Virologia

Struttura del DNA virale

Il DNA virale è circolare e a doppia elica, ma parzialmente incompleto. Il filamento L- è completo, mentre il filamento S+ è solo circa il 50% di L-. Il DNA virale presenta 4 ORF (Open Reading Frame):

1. Regione S: codifica le 3 proteine superficiali
2. Regione C: codifica le proteine del core
3. Regione P: codifica la polimerasi virale
4. Regione X: codifica una piccola proteina con funzioni regolatorie

La polimerasi virale presenta una parziale omologia di sequenza con la trascrittasi inversa dei retrovirus. Ci sono diversi codoni di inizio della traduzione (AUG), quindi la sintesi proteica può iniziare da diverse ORF, a partire dall'origine di replicazione virale. Questo significa che le proteine sintetizzate non sono solo 3, ma possono essere molte di più.

L'infezione virale non uccide direttamente la cellula ospite, ma il virus viene liberato tramite esocitosi. L'envelope virale viene acquisito dal reticolo endoplasmatico (RE). Il virus si lega alla cellula ospite tramite un legame recettore-antirecettore, si fonde con la membrana cellulare ed entra nella cellula. Il nucleocapside, composto da DNA a doppio filamento e dalla polimerasi virale per la trascrittasi inversa, viene liberato nel citoplasma.

Essenziale per completare il doppio filamento, che resta incompleto. Il virus oltre ad uscire dalla cellula per gemmazione può anche rientrare nel nucleo e riprendere tutto il processo.

Replicazione:

All'interno del nucleo il DNA virale viene riparato dai sistemi di riparazione della cellula ospite e si forma il cccDNA.

Il filamento funge da stampo per la trascrizione del mRNA da parte di RNA polimerasi II della cellula.

Non è necessaria l'integrazione nel genoma della cellula (a differenza dei retrovirus). Il cccDNA può essere trascritto in una serie di mRNA (notare la lunghezza maggiore dello stampo che presenta una ripetizione terminale DR1 e DR2). Uno di questi mRNA può non essere tradotto ma incorporato direttamente nei precapsidi virali (grazie alla presenza della proteina P) dove verrà retro-trascritto nel DNA genomico ad opera della RT virale (proteina P). La proteina P (trascrittasi inversa) ha anche la funzione di RNAsi He DNA polimerasi-DNA dipendente.

49Dopo il promo salto di stampo (a livello delle regioni DR1) si genera il primo filamento di DNA che costituirà il genoma.

Terminata la retro-trascrizione (DNA polimerasi-RNA dipendente) degrada l'RNA dell'ibridorisparmiando un piccolo frammento a livello della sequenza DR1 che serve da primer per iniziare a sintetizzare il filamento complementare di DNA (secondo salto sullo stampo).

Alcuni virioni vengono "riciclati". C'è un trasferimento nel nucleo cellulare e un'ulteriore trascrizione del genoma. Si ha una notevole amplificazione della quantità della progenie virale e questo spiega la presenza di antigeni virali nel nucleo di cellule infette.

In alcuni casi c'è l'integrazione di DNA in un epatocita infetto (infezione cronica).

Patogenesi: HBV non sembra essere direttamente citopatico. Fattori dell'ospite piuttosto che fattori virali sono alla base delle conseguenze patologiche dell'infezione.

genoma di HBV nel DNA cellulare presente nel 90% dei pazienti. Può causare delezioni, cis- o trans-attivazione di oncogeni, instabilità genomica generalizzata.

Ruolo indiretto di HBV: la neoplasia insorge a seguito di cronicizzazione dell'epatite e sviluppo di cirrosi, per una deviazione in senso neoplastico del processo di generazione epatocellulare. L'infezione cronica porta alla distruzione delle cellule epatiche infette ad opera del sistema immunitario. Il fegato reagisce rigenerando gli epatociti. Questa iper-proliferazione conseguente può predisporre le cellule ad accumulare mutazioni che possono portare allacomparsa nella cellula di alterazioni che le conferiscono proprietà tumorali.

Le particelle virali di HBV hanno un periodo di incubazione di 60-180 giorni. L'infezione primaria può essere asintomatica, anitterica, itterica o si può avere un'insufficienza epatica.

Rilevabile nel plasma e nel siero grazie alla presenza di marcatori di replicazione epatica (antigeni, componenti virali valutabili). La diagnosi biochimica prevede la determinazione di bilirubina sierica ed enzimi epatici (ALT; AST). Ogni metodo diagnostico ha un errore di fondo, c'è sempre un valore soglia, se sei sopra è positivo e se sei sotto è negativo.

In pazienti con infezione primaria (spesso asintomatica), può seguire l'infezione cronica, se il virus non è stato eliminato dal sistema immunitario. Questa può portare ad epatite cronica che in seguito evolve in cirrosi epatica e carcinoma primitivo del fegato.

Diagnosi: positività di HBsAg sierico superiore a 6 mesi e persistenza di livelli rilevabili di HBV nel DNA plasmatico.

Vaccino: rappresenta la più valida misura di profilassi dell'infezione. Attualmente il vaccino è prodotto con tecniche ricombinanti (proteina/subunità ricombinante).

Che prevedono l'espressione eterologa dell'antigene S in cellule di lievito. Deve contenere elevate dosi di HBsAg (antigene di superficie) e la sua somministrazione, ripetuta, deve indurre la produzione di elevati livelli di anticorpi anti-HBs (che hanno azione neutralizzante).

Eterologa: si prende il gene di interesse e viene attaccato ad un plasmide che viene inserito nel lievito. Il lievito va a produrre l'antigene S.

Epatite C (HCV) - Flaviviridae

I genomi sono a ssRNA a polarità positiva.

Il virione ha l'envelope, il capside è icosaedrico.

Generalmente sono tradotti immediatamente.

La replicazione avviene tramite un intermedio a polarità negativa generato da una RNA polimerasi RNA-dipendente virale.

Ci sono 4 generi:

• Flavivirus: trasmessi da artropodi, ampio spettro d'ospite (vertebrati e invertebrati), virus della febbre gialla, virus Dengue, virus del Nilo occidentale, virus Zika, virus encefalitici. Queste infezioni sono trasmesse

• Pestivirus: virus della diarrea bovina e del colera suino.
• Hepacivirus: virus dell'epatite C (HCV), virus GB (GBV-B).
• Pegivirus: GBV-A e GBV-C (o virus dell'epatite G, HGV), GBV-D.

È una particella virale sferica (50-80 nm diametro) con un nucleocapside icosaedrico (core). Il genoma è a RNA a polarità positiva a singolo filamento. L'envelope è composto da glicoproteine (E1 e E2).

Il genoma è lungo circa 9,6 kb, organizzato in un'unica ORF codificante una poliproteina da 3000 AA che poi viene tagliata ad opera di proteasi cellulari e virali in 10 proteine (strutturali e non).

La regione 5' UTR non è tradotta ed è molto conservata, svolge importanti funzioni per la replicazione e traduzione. Contiene un Internal Ribosome Entry Site (IRES) per la traduzione cap-indipendente dell'RNA. Contiene almeno 2 siti di interazione con un micro-RNA epatico (MiR-122) necessario per la replicazione del virus.

Il rilascio per esocitosi.

Variabilità genetica: Le varianti genetiche sono generate da mutazioni spontanee e a seguito della pressione selettiva imposta dalla risposta immunitaria. Ad ogni replicazione si può avere una mutazione e quindi della nuova variabilità. Ci sono genotipi maggiori (clades) e sottotipi. Il confronto di diversi isolati di HCV indica 7 genotipi principali con una variabilità nucleotidica del 30-35% e la presenza di numerosi sottotipi con il 20-25% di variabilità. Per classificare queste infezioni si devono fare delle analisi comparative (ex. tra sequenze nucleotidiche).

Col fatto che è molto variabile, la profilassi è molto difficile da eseguire. Una piccola modifica di una proteina potrebbe non essere più riconosciuta dal farmaco che non fa effetto.

Epidemiologia: HCV si trasmette per via parentale.