essere comunque importante studiare questo

settore, infatti nella patologia moderna moltissimi lavorano sulle chinasi che ormai è il settore +

studiato nella micologia molecolare, per intenderci questi sono processo in cui informazioni che

vengono all’esterno della cellula, all’esterno del fungo vengono importate all’interno del fungo e

creano cambiamenti metabolici o funzionali del fungo stesso, in questo caso stimoli esterni come

può essere la risposta feromonica, una diminuzione della osmolarità esterna, cambiamenti climatici

esterni portano cambiamenti all’interno del fungo e in questo caso forma una cascata di tipo

chinasico che è regolata da fosforilazione e defosforilazione, in questo caso il meccanismo di

trasmissione del segnale è di tipo feromonica, avremo un feromone di melting tipe opposto, in breve

se in questo caso 2 lieviti in cui abbiamo 2 meting tipe diversi si incontrano, un feromone di melting

tipe opposto e stimola un recettore dell’altro meting tipe, vengono stimolati all’interno del fungo

determinati fattori che portano a una riproduzione di tipo sessuata, avremo quindi una riproduzione

che è diversa, in questo caso succede che un recettore per un rettore A, il feromone viene catturato

da un recettore di tipo proteico, abbiamo una struttura alfa, beta, gamma che con un passaggio da

gtp staccherà la subunità proteica beta gamma e questo innescherà tutta una cascata di segnale

basata sulla fosforilazione e defosforilazione che attraverso determinati passaggi intervengono a

livello del nucleo e influenzano la trascrizione di nuovi prodotti, quindi di nuove proteine, in questo

caso stimoli che portano a una riproduzione di tipo sessuata, quindi tutto ciò che serve a una

riproduzione di tipo sessuato, in questo caso abbiamo in ogni passaggio una fosforilazione

defosforilazione, più che altro si sono studiate delle chinasi, in crifonectria parasitica si è studiata

solo la NK1 che è una proteina implicata nella sporulazione, in nostro intento è anche studiare

proteine a livello delle chinasi chinasi, la proteina che sarà oggetto del nostro studio CPKK1

sintetizzata e scoperta dall’università in California, a questo punto avendo individuato un gene di

questo tipo bisognerà verificarne la funzionalità, quali sono le metodologie? Come si verifica la

funzionalità di un gene in questo caso coinvolto in questo caso nell’interazione virus-fungo?

L’obiettivo è quello di vedere come funziona una eventuale delezione di questa CPKK1 che è una

chinasi e che influenza ha sul fungo, inizialmente si utilizzano eventi di mutagenesi randomizzato

con UV, composti chimici e poi attraverso la trasformazione con librerie genomiche si cercava di

risanare il fenotipo e vedere quali potevano essere i geni colpiti, i geni modificati, invece la seconda

tipologia di trasformazione è una trasformazione integrata alla produzione di protoplasti, se

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digeriamo la parete dei funghi rimarranno i protoplasti e potremo trasformare il nostro fungo con

l’integrazione omologa o non omologa di un gene che noi abbiamo costruito, ovviamente

inseriremo anche un gene di resistenza per verificare se la trasformazione è avvenuta o no, in

crifonectria parasitica quali sono i limiti del knock out genico? Se noi facciamo una delezione dei

geni essenziali per la crescita delle ife questo crea problemi per lo studio del fenotipo, è impossibile

individuare anche eventuali funzioni secondarie, e abbiamo una efficienza di trasformazione molto

bassa, si era individuato un gene una chinasi importante da studiare, ma il knock out non

funzionava, allora si è voluto sfruttare il silenziamento genico post tradizionale, gli organismi

resistono all’introduzione di geni estranei attraverso la degradazione specifica dell’mrna attraverso

un riconoscimento di sequenze omologhe, questo è un fenomeno trasversale, a volte avviene a

livello della trascrizione oggi parleremo di post trascription gene silencing quindi che avviene a

livello post trascrizionale, fu scoperto nel 1990 mentre stava studiando le petunie, semplicemente

voleva aumentare la colorazione di queste petunie, ha trasformato la pianta con una calcone

sintetasi semplicemente per aumentare le antocianine per una colorazione + intensa al fiore e si

trovò come risultato dei fiori o completamente bianchi o striato quindi c’era stata come loro la

chiamavano co-soppressione, una soppressione di questi geni a rna inseriti, lo stesso fenomeno fu

scoperto nei funghi da studiosi italiani e hanno osservato questo fenomeno in neurospora crassa, in

questo caso hanno fatto esperimenti per aumentare la colorazione in neurospora crassa e si

accorsero che alcuni ceppi divenivano bianchi, non viene soppresso solo il gene che voi inserite, ma

viene soppresso il gene costitutivo perché in entrambi i casi le petunie erano già colorate, si voleva

aumentare una funzionalità, se però il risultato è un fiore completamente bianco vuol, dire che si è

avuta una co soppressione, si è soppressa la funzionalità del transgene e del gene costitutivo,

vedremo perchè, oggi osserveremo il fenomeno in neurospora crassa, in questo caso è un transgene

inserito in cui abbiamo la sequenza e l’omologo inverso, nell’altro caso abbiamo altri tipi di

transgeni, in questo caso se noi passiamo a una struttura di rna a doppio filamento avremo una

struttura semi chiusa, quindi un rna a doppio filamento, interviene l’rna polimerasi che è rna

dipendente e questo con l’intervento di un sistema che viene chiamato DICER che è una ribo

nucleasi specifica con l’aiuto della QDE2 che sono delle proteine argonauta, proteina che aiutano il

trasporto, con l’intervento della ribo nucleasi specifica otterremo degli rna silenziati, porzioni di rna

a doppio filamento molto piccole e questo è l’elemento variabile fra piante , funghi e gli altri

organismi che hanno questo fenomeno, la lunghezza di questo SIrna che si legherà al nostro rna

endogeno e a questo punto si crea questa struttura che porterà alla degradazione dell’mrna, quindi

sia il transgene che gene endogeno vengono distrutti da questo meccanismo di difesa che nacque

per una difesa nei confronti di virus e di trasposoni, questi smoll interfiriens vanno a riconoscere la

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sequenza, fanno uno screening sequenza per sequenza e riconoscere quella che è omologa, dove c’è

omologia taglia, quindi capite come vi sia una degradazione di tutti gli rna, non è ancora molto

chiaro in neurospora crassa come avvenga la produzione di questo rna aberrante, un’altra cosa

interessante è il ruolo del QDE1 che ha sia un ruolo di trasporto dell’rna a doppio filamento, ma ha

anche una funzione di fattore diffusibile, questo è abbastanza semplice nelle piante, cioè se noi

mettiamo una pianta silenziata su una talea non silenziata avremo il passaggio del silenziamento a

tutta la pianta per cui ci sono dei fattori diffusibili e in neurospora crassa è il QDE1, capire quale sia

questo meccanismo è un fattore di studio importantissimo, in virologia abbiamo studiato la

diffusione dei virioni da cellula a cellula, probabilmente il meccanismo è associabile, queste piccole

sequenze di dable strend rna collegate con questa struttura proteica mimano quello che potrebbe

essere una particella virale e può migrare da cellula a cellula attraverso i plasmodesmi o ancora

meglio può andare nel tessuto vascolare e trasferirsi anche a distanza notevole, il fatto di avere

interi settori sbiancati vuol dire che il silenziamento non avviene solo nel punto di trasfezione, ma

viene trasferito ovunque dove c’è movimento di queste particelle, vedremo che i virus hanno dei

meccanismi per silenziare il silenziamento, come gli HCPRO che sono degli inibitori, dicevamo che

questi rapporti sono sempre dinamici. Quindi lo scopo della ricerca è dimostrare un possibile

coinvolgimento di geni CPKK1 e CPKK2 nel fenomeno della ipo virulenza sfruttando il PDGS,

cercheremo di sfruttare questo fenomeno per una struttura a forcina, inizieremo cercando di

sintetizzare dei vettori plasmidici che possono indurre in crifonectria parassitica un fenomeno di

silenziamento genico post trascrizionale per CPKK1 e verificheremo se questa trasformazione è poi

avvenuta, un aspetto interessante parallelo a questo lavoro, si era notato che la proteina CPKK1

rimaneva iper fosforilata molto di + rispetto a ceppi dove non vi era la presenza del virus, questo ha

spinto la ricerca ad insistere sulla CPKK1 nonostante i problemi del knock out genico.

Come abbiamo proceduto? Abbiamo clonato 2 bande, una di 598 paia di basi e una di 472 in cui

abbiamo esattamente la stessa sequenza, quindi omologia di sequenza anche se una è 100 paia di

basi + lunga, l’idea è quella poi di ottenere una porzione del gene, il suo complementare inverso con

una porzione che non appartiene a nessuno dei 2, l’idea è quella di fare una struttura a forcina

quindi 2 sequenze omologhe con 100 paia di basai che permettano l’appaiamento, cerchiamo di

riprodurre questa struttura per dare poi un dable strend rna che poi induca perché scegliamo una

porzione del gene che poi verrà tagliato in SIrna e che poi inibirà il nostro mrna tenendo conto che

noi non lo togliamo nel genoma, quindi eventuale funzionalità secondarie verranno mantenute.

Cosa abbiamo fatto? Abbiamo utilizzato un plasmide di trasformazione con un gene di resistenza

all’igromicina e un gene di idrofobina di parete che è un gene costitutivo, quindi si è voluto inserire

in un gene in cui eravamo sicuri che il promotore e terminatore funzionassero e quindi eravamo

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sicuri che una volta trasformato si sarebbe espresso il nostro gene, quindi la nostra forcina e sarebbe

avvenuta la trasformazione, e abbiamo poi trasformato crifonectria parasitica, la trasformazione

appunto attraverso i protoplasti, quindi abbiamo digerito la parete e dopo abbiamo trasformato i

nostri plasmidi, poi hanno ricostituito la parete, questo è un passaggio importante perché se si

creano problemi a geni che servono per ricostruire la parete anche in questo caso nonostante la

tecnica ci faccia superare i problemi che abbiamo visto nel knock out non ci permetterebbe di

andare avanti, abbiamo voluto verificare un anti siero contro la proteina CPKK1 e abbiamo voluto

vedere dove era concentrata e abbiamo verificato che è + concentrata nelle membrane cellulari.

Abbiamo voluto verificare se è avvenuto il silenziamento dei nostri ceppi, con una percentuale

molto alta del 40% circa, abbiamo poi voluto fare una coltura mono sporica di un ceppo nel quale

era avvenuta la trasformazione e la cosa interessante è che uno stesso ceppo produce generazioni

successive nel quale non sempre è conservato il silenziamento genico, questo è un dato interessante

e le motivazioni possono essere varie come ad esempio un riarrangiamento genica è per questo che

si usano tecniche come la western per verificare il silenziamento genico, avrei potuto utilizzare

anche un northern per vedere la funzionalità di un gene, la northern si basa sul prodotto genico, è

stata provata anche la northern ma non era abbastanza sensibile anche se in realtà si usa una

northern per l’espressione genica. A questo punto abbiamo visto che il ceppo è stato silenziato,

dovremmo vedere che tipo di influenza ha sil nostro fungo, quindi dal punto di vista fenotipico

dovremmo fare una caratterizzazione biologica, la prima prova è vedere se ha una colorazione di

tipo bianco, a questo punto ci rifacciamo a saccaromices cerevisies, cerchiamo di provare a

intervenire sulla crescita filamentosa, verificare l’integrità di parete e la risposta feromonica, quindi

cercheremo di fare prove biologiche in questo senso, inizialmente abbiamo valutato la velocità di

crescita alle diverse temperature, questo per verificare l’assetto di base che è quello che un ceppo

ipo virulento non cambia la fitness e non abbiamo nessuna virulenza tra i ceppi wild tipe e quelli

trasformati, abbiamo poi valutato lo stato di crescita a diverse condizioni di osmolarità ma anche i

questo caso non abbiamo ottenuti risultati, poi sono state fatte prove di patogenecità e in questo

caso abbiamo ottenuto risultati, nel ceppo wild tipe abbiamo necrosi, non c’è una diminuzione totale

della patogenecità ma di una diminuzione possiamo parlare, non possiamo parlare di totale ipo

virulenza, poi abbiamo voluto valutare la competenza rispetto alla produzione sessuata dei ceppi

silenziati, una riproduzione sessuata porta a produzione di un peritecio con all’interno aschi e con

un collo periteciale quindi abbiamo riscontrato in tutte le prove questi colli periteciali, per cui il

silenziamento del gene non porta a una variazione nella competenza sessuata dei ceppi.

FINE SEMINARIO 37

Avevamo finito parlando del movimento che i virus hanno all’interno della pianta ospite,

movimento che avviene da cellula a cellula, movimento abbastanza lento e un movimento che va

dal punto di ingresso, di inoculazione fino ad aree anche molto distanti che avviene attraverso gli

elementi cribrosi della pianta ospite, elementi cribrosi che sono elementi vivi, come è la struttura

degli elementi cribrosi? Da cellula a cellula ci sono dei passaggi, le cellule non sono isolate tra loro,

ma esistono delle connessioni chiamate plasmodesmi che uniscono i citoplasmi delle cellule, il

passaggio però è un passaggio molto lento, da cellula a cellula un virus può impiegare un paio di

ore, mentre il passaggio attraverso gli elementi cribrosi è un passaggio a una velocità maggiore, una

velocità di parecchi cm all’ora, l’elemento cribroso, questi vasi, sono vasi tra loro connessi

attraverso quella che si chiama placca cribrosa, quindi anche da questi elementi si può passare

dall’uno all’altro con continuità, i virus non possono sopravvivere se non per brevissimo tempo al di

fuori della cellula, perché vengono completamente denaturati, la differenza che c’è tra gli elementi

cellulari, le cellule del mesofillo e gli elementi cribrosi è che il passaggio che c’è tra una cellula e

l’altra (plasmodesma) è molto + piccolo di quello degli elementi cribrosi, quindi i fito virus in teoria

da cellula a cellula non riuscirebbero a passare se non con delle strategie particolari, inoltre gli

elementi cribrosi maturi non sono pieni, hanno un velo di citoplasma, ma sono degli elementi

‘’vuoti’’ addirittura non sono presenti i ribosomi, non c’è un RE liscio, il nucleo è stato degenerato

e l’elemento cribroso vive in associazione con altre cellule chiamate cellule compagne che sono a

lato, quindi abbiamo una cellula compagna che prende connessione con l’elemento cribroso, qui il

passaggio è molto + veloce soprattutto perché il virus riesce a passare da un elemento all’altro

molto + rapidamente perché è una apertura di parecchio nanometri + grande, non solo ma anche

perché questa è la via che seguono i foto assimilati, c’è proprio un flusso rapido continuo di

elementi dalla sorgente al pozzo come si dice, questo flusso di foto assimilati va dall’elemento che

fa fotosintesi ad elementi che ancora non fanno fotosintesi come le cellule meristematiche, cellule

giovani che a loro volta quando iniziano a distendersi diventano elementi fotosintetizzanti, il virus

cerca cellule giovani, cellule ancora in attivo metabolismo, perché è proprio il metabolismo attivo

della cellula che attiva a rende vitale il virus, in questa immagine il virus non si è mosso ha causato

delle maculature (è una infezione localizzata), è il tabacco ring spot virus, quindi in questi 2 casi

abbiamo una infezione localizzata e una infezione sistemica, da un lato il sintomo è limitato in

piccole aree puntiformi, i motivi possono essere 2: una HR ritardata rispetto a una HR normale che

di solito è invisibile perché avviene tra singole cellule, il patogeno viene fermato da 2/3 cellule e

non si vede, qui può essere una HR molto estesa,, quindi c’è una interazione gene per gene un po’

ritardata, il virus viene limitato in piccole aree puntiformi laddove è entrato, oppure l’altro caso: il

virus non ha la possibilità di muoversi, il virus non ha un sistema di proteine di movimento tali da

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poter navigare e cercare tessuto idoneo all’infezione, quindi l’infezione localizzata può avere 2

ipotesi: infezione che molecolarmente si spiega con reazione di ipersensibilità quindi gene per gene,

oppure una infezione localizzata semplicemente perché il virus e ce ne sono alcuni non hanno la

possibilità di sintetizzare una proteina di movimento efficace, oppure il virus la può sintetizzare ma

non è nella pianta giusta perché le proteine di movimento che il virus sintetizza deve essere

compatibile e deve interagire con le proteine del citoplasma, non deve essere un corpo estraneo, nel

citoplasma ci sono delle micro fibrille, micro tubuli, ci sono tutte delle strutture proteiche che

devono essere compatibili con le proteine di movimento del virus, in pratica l’interazione fra le

proteine del citoscheletro e la proteina di movimento, questa interazione guida il virus o il

complesso ribo nucleo proteico verso i plasmodesmi e in questo modo può avvenire il movimento

da cellula a cellula, come è avvenuto evidentemente in questo caso, c’è un altro aspetto molto

interessante che è quello del fronte di infezione, i virus quando si muovono, quando hanno la

possibilità di infettare sistematicamente la pianta ospite hanno un fronte di avanzamento, quindi la

situazione peggiore per la pianta ospite è nel fronte di avanzamento quando le cellule vengono

infettate ex novo, poi in qualche modo dietro a questo fronte la pianta ospite riesca a recuperare una

parte della sua normale fisiologia, riesca a sopravvivere, anche perchè le particelle virali + attive, +

mobili sono sempre quelle che si trovano al fronte, dietro nasce una sorta di accordo fra la cellula

vegetale e gli elementi virali, quindi in moti casi i virus essendo tipici patogeni biotrofici devono in

qualche modo arrivare ad un accordo altrimenti se muore l’organo muore anche il virus, si denatura,

questa è una immagine molto bella per quanto riguarda la descrizione dei diversi sistemi di

interazione con la cellula vegetale usati da batteri, funghi.

Quindi abbiamo 2 fasi fondamentali del virus nella pianta ospite: i virus come tutti i patogeni

seguono il solito itinerario che è quello della inoculazione, replicazione, diffusione ed evasione

come ultima fase tramite vettori, il problema che adesso affrontiamo è il trasferimento a breve

distanza da cellula a cellula o il trasferimento a lunga distanza attraverso i tessuti conduttori, qui

abbiamo le 2 situazione, cellula vegetale, la parete vegetale e questa apertura che sono i

plasmodesmi che sono strutturati in modo molto complesso e possono permette se stimolati il

passaggio dei virus, come vedete le particelle virali passano attraverso i plasmodesmi oppure

passano se questa è una cellula compagna di un elemento cribroso, passano all’interno

dell’elemento cribroso, esistono anche virus xilematici anche se sono pochi, ma i meccanismi di

passaggio e di sopravvivenza nello xilema sono poco noti, certo è che il virus anche il + piccolo

come dimensioni non riesca a passare da cellula a cellula o da cellula compagna ad elemento

cribroso, inoltre per la maggior parte dei virus questi meccanismi di diffusione, da cellula a cellula o

da cellula compagna ad elemento cribroso, sono meccanismo diversi, regolati da proteine diverse o

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da una stessa proteina che si collega con proteine cellulari diverse, sono sistemi che non sono

omologhi, un’altra cosa che avviene e che non si conosce è il passaggio da elemento cribroso a

cellula, qui c’è la struttura di un plasmodesma: innanzitutto i plasmodesmi possono avere diversa

struttura: possono avere una struttura tubulare e una struttura ramificata quando la cellula è +

matura, in pratica quando la cellula è matura diversi plasmodesmi singoli hanno la capacità di

fondersi al centro in modo che ci siano all’interno della cellula 2 o + aperture che confluiscono in

un serbatoio che si trova all’interno della parete cellulare, questo lume ha un limite di esclusione

che è inferiore alla dimensione del virus, quindi non solo i virus così come particelle intere non

passano, ma non passa neanche un complesso ribo-proteico, quindi è necessario interagire a livello

dei plasmodesmi e l’interazione può avvenire a livello di parete dove abbiamo degli elementi, delle

proteine, queste tonde viola, sono tutti elementi proteici, quindi l’interazione proteina proteina mi

può variare la permeabilità e mi può variare il limite di esclusione del plasmodesma, quindi il

plasmodesma può allargarsi, può aprirsi, ma non solo può essere anche elettricamente compatibile

con il trasferimento di complessi ribo nucleo proteici, la velocità di trasferimento da cellula a cellula

è 1 micron all’ora, quando scorre nel sistema vascolare è di alcuni cm ogni ora, per attraversare una

cellula quindi occorrono 2/3 ore, molti virus codificano proteine di movimento e ci sono nel

genoma del virus delle ORF dedicate alla codifica di queste proteine di movimento, la caratteristica

di queste proteine di movimento è che vengono sintetizzate solamente al momento del

trasferimento, quindi vengono attivati questi operon solo quando c’è la necessità, poi queste

proteine di movimento devono essere capaci di legarsi agli acidi nucleici perché la proteina deve

riconoscere questa sequenza ribo nucleotidica del virus per trasferirla da cellula a cellula, ci deve

essere interazione, riconoscimento, di acidi nucleici all’interno della cellula ce ne sono a volontà per

evitare che la proteina vada a legare qualcosa altro di appartenenza cellulare e che lo porti da cellula

a cellula, poi la proteina di movimento deve stabilire una qualche interazione con un sistema di

membrane cellulari perché le membrane cellulari sono quelle del reticolo endoplasmico del

desmotubulo quindi seguendo questo percorso, questo itinerario di riconoscimento la proteina di

movimento che è legata al suo rna sa dove andare per trasportare questo materiale da una cellula a

un’altra cellula, poi siccome il limite di esclusione non permette il passaggio tranquillo di questo

complesso ribo nucleo proteico bisogna che questa proteina abbia la capacità di aumentare o di

organizzare il limite di esclusione sia dei plasmodesmi primari che dei plasmodesmi secondari, la

fusione di + plasmodesmi, al centro è vero che c’è un bel serbatoio però c’è il problema del

passaggio stretto, del collo di bottiglia, la struttura ramificata non ha però come diametro lo stesso

all’inizio alla fine, sono strutture che al centro fondono e creano delle ampolle di dimensioni che

potrebbero essere compatibili con quelle dei virus, il problema che l’ingresso è sempre molto stretto

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e deve essere così altrimenti che da una cellula all’altra c’è passaggio avanti a all’indietro, quindi le

proteine di movimento sono anche quelle che vengono impedire il passaggio nell’altro senso, ci

sono 2 tipi di proteine cellulari che vanno verso i plasmodesmi, c’è quella del desmotubulo che è

una struttura proteica, poi ci sono queste famose micro fibrille del citoscheletro e sono proprio

quelle che indicano la via tramite interazione proteina-proteina alle proteine di movimento una volta

legate all’acido nucleici indicano la via verso il plasmodesma, inoltre ci sono anche delle interazioni

a livello delle proteine di membrana vicino al plasmodesma perché c’è anche la possibilità per

alcune proteine di formare ex novo dei tubuli, in più alcune proteine inducono la soppressione del

silenziamento genico post trascrizionale, questa è una delle caratteristiche che hanno alcune

proteine di movimento perché, inducono la soppressione del silenziamento genico dove il virus va a

modificarsi e questa è la regione per cui il virus sul fronte è molto + virulento, l’attivazione del

silenziamento genico è una attivazione che avviene una volta che il virus è già stato trasferito, che la

proteina di membrana ha già fatto il suo dovere nel trasferimento del virus e con un leggero ritardo

di qualche ora quando la proteina di membrana comincia ad essere degradata, in concentrazione

inferiori, la pianta attiva il silenziamento genico con un po’ di ritardo, e questo silenziamento

genico è una delle cause per cui le cellule infettate in qualche modi riescono a sopravvivere, perché

il virus lì viene domato cosa non possibile nelle cellule del fronte, quindi silenziamento genico una

delle regolazioni è dovuta alla presenza di queste proteine di movimento, sono 6 super famiglie che

sono state determinate in base all’omologia di sequenza, concentriamo l’attenzione su 2 tipologie

delle 6 superfamiglie, quella del virus del mosaico del tabacco e quella del virus x della patata, 2

tipologie dovute dalla presenza di una regione codificante normale RF3 nel virus del mosaico del

tabacco, mentre abbiamo 3 regioni, un blocco trigenico nel virus x della patata, funzionalmente

lavorano in modo molto diverso, poi abbiamo altri casi anche se le 2 filosofie sono queste, quindi

con un ORF che codifica per una proteina di movimento nel caso della proteina di movimenti del

virus del mosaico del tabacco che è la P30 che è una proteina 30 kda che fa tutto lei, trasferisce

allarga, fa le interazioni a livello dei plasmodesmi, lega l’rna, mentre il blocco trigenico codifica tre

proteina: 25-12-8 kda di cui quella di 25 kda è quella che ha i domini di legame con gli acidi

nucleici, quindi protegge l’rna da trasferire, le altre 2 sono proteine accessorie che sono importanti

perché vanno ad interagire con la struttura proteica del desmotubulo e con la struttura stessa del

plasmodesma, operando l’allargamento in modo da permettere a questa proteina con il suo rna

legato di passare indenne attraverso il plasmodesma, quindi una azione coordinata, quindi le 2

filosofie sono queste: una singola proteina che fa tutto, oppure un blocco trigenico che codifica tre

proteine che lavorano in sincronia con interazioni diverse, con domini diversi ma in sincronia.

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La non efficienza di un meccanismo dipende dall’ospite in cui il virus si trova, quindi queste

proteine di membrana sono anch’esse fattori di virulenza.

Questa è la rappresentazione di come avviene il passaggio: c’è la parete cellulare, abbiamo il

plasmodesma e la presenza del desmo tubulo collegato al reticolo endoplasmico, collegamento

citoplasmatico da cellula a cellula, quello che passa è il complesso proteina di movimento-rna, non

passano interi virioni tranne 2 o 3 casi in cui la particella virale riesce lei stessa a sintetizzare un

percorso, è chiaro che c’è anche il problema del riconoscimento, quindi molto spesso abbiamo un

complesso non doppio ma triplo, perché a questo complesso si associano anche alcune proteine

della pianta ospite, è un complesso ribo nucleo proteico e le proteine sono quelle di movimento, ma

anche proteine della pianta ospite per aiutare il passaggio, nella cellula non infetta succede che

questo complesso si scinde nelle proteine dell’ospite che si staccano e le proteine di membrana

vengono denaturate e inizia la replicazione del virus.

Qui abbiamo tre tipi di virus dove il trasferimento avviene come virioni, come particella virale sono

i tospo virus i nepo virus e bromo virus, sono virus sferoidali, hanno scoperto che la proteina di

trasferimento è analoga a una metil esterasi, quindi proteina che prende collegamento con proteine

analoghe di membrana che possono in un qualche modo aprire un percorso all’interno della parete

vegetale. Parliamo di complementazione del trasporto: non si deve pensare che ogni virus utilizzi in

modo specifico la stessa proteina, le proteine di movimento possono mediare il trasferimento anche

di altri virus con efficienza ridotta però una volta che è presente una proteina è possibile avere

infezione di 2-3 virus, a volte capita che la stessa proteina si trasferisca + di 1 di virus, questo può

essere uno dei motivi per cui 2 o 3 virus invece di entrare in conflitto tra loro si aiutano a vicenda

utilizzando la stessa sintesi di una proteina di movimento per passare da cellula e cellula, un’altra

caratteristica è che il legame tra rna virale e proteine di membrana e proteine di movimento è a-

specifico, uno potrebbe pensare che ne basterebbe una, c’è il problema che le proteine di

movimento servono non solo a trasferire il materiale nucleare ad rna da una cellula all’altra, ma

servono anche a proteggere, a creare una struttura secondaria o terziaria di protezione, quindi è vero

che i legami sono a-specifici, ma a volte i legami a-specifici non funzionano perché non sono in

grado di creare una struttura tridimensionale atta a proteggere quel particolare rna che non

appartiene al virus che ha codificato quella particolare proteina di movimento e le proteine di

movimento è ovvio che agiscono in maniera ospite specifica perché devono legarsi con la struttura

della cellula, del citoscheletro, con i micro tubuli, con le mio fibrille, l’actina, quindi se non c’è

questo riconoscimento a livello di proteina-proteina, proteina di movimento e proteina della cellula

vegetale non c’è trasferimento del virus, questo è il motivo per cui virus virulenti su cucurbitaceae

possono avere una virulenza ridotta su solanaceae o su altri ospiti, proprio perché non esiste una

42

interazione accettabile tra proteine. Vediamo il trasferimento a lunga distanza: avviene attraverso i

tubi cribrosi e avviene in 5 fasi: in genere si parla di mesofillo o cellule epidermiche, ricordiamo

che molti virus sono trasmessi da vettori e solo pochi vettori vanno a pungere direttamente cercando

il tubo cribroso, molto spesso si accontentano di pungere un tessuto meristematico, o un mesofillo,

o un tessuto epidermico, in ogni casi rilasciano il virus non direttamente nel tubo cribroso e ci sono

diverse tipologie di cellule che devono essere attraversate, quelle del mesofillo sono + o – tutte =

palizzata il lacunoso, poi ci sono quelle della guaina nel fascio, ci stiamo avvicinando all’elemento

cribroso, poi passiamo alla cellule compagne del tubi cribrosi che sono quelle cellule che svolgono

alcune funzioni metaboliche perché il tubo cribroso maturo non ha nucleo, non ha ribosomi, ha una

struttura molto semplificata, quindi è importante per questi tubi cribrosi avere queste cellule

compagna, poi dalle cellule compagna possono passare direttamente nei tubi cribrosi e seguono la

corrente floematica dei foto assimilati, vanno verso cellule molto giovani ancora non foto

sintetizzanti dove trovano l’ambiente idoneo, poi c’è il percorso inverso che è molto poco chiaro:

dai tubi cribrosi alla cellule compagne e dalle cellule compagne si passa alla guaina e al mesofillo,

quello poco chiaro è il passaggio dai tubi cribrosi alla cellule compagne, qui abbiamo una cellula

compagna e qui abbiamo un elemento cribroso con la direzione che seguono i foto assimilati: qui è

un ambiente molto + duro per il virus, il virus deve essere stabilizzato, quindi il virus viene

stabilizzato in questo modo: qui abbiamo gli acidi nucleici virali, la proteina di movimento e

abbiamo il complesso proteico di origine vegetale che è un complesso triplo che passa attraverso il

plasmodesma e va all’interno del floema, molto spesso si associa un fattore HF che è una piccola

proteina che dà stabilità al complesso e permette al complesso di non essere immediatamente

denaturato quando arriva nel floema, il floema è un ambiente + duro perché è un ambiente in cui

non puoi fare una sintesi, pensa a tutto la cellula compagna e questo ambiente è + pericoloso per il

nostro rna, poi viene stabilizzato da questi fattori HF, sono piccole proteine dell’ospite che formano

una capsula di protezione che segue tutto il percorso fino ad arrivare nei punti dove questo materiale

può entrare di nuovo in qualche cellula compagna, qualche virus vengono liberati in questo

complesso già nel floema, ma in genere questo complesso rimane in tutto il percorso.

Per quanto riguarda lo xilema è un sistema ancora poco conosciuto, il trasferimento è possibile

soprattutto in alcuni casi, quando xilema e floema traggono origine dallo stesso gruppo di cellule, e

per quanto riguarda la trasmissione quindi quando un virus segue la via dell’apoplasto alcuni virus

che vengono trasmessi con coleotteri o protozoi utilizzano quella via, in particolare questi virus

hanno una elevatissima stabilità e resistenza a proteasi, questa è una caratteristiche che accomuna

quei pochi virus che si spostano attraverso lo xilema. Non è chiaro come sia il passaggio dal

simplasto all’apoplasto, probabilmente la via è quando i virus sono presenti in quegli elementi

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cellulari che poi daranno origine a uno xilema e al floema, comunque questo è importante: la

replicazione virale avviene sempre e comunque nel simplasto, quindi lo xilema, il tubo xilematico

serve solo per il trasporto, o perché il virus è finito lì tramite un vettore, per quanto riguarda

l’evasione del virus avviene tramite vettori, ci sono alcuni virus che vengono emessi da idatodi,

quindi sono virus che per un breve m omento della loro vita si trovano al di fuori della cellula, del

tessuto, qui abbiamo il virus del mosaico dell’orzo, è un virus che esce per glutazione, poi se

abbiamo delle mattinate umide, per strofinamento si creano micro ferite attraverso le quali il virus

entra, se si asciuga la goccia il virus è già denaturato, la glutazione è quel fenomeno che si riscontra

in mattina presto se la notte è stata fresca, idatodi sono quelle aperture che mettono in

comunicazione un fascio vascolare con l’esterno, quando l’umidità è eccessiva (congestione idrica)

c’è assorbimento da parte della pianta, gli stomi sono ancora chiusi e c’è uno stato di troppa acqua

all’interno degli spazi inter cellulari, questa acqua ha una pressione che deve uscire, non può uscire

dagli stomi, esce dagli idatodi, quindi gli idatodi sono anche un sito di penetrazione per esempio per

i mal nero del cavolo è una tipica batteriosi che entra da idatodi.

Trasmissione dei virus: abbiamo già parlato attraverso vettori, la conoscenza della trasmissione dei

virus è essenziale per mettere in atto strategie di lotta, i virus non genere si combattono con dei

criteri preventivi, non ci sono agro farmaci in grado di combattere i virus, ma solo tecniche

preventive, biotecnologiche come il silenziamento genico o molecole segnale etc. il virus ha una

trasmissione diretta che può essere verticale o orizzontale a seconda dai tipi di virus, verticale fate

finta che si sposta sui e giù dalla stessa pianta, quindi da una pianta infetta alla sua progenie, sono

virus questi che si propagano attraverso il seme, una volta infettato un qualsiasi organo ha la

possibilità di traslocare fino al seme infettando l’embrione, i cotiledoni, oppure c’è anche una

trasmissione diretta verticale quando il virus si propaga attraverso i materiali vegetali, mentre la

trasmissione diretta orizzontale è quando avviene un passaggio del virus da una pianta infetta a una

pianta sana, con diverse modalità, le modalità di ingresso del virus quali sono? La ferita è quella

che conoscete meglio, ferita da stiletto quindi da apparati boccali pungenti succhianti, ferite da

potatura, ma esistono anche 2 altre modalità che sono la fusione e la endocitosi, sono 2 modalità un

po’ particolari dove deve avvenire il riconoscimento fra proteina del capside e proteine di

membrana, quindi l’ingresso può avvenire tramite fusione, simile a quello dell’HIV, riconoscimento

di membrana e fusione delle 2 membrane, membrana con la proteina del capside e rilascio

all’interno del materiale nucleare, oppure endocitosi; riconoscimento, ripiegamento della membrana

attorno al virus e formazione di una vescicola che viene poi acquisita all’interno del citoplasma, una

vescicola proteica contenente il capside, si fanno accettare per il riconoscimento e si fanno

riconoscere per l’interazione proteina-proteina, è l0unica spiegazione perché per fare avvenire o la

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fusione ci deve essere elevatissima compatibilità, ma anche per la endo citosi l’attivazione di un

processo di introflessione della membrana con inclusione di tutta la particella virale, una volta che è

all’interno la membrana viene degradata e si libera il virus che a sua volta viene de capsidato e poi

lascia libero il suo rna e poi inizierà e replicarsi etc. inclusione e endo citosi sono importanti quando

si parla di trasmissione per vettori perché per quanto riguarda i fito virus questa modalità rende il

fito virus circolativo o propagativo all’interno del vettore, quindi una possibilità che ha il fito virus

di moltiplicarsi attivamente all’interno del vettore deve seguire una di queste modalità.

Modalità di trasmissione: per contatto: attraverso micro lesioni essenzialmente, micro lesioni nella

parte ipogea e nella parte epigea, micro lesioni avvengono quando fuoriescono le radici secondarie

che sono molto delicate, possono avvenire micro lesioni e i virus possono entrare anche se sono

pochi, devono essere virus particolarmente stabili, devono essere virus che hanno la possibilità di

rimanere per qualche momento al di fuori della cellula senza essere denaturati, come il mosaico del

pomodoro e i mosaico della patata, nel caso che le particelle virali in detriti nel terreno, quindi una

volta che abbiamo raccolto il pomodoro meccanicamente virus come il mosaico del pomodoro nel

terreno può resistere anche per alcuni mesi, il contatto può essere diretto tramite 2 foglie di orzo ad

esempio, mail contatto può essere anche indiretto e sono le tecniche di rilevamento che noi usiamo,

tramite tecniche di scacchiatura, cimatura, legatura che hanno una importanza fondamentale nel

trasmettere diversi virus in pomodoro, la scacchiatura è la rimozione dei germogli, nel pomodoro la

crescita è indeterminata bisogna raccogliere il pomodoro via via che matura, il pomodoro può

crescere anche 4-5 metri, la pianta viene abbassata per la raccolta, queste piante crescono per

diversi mesi finchè l’apparato radicale non sarà + in grado di sostenere questa crescita

indeterminata, la qualità del frutto degenera verso la non accettabilità, però servono queste

operazioni, se noi abbiamo un virus in una serra e dobbiamo andare avanti 4/5 mesi non possiamo +

fare queste operazione e meno che ad ogni pianta noi andiamo a disinfettare ma questo non è

possibile, lo stesso quando facciamo operazioni di cimatura o la stessa legatura, il pomodoro è la

pianta che fornisce un ottimo sistema sperimentale di lavoro, è la coltura orticola numero 1 in Italia

e la stessa legatura può portare a delle micro ferite, quando l’operatore si è infettato le mani con il

virus non fa altro che trasferirlo in altre, poi queste tecniche sono importanti dal punto di vista

sperimentale perché sono tecniche che possono essere utilizzare per indessaggio, piante indicatrici,

noi per conoscere il virus dobbiamo conoscere come si sviluppa, dove si sviluppa, quali sono le sue

piante ospiti e siccome non è possibile allevare il virus in coltura pura dobbiamo avere una idea se il

sintomo è associato alla presenza di un virus ma soprattutto vedendo di trasmettere quello che i

nostri progenitori chiamavano contagium fluidum, che il pomodoro ammalato poteva ammalare le

piante vicine, c’era qualcosa che passava, la ricerca di questa entità la si fa con tecniche di

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indessaggio, è chiaro che se io sospetto che sia presente un patogeno, una pianta malata, vado a fare

un succo vegetale e lo vado a strofinare sulla foglia di una pianta sana e questa pianta mi si ammala

evidentemente in quel succo avevamo una entità patogena tipi virus, fito plasma, se invece

prendendo questo succo e strofinando non ottengo nulla allora quel sintomo non è associato ad una

entità patogena, per l’indessaggio si utilizzano piante indicatrici che servono per numerosi fito

virus, chiaramente è molto meglio utilizzare la stessa specie per la verifica.

Poi i virus si propagano attraverso la vegetazione: bulbi, tuberi, stoloni, nesti, i virus si possono

diffondere propagare attraverso questi organi, certamente questa modalità di propagazione è molto

comune, quasi tutti i virus si propagano in questo modo, trasmissione sperimentale dei virus con

tecniche di indessaggio, anche qui possiamo utilizzare la tecnica dell’innesto per trasmettere il fito

virus, si fa benissimo con il pomodoro e si prende l’apice di un pomodoro ammalato la si innesta in

un pomodoro sano, o viceversa, si taglia il pomodoro ammalato e al di sopra andiamo ad innestare

un pomodoro sano e vediamo se c’è la trasmissione del sintomo, quindi si è certi che c’è la presenza

di un virus se parliamo di malattie virali; la trasmissione di virus (questa sopra nel lucido) per

contatto come si fa? Per esempio si usa come pianta indicatrice il tabacco, le solanaceae in genere

sono buone piante indicatrici, dobbiamo simulare le modalità di trasmissione del virus, le modalità

+ comune sono la cicalina, la xilla, un insetto vettore che fa delle micro ferite per raggiungere le

cellule del mesofillo, come facciamo delle nebulizzazioni con una sospensione, con acqua sterile

dove mettiamo il virus e della sabbia di quarzo finissima, andando a spruzzare questa finissima

sabbia di quarzo fa delle micro lesioni a livello dell’epidermide invisibili ad occhi nudo, però sono

micro lesioni che veicolano all’interno del tessuto vegetale il virus, quindi acqua, sabbia di quarzo

sterile e all’interno qualche goccia di estratto vegetale di pianta malata con probabile presenza di

virus, spruzziamo e quello che otteniamo potrebbe essere un sintomo come nella foto iniziate, delle

punteggiature necrotiche o clorotiche a seconda se è avvenuta una reazione gene per gene o se non

c’è una reazione gene per gene e la clorosi è indice di alterazione di qualche metabolismo cellulare,

una tecnica è l’indessaggio tramite contatto e l’altra è quella dell’innesto, poi modalità di

trasmissione per seme: la cosa strana se noi parliamo di semi è che si pensava che solo un numero

limitatissimo di virus si trasmettesse con il seme, perché si vedeva che usando seme che proveniva

da campi ammalati si aveva il passaggio del virus, poi con uno studio + dettagliato si è visto che

diversi semi si trasmettono per seme perché molto spesso il virus rimane in uno stato latente, noi

abbiamo un campo di pomodoro perfetto o di fragola non nessun sintomo, il seme di quel campo

sano una volta sano provocava la crescita di piante malate perché il seme se noi lo produciamo a

Sorrento e lo seminiamo a Pavia cambiando le condizioni agro climatiche il virus può trovare le

condizioni migliori e sviluppare una malattia, si è visto che oltre 120 semi si trasmette per seme, c’è

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un gruppo italiano di Milano che sono in contrasto con quelli di Bologna, a Milano dicono che la

Sharka nota malattia delle drupaceae da quarantena può essere trasmessa anche per seme, quelli di

Bologna dicono di no, per saperlo si prende il seme da piante ammalate e seminandoli quindi una

annotazione agronomica, ma anche facendo studi andando a cercare nel seme di piante ammalate,

facendo preparati e vedendo se riusciamo a trovare il nostro virus, oppure con tecniche siero

diagnostiche, prendendo diversi semi, una pianta di pesco colpita dalla Sharka prendiamo 100

pesche, da queste prendiamo 100 semi e facciamo 100 Elisa, 100 PCR, o 100 Real Time.

Il virus della Sharka è un virus da quarantena, quindi a questi organismi si applicano delle

normative particolari che ti obbligano a fare degli studi sulla trasmissibilità, quindi se è vero che la

Sharka si trasmette per seme all’Italia verrà vietato di esportare pesche in paesi dove la Sharka non

è presente, è un problema anche politico, è un problema ancora dibattuto anche se al momento

ufficialmente non è trasmessa per seme. Per quanto riguarda il seme, le modalità di trasmissione

sono 2: quella embrionale e quella non embrionale, parliamo qui soprattutto di cereali o di

pomodoro, quando la trasmissione è embrionale il virus è presente nell’embrione, nella parte è

interna, + intima del seme l’embrione viene raggiunto direttamente dalla pianta madre o

indirettamente attraverso i tessuti riproduttivi, nella trasmissione non embrionale possiamo avere

che il virus va a localizzarsi in diversi parti per esempio nell’endosperma o nel tessuto tegumentale

o semplicemente il virus può contaminare i residui vegetali che ricoprono il seme per esempio nel

pomodoro, ci sono batteri, virus nel pomodoro che vanno a contaminare la superficie, il seme del

pomodoro è molto piccolo, ma è ricoperto da un leggerissimo strato di tessuto della nostra bacca

che può contenere batteri o virus, se noi sappiamo che un certo batterio, un certo virus non è

presente all’interno del seme, né nell’embrione, ma è presente come contaminante esterno, con delle

banalissime tecniche di infezione possiamo bonificare questo seme, il virus che è nell’embrione è

da buttare, qualsiasi intervento a livello embrionale mi va ad uccidere l’embrione, noi possiamo

usare i raggi gamma quando il virus non è nell’embrione per degradare, denaturare tutto quello che

c’è all’esterno; un’altra modalità di trasmissione è per polline, può essere orizzontale o verticale, il

polline può andare da pianta a pianta o può fecondare i fiori della stessa pianta, la trasmissione per

polline è conosciuta per pochi virus perché è una trasmissione difficile a causa della struttura

anatomica dell’embrione della pianta madre, il polline è in ogni caso qualcosa di estraneo,

l’isolamento anatomico dell’embrione del sito della pianta madre è un isolamento che protegge la

pianta dall’ingresso di virus che possono contaminare il polline di altre piante, molti pollini sono

contaminati però non riesce a infettare la pianta in cui è presente l’ovulo fecondato perché c’è

questo isolamento anatomico, ma anche fisiologico per evitare una reazione di rigetto, di dna

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estraneo, è una situazione particolare, se ne conoscono 3-4 dei virus che si trasmettono per polline

in modo efficace, per i vettori vedi parte prof. Rubies.

Avevamo terminato la trasmissione dei virus, possiamo terminare il discorso concentrando

l’attenzione sui danni che i virus causano alle piante ospiti e come un virus riesce a danneggiare una

cellula, un tessuto, una piante, essenzialmente ho individuato tre tipologie di intervento nella

relazione virus-pianta ospite, la prima è quella che tutti conosciamo: modificazioni genetiche ed

alterazione dell’espressione genica, quindi integrazione delle sequenze nel genoma della pianta

ospite oppure a diverso livello alterazione dell’espressione dei geni vegetali, poi i virus possono

agire anche in un secondo modo alterando i processi metabolici quindi alterazione dei processi

metabolici della cellula vegetale, una cellula vegetale, un tessuto vegetale non rimane inerte, ci sono

anche nel caso di interazione di virus-piante ospiti delle risposte di difesa, risposta gene per gene o

risposte di carattere generico ‘’i famosi geni VR’’ quelli importati nella resistenza quantitativa, il

virus diverse volte riesce a sopprimere le risposte di difesa, la pianta attiva le risposte normalmente

quando sente un elicitore, un segnale pericoloso, alcuni virus hanno sviluppato delle strategie per

sopprimere queste risposte, quindi per procedere con la patogenesi e lo studio dei sintomi nella

pianta ospite, ricordiamo che i virus sono patogeni biotrofici, al virus non interessa uccidere l’ospite

o la cellula, quindi le strategie che i virus portano avanti all’interno del loro ospite sono quelle di

mantenere il + possibile uno stato dell’ospite ‘’normale, quindi i sintomi che le virosi causano sono

sintomi che a lungo andare possono portare a morte la pianta, ma sono sintomi che in genere

lasciano sopravvivere la pianta e a volte anche discretamente bene, il problema è che noi

ragioniamo dal punto di vista agronomico, quindi un virus come quello della Sharka che mi va ad

alterare il colore o leggermente la morfologia del frutto è un danno notevole per mo agronomo

anche se dal punto di vista biologico la pianta vive anche anni e anni, è il prodotto che viene a

mancare, quindi molto spesso il virus è letale per il nostro portafoglio, non tanto per la pianta ospite,

perché il virus è un patogeno biotrofico, infatti tutte le alterazioni virali si diffondono dal punto di

ingresso del virus e procede cellula dopo cellula, strato dopo strato infettando sempre tessuto nuovo,

che cosa avviene nel tessuto vecchio? Possibilmente non deve morire perché se ne muore una

percentuale troppo elevata mi muore anche la pianta o l’organo, immaginate che il virus entri alla

base di una branca, che entri a livello radicale, se mi muore quella parte lì è chiaro che tutto il resto

muore, invece il vecchio tessuto, cioè il tessuto che viene infettato all’inizio riacquista un certo

equilibrio perché il virus una volta penetrato e una volta che è riuscito a replicarsi si sposta in

cellule sempre nuove, ma non è che nelle cellule vecchie il virus sparisce, la cellula viene

modificata, la cellula non è + normale, all’interno di quella cellula rimangono ancora delle particelle

virali però in uno stato non replicativo, infatti si chiamano entità non replicative, se noi andiamo a

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in scienze e biotecnologie agroambientale
SSD:
A.A.: 2014-2015

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher marcorivi di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Virologia vegetale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Modena e Reggio Emilia - Unimore o del prof Stefani Emilio.

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