Riassunto esame Virologia, prof. Affabris, libro consigliato Basic Virology di Hewlett e Wagner

Codificano sempre per enzimi in grado di replicare l’RNA, RNA polimerasi, attraverso la

formazione di un filamento intermedio -.

4. Virus a RNA a filamento -,non ha una sua attività funzionale come il filamento +. Una

volta penetrato viene eliminato dal sistema immunitario. Dal filamento – si crea il

filamento +, intermedio di replicazione e mRNA.

5. Virus a RNA doppio filamento, hanno enzimi codificati dal virus che sintetizzano

mRNA.

6. Retrovirus, presentano genomi a RNA singolo filamento +, i quali possono funzionare

come mRNA. La prima azione del genoma dopo l’infezione, non è servire da mRNA ma

agire da stampo per la sintesi di DNA a doppia elica. Questo DNA si integra nel DNA

cromosomale dell’ospite e da qui serve da stampo per la trascrizione dell’mRNA virale e

della progenie genomica. La transcriptasi inversa produce DNA virale a partire dallo

stampo di RNA genomico.

7. Epatite B, dotati di un genoma composto da un filamento – di DNA di lunghezza

completa e di un corto filamento +. I virioni contengono una DNA polimerasi che

completa il filamento + subito dopo l’infezione producendo così una molecola di DNA a

doppia elica che può essere trascritta dalla cellula per produrre gli mRNA virali.

La Specie Virale è una classe, poiché hanno elevati livelli di mutazione, Polietica di virus

(ogni membro condivide una serie di proprietà, ma non tutti ce le hanno tutte queste proprietà

essendo una miscela di mutanti) che comprendono caratteristiche di replicazione simili e

occupano una particolare nicchia ecologica.

La Nicchia Ecologica intende le proprietà biotiche:

• Spettro d’Ospite (l’uomo, il topo…);

• Tropismo Tissutale, ad esempio infetta l’uomo ma non tutti i tessuti; ad alto spettro

tissutale vuol dire che infetta diversi tessuti ma non tutti; a basso spettro ne infetta solo

uno;

• Virulenza e Patogenesi, virus molto virulento che replica molto velocemente e

patogeno che induce danno. I virus latenti non sono molto virulenti.

• Risposte dell’Ospite, come l’ospite risponde all’infezione;

• Vettori, ci dice se i virus vengono trasmessi attraverso ospiti intermedi come insetti o

animali;

• Habitat.

Per distinguere le specie virali prendiamo le seguenti caratteristiche:

• Somiglianze nella sequenza genomica;

• Spettro d’ospite naturale;

• Tropismo tissutale o cellulare;

• Patogenicità o citopatogenicità;

• Via di trasmissione;

• Proprietà fisico- chimiche dei virioni (l’uso delle tecniche sierologiche è molto

importante);

La Specie di Riferimento è la specie virale di cui abbiamo più conoscenze e che sono più

facilmente studiabili. Non è quindi la specie più frequente della famiglia. Per considerare la

variabilità genomica prendiamo in considerazione una specie di riferimento.

La Quasi Specie è un insieme di genomi che costituiscono un preparato virale. Il termine quasi

specie fu introdotto nel 1993 per descrivere le caratteristiche delle molecole di RNA virale

genomico, che a causa dell’elevata frequenza di mutazioni generate durante la replicazione

virale, non può essere costituito da una specie molecolare omogenea.

I virus hanno una elevata frequenza di mutazione, sono al limite massimo della mutazione

consentita. Solo per i virus a RNA si parla di quasi specie!!!! Per un virus che si replica in un

ospite possiamo definire le sequenze che si replicano con successo e che rappresentano la

quasi-specie.

Le Sequenze Master sono le sequenze che ricorrono di più, le più frequenti; mi indica la

sequenza migliore in quel determinato organismo in quel momento.

La Sequenza Consensus è l’aa o il nucleotide che si presenta di più. Questa sequenza ci aiuta

a capire il genoma che si replica meglio.

Fatto su grandi numeri ci vengono date molte informazioni, la sequenza

master ci indica come varia il virus nell’organismo mentre la sequenza

consensus ci serve per sapere il prototipo migliore del virus in generale e

non solo in quell’organismo!!!

Basandoci sulla sequenza consenso si possono identificare le ORF e

creare degli Ab contro quelle proteine virali.

Sierotipo, utilizzo anticorpi, si differenziano in base alle loro

caratteristiche antigeniche;;

Genotipo, sequenziamento degli acidi nucleici, si differenziano in base alle loro sequenze

genomiche;

Il sierotipo si ottiene mediante Neutralizzazione in cui si valuta la capacità virale di replicare

dopo il contatto con Ab neutralizzanti. Verifico la presenza di Ab che impediscono l’infezione

virale. Il sierotipo è quello che induce la produzione di Ab.

Prendo del siero da un individuo che ha sviluppato Ab contro quel virus. Isolo poi il mio virus e lo

metto a contatto con gli Ab dell’individuo. Se gli Ab si legano al mio virus vuol dire che è lo

stesso dell’individuo mentre se non si legano vuol dire che è una Sottospecie.

Il genotipo si ottiene invece mediante Sequenziamento del Genoma. Il genotipo si basa sulla

comparazione delle sequenze genomiche e quindi delle sequenze consensus che chiamo

Genotipi, varianti della sequenza genomica. Per fare il genotipo c’è il problema che il

sequenziamento può essere fatto solo su DNA.

Ad esempio per il sequenziamento del genoma del poliomavirus, possiamo sintetizzare DNA in

provetta (PCR) ma ho bisogno di una trascrittasi inversa, primer e nucleotidi trifosfati.

Utilizzando la trascrittasi inversa ho una incidenza di errore molto alta, 3

mutazioni (1 mutazione ogni 2000). Una volta

ottenuto il genoma a DNA ne devo fare molte

copie e quindi lo inserisco nel plasmide attraverso

enzimi di restrizione. Il sequenziamento prevede

che il materiale da sequenziale sia suddiviso in 4

aliquote separate. Aggiungo poi dei

primer per il

sequenziamento e degli

oligonucleotidi

complementari. Devo denaturare il

plasmide (100°C) in modo da far

aprire la doppia elica.

Riabbasso poi la temperatura in

modo da far legare il primer ad una

estremità del DNA e innesco la replicazione del

DNA mediante nucleotidi trifosfati e in ogni provetta

aggiungo un solo desossinucelotide

trifosfato. Le provette differiscono solo

per il tipo di desossinucleotide

presente (ddATP, ddGTP, ddCTP,

ddTTP). L’allungamento della catena in

ogni reazione andrà avanti fino a che non si

interpone il desossinucleotide. Quindi avrò

vari frammenti diversi in ogni provetta.

Separo poi i diversi frammenti attraverso

elettroforesi in gel d’agarosio e sequenzio a seconda della

grandezza dei frammenti.

COLTURE CELLULARI:

Una coltura cellulare è costituita da un gruppo omogeneo di cellule eucaristiche provenienti da

tessuti animali. Le colture sono mantenute in vita per tempi anche molto lunghi, usando

condizioni sperimentali appropriati.

I Vantaggi delle colture cellulari sono:

- Sistemi semplificati e altamente riproducibili;

- Consentono l’analisi di meccanismi cellulari e molecolari;

- Controllo ambientale;

- Economicità e rapidità di risposta;

- Disponibilità;

Gli Svantaggi delle colture cellulari sono:

- Sistemi semplificati rispetto ad un organismo integrato;

- Condizioni di esposizione alle sostanze diverse da quelle in vivo;

- Difficoltà di correlare le concentrazioni in vitro con quelle in vivo;

- Le sostanze somministrate possono interagire con il terreno di coltura.

Le cellule possono essere separate sulla base della loro capacità di sopravvivenza in condizioni

ambientali avverse. I protocolli di isolamento sono:

• Dissociazione dei diversi tipi cellulari presenti nel tessuto demolendo la matrice

extracellulare e le giunzioni intercellulari che le mantengono unite (tripsina e/o

collagenasi) dissociando le singole cellule mediante tecniche meccaniche.

• Separazione delle cellule in diversi metodi:

a) Separando le cellule in base alle loro dimensioni e al loro peso, centrifugandole a

bassa velocità con l’ausilio di sostanze (es. Percoll, Ficoll o Lymphoprep) che

possono anche essere stratificate in gradienti a diversa densità;

b) Sfruttando la diversa attitudine dei diversi tipi cellulari ad aderire su superfici di

vetro o di plastica;

c) Marcando le cellule con anticorpi coniugati con sostanze fluorescenti, e poi

separando le cellule marcate da quelle non marcate;

d) Utilizzando terreni di coltura selettivi che favoriscano la crescita solo di alcuni tipi

cellulari e/o aggiungendo al terreno di coltura ormoni che favoriscono (o inibiscono)

la crescita di determinati tipi cellulari.

Le colture cellulari si distinguono a seconda che le cellule siano in Sospensione o Aderenti.

Le cellule di origine emopoietica, che normalmente crescono in mezzo fluido, crescono in

sospensione e si moltiplicano in vitro senza aderire.

Le cellule che fanno parte dei tessuti solidi crescono in vitro aderendo alla superficie delle

piastre da coltura, formando monostrati (se sono sane, in quanto risentono dell’inibizione da

contatto) o pluristrati (se sono tumorali e quindi non risentono dell’inibizione da contatto).

Le Colture Primarie sono colture preparate direttamente da un tessuto. Le cellule isolate da un

qualsiasi tessuto animale sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro,

dopodiché vanno incontro a degenerazione e morte. I vantaggi delle colture primarie è che

mantengono le caratteristiche delle cellule in vivo. Gli svantaggi sono che le cellule presentano

un numero finito di divisioni, la popolazione risulta essere eterogenea e l’isolamento è

complesso.

Per esempio, con un prelievo di sangue mi ritrovo molti eritrociti (non sono coltivabili in quanto

mancano del nucleo poiché derivano da eritroblasti – reticulociti – eritrociti) e Linfociti (sono

coltivabili!!!). La prima cosa che faccio per creare una coltura primaria è di evitare che il sangue

coaguli attraverso l’utilizzo di un anticoagulante come l’Eparina. Per poter estrarre i linfociti

devo eliminare i globuli rossi.

[Siero, parte liquida dopo la coagulazione del sangue; Plasma, parte liquida prima della

coagulazione].

I linfociti vengono messi in capsule Petri che vengono messe in sterilità con dei nutrienti e una

soluzione tampone, bicarbonato, tende a rilasciare CO e ad alcalinizzare il mezzo; per evitare

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ciò metto le colture in delle scatole dove c’è il 100% di umidità e dove si manda all’interno della

CO (5%) in modo che essendoci tanta CO questa non evaporerà da terra. Quindi non

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dissociandosi, il sale funziona perfettamente. Un’altra molecola tampone che si usa è l’Hepes,

con questo tampone non devo mettere CO .

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