Virologia medica

Microbiologia e virologia medica II anno – II Semestre

Virologia generale

Lezione 1

Virus è un agente infettivo (trasmissibile) di piccole dimensioni (microrganismo) e di semplice composizione solo all’interno di cellule viventi che è in grado di replicare animali, vegetali o batteri (deve infettare).

"Virus" = veleno. Termine dal latino. Il virus è qualcosa potenzialmente pericoloso.

D. Baltimore: "Un virus è un pezzo di cattive notizie (nell’acido nucleico) che viaggia, è racchiuso in un rivestimento, involucro proteico." È un'informazione, materiale genetico, che probabilmente causa malattie, racchiuso all’interno di proteine.

Caratteristiche dei virus

I virus sono ovunque, infettano tutto ciò che è composto da cellule, materiale vivente. Noi ingeriamo e respiriamo regolarmente milioni di virioni attraverso cibo, acqua, respiro e introduciamo dentro di noi una quantità elevata di virus senza accorgercene (solo quando causa malattia).

Alcuni virus rimangono per sempre persistenti nell’organismo. L’8% del materiale genetico umano è composto da sequenze endogene virali che derivano da infezioni ancestrali e si sono integrate nel genoma.

Teorie sull'origine dei virus

Esistono 3 teorie riguardo l’origine dei virus che non è ancora ben definita:

• Teoria regressiva: i virus derivano da una cellula eucariotica. Significa che la cellula perde tutto ciò che non è essenziale, fondamentale per la propria traduzione e diventa un parassita (mantiene talmente poche funzioni da dover infettare un’altra cellula per potersi replicare). Mantiene solo l’acido nucleico e un rivestimento proteico.
• Teoria dell’origine cellulare: i virus derivano da alcuni specifici geni cellulari e hanno sviluppato una loro capacità di replicazione parzialmente autonoma. A partire da una cellula eucariotica, alcuni geni (un po’ più sviluppati di altri) sono scappati e hanno creato una dimensione virale.
• Teoria dell’origine indipendente (più accreditata): i virus hanno una loro propria origine ed evoluzione indipendente, parallela a quella delle nostre cellule, si sono co-evoluti insieme.

I virus iniziano ad "abitare" la Terra nel periodo della comparsa degli RNA (circa 4/5 miliardi di anni fa). Gli RNA sono le uniche molecole che portano informazioni (sono acidi nucleici) e alcuni hanno una capacità auto-replicativa.

Concetti fondamentali

Questa teoria definisce alcuni concetti:

• La vita richiede autocatalisi: l’origine della vita richiede molecole in grado di catalizzare la produzione di altre molecole uguali a sé stesse.
• Necessità di informazione genetica per potersi replicare: se qualcosa nasce dal nulla, deve aver capacità di replicarsi ed evolvere. Il materiale genetico che ha la capacità di possedere informazioni e di autoreplicarle = RNA.

I virus compaiono circa 4 miliardi di anni fa.

Scoperte storiche sui virus

• 1500 a.C.: stele egizia con raffigurati due uomini con caratteristiche tipiche di sintomatologie virali, un uomo con due gambe di dimensioni diverse (probabilmente affetto da poliomielite a causa del virus poliovirus) e un altro con guance infossate (infezione da vaiolo).
• 1901: primo virus umano, virus della febbre gialla
• 1903: virus della rabbia
• 1906: virus variola
• 1908: virus della leucemia nel pollo, poliovirus
• 1911: Rous sarcoma virus
• 1915: batteriofagi
• 1933: virus dell’influenza

Oggi le tecnologie più avanzate permettono la scoperta e l'isolamento di virus più velocemente.

Virus: organismi viventi?

I virus sono organismi viventi? Sono endoparassiti (microrganismi che devono entrare in una cellula per potersi replicare). Sono in grado di replicare.

Caratteristiche che definiscono gli organismi viventi (e comparazione con capacità dei virus):

• Crescita: in grado di aumentare in dimensioni o numero di cellule. No, non possono crescere, ma si replicano e possono aumentare di numero.
• Organizzazione: molecole complesse basate su carbonio. No, solo acidi nucleici e proteine (semplici).
• Riproduzione: usando DNA o RNA. Sì, ma non da soli, necessario replicare all’interno di una cellula.
• Adattamento: capacità di evolvere, mutare. Sì, possono modificare il proprio contenuto genetico ma non per una loro volontà, per risposta a stimoli.
• Risposta a stimoli: aggiustamenti a cambiamenti ambientali. Sì, rispondono a stimoli chimici, fisici o al caso.

NB: Non bisogna pensare ai virus (e ai batteri) come qualcosa di antropomorfico. Non sono in grado di pensare, decidere, tutto è dovuto al caso o stimoli esterni.

I virus sono agenti passivi che hanno come unico obiettivo replicarsi. Vanno incontro a processi evolutivi passivi dovuti a pressioni selettive (evoluzione: stimolo ambientale, ciò che accade nella popolazione umana, fattori esterni…).

Stati del virus

Il virus esiste in due stati:

• All’esterno della cellula: Virione, particella virale. Non è un organismo vivente, non può fare niente e si disgrega (non esiste in natura).
• All’interno della cellula infettata: Virus. Ha alcune proprietà degli organismi viventi.

Dimensioni dei virus

Le dimensioni dei virus che infettano l’uomo vanno da circa 25 nm a 200 nm di diametro. Sono molto piccoli: non possono essere visti né a occhio nudo né al microscopio ottico perché hanno diametro sempre inferiore a 1 micron (virus che infettano cellule umane). Un virus è circa 10 volte più piccolo di un battere (10 volte più piccolo di una nostra cellula).

• Parvo virus: 25 nm di diametro, virus più piccolo.
• Herpes virus: 100 nm di diametro, virus più grande.

Componenti del virus

Tutti i virus hanno un genoma costituito da un acido nucleico (DNA/RNA) racchiuso all’interno di un capside proteico (involucro composto da tante piccole subunità proteiche).

• Genoma: acidi nucleici (DNA o RNA).
• Capside: rivestimento proteico + subunità proteiche.

Genoma + capside = nucleocapside. Se una di queste componenti viene distrutta, il virus non è in grado di infettare la cellula.

Alcuni virus, per loro natura, possiedono un terzo componente: l’envelope, un doppio strato fosfolipidico che è un rivestimento più esterno rispetto al capside, questo è biochimicamente identico alla nostra membrana cellulare. Sull’envelope sono sempre presenti delle componenti che protrudono: glicoproteine o spike.

NB: Non tutti i virus lo possiedono, ma quelli che lo hanno non lo possono perdere.

Classificazione

• Virus nudi: genoma + capside (sempre).
• Virus con envelope: genoma + capside + envelope (sempre, per natura).

Envelope è un doppio strato fosfolipidico. Presenta glicoproteine o spike (di origine virale, codificate dal genoma del virus) che protrudono dall’envelope e sono una componente del virus.

Deriva dalla cellula dell’ospite che è stata infettata dal virus. È acquisito durante l’uscita del virus dalla cellula, nella maggior parte dei casi, deriva dalla membrana cellulare (alcuni virus lo acquisiscono dalla membrana nucleare, del reticolo o del Golgi). L’uscita del virus dalla cellula prendendo un pezzo di membrana è chiamato budding o esocitosi o gemmazione. L’ingresso mediato dell’envelope con la membrana cellulare è chiamato fusione.

Le spike, di origine virale, sono trovate dal virus sulla membrana cellulare (erano state depositate qui dopo la loro traduzione). Le spike, nella maggior parte dei casi, rappresentano i recettori virali, cioè la parte del virus che riconosce la cellula da infettare e lega il recettore cellulare. Sono la parte più antigenica dei virus, parte verso la quale noi sviluppiamo anticorpi per difenderci.

Capside

Il capside è il rivestimento proteico del genoma virale. Protegge il genoma virale dall’attacco delle endonucleasi dell’ospite, da qualsiasi agente chimico/fisico esterno. È formato da subunità proteiche piccole, monomeriche che si ripetono, chiamate capsomeri.

Nei virus nudi, il capside è la parte più esterna del virione, è sede dei recettori virali ed è la parte più antigenica dei virus. Non è formato da un’unica grande proteina ma da tanti capsomeri che si ripetono per motivi di economia genomica. I virus, essendo molto piccoli e con genoma molto piccolo, non possono sprecare molte paia di basi per trascrivere e tradurre una grande proteina. La struttura deve essere molto solida, è la parte esterna del virus. Tante proteine piccole uguali permettono di svolgere la stessa funzione se per qualche motivo una venisse attaccata.

Seguono nella loro composizione due specifiche simmetrie:

• Icosaedrica: Es.: Picornavirus, la subunità monomerica che si ripete nella formazione del capside è il triangolo formato a sua volta da 4 proteine (VP1, VP2, VP3, VP4), il capsomero è la subunità che si ripete continuamente.
• Elicoidale: Le proteine si dispongono attorno al genoma con una simmetria rotazionale.
• Complessa (non riguardano l’uomo): Pochi hanno una simmetria capsidica complessa.

Il capside assume una simmetria perché permette di minimizzare le interazioni tra le varie unità che sono energicamente più stabili (legami). I legami tra i monomeri non sono covalenti ma deboli. I capsomeri si dispongono in modo completamente autonomo, spontaneo nella struttura che minimizza i legami.

Genoma

Può essere a RNA o DNA. ("Virus molto grandi"). Dimensioni: da circa 2500 bp a 200.000 bp.

A DNA

Rappresentano il 30% di tutti i virus conosciuti. Nella maggior parte dei casi sono a doppio filamento (double strand DNA). Può essere lineare o circolare.

Esistono due eccezioni:

• Parvovirus con un genoma a DNA a singolo filamento.
• Hepadnavirus (epatite B) con un genoma a doppio filamento circolare incompleto, uno dei filamenti presenta dei gap, aperture.

A RNA

Rappresenta il 70% dei virus conosciuti. È sempre lineare. Nella maggior parte dei casi è a singolo filamento. Può avere due polarità: RNA 5’-3’, o messaggero che può essere direttamente tradotto, senso, positivo; antisenso, negativo, non direttamente tradotto 3’-5’.

Eccezioni: i Reovirus con genoma a doppio filamento.

Possono avere un genoma a RNA composto da un’unica molecola o segmentato (tagliato in pezzi diversi). La polarità determina la modalità di replicazione del virus.

Es.: Virus dell’influenza (ssRNA, negativo, segmentato): 8 segmenti di RNA e 8 capsidi distinti che rivestono ciascun segmento. Possiede envelope.

Evoluzione dei virus

L’evoluzione dei virus è unicamente dovuta all’inserimento di mutazioni durante il ciclo replicativo. Il livello di mutazione è direttamente legato alla polimerasi che usano per la loro replicazione. I virus a RNA sono più propensi a mutazioni perché non hanno attività di proof reading, presentano una mutazione ogni 10⁴/10⁵ nucleotidi.

Nei virus a DNA si usano DNA polimerasi con sistema di proof reading, per cui è più difficile che mutino, evolvono meno facilmente. Il virus non ha interesse ad evolvere e mutare in modo drastico perché se evolvesse in modo da non essere più riconosciuto in nessun modo dal sistema immunitario, ucciderebbe l’ospite. Un virus con queste caratteristiche non sopravvivrebbe alla selezione naturale; le alterazioni estreme non sopravvivono alla selezione.

L’evoluzione del virus non può in nessun modo cambiare la natura del virus (sempre RNA, DNA; sempre envelope o no).

Nomenclatura

Il nome può basarsi sulla malattia che causa; dipende dal nome di chi lo ha scoperto; dalla regione geografica nel quale è stato scoperto; latino, nomi africani…

È necessario dare un ordine universale: International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). Prevede una gerarchia partendo da grossi gruppi fino ad arrivare al singolo virus.

• Ordini, al cui interno ci sono tante famiglie (si basano sulla morfologia del virus) e all’interno si possono avere generi e molte specie.
• Non tutte le famiglie appartengono ad un ordine.
• Non tutte le famiglie hanno delle sottofamiglie ma sicuramente hanno dei generi e molte specie.

La classificazione è sulla base di: tipo di genoma, simmetria del capside, presenza/assenza envelope, dimensioni.

Replicazione dei virus

Lezione 2

Come il virus infetta la cellula e si replica all’interno di essa.

Ciascun virus deve essere in grado di riconoscere una cellula all’interno della quale deve potersi replicare. Il modello replicativo seguito dal virus dipende dal tipo di acido nucleico presente nel capside ciascuna categoria di virus avrà replicazione diversa, ma ci sono principi che valgono per tutti:

• Scopo è quello di formare una particella virale identica a sé stessa, ossia entrare nella cellula e moltiplicarsi creando tante copie identiche a sé stesso; impacchettare un genoma identico al suo all’interno di un capside identico a quello entrato;
• Virus deve uscire dalla cellula per andare a diffondersi di cellula in cellula e continuare il modello replicato.

Il genoma del virus, nonostante sia piccolo, contiene tutte le informazioni che servono al virus per iniziare sua replicazione successivamente, il virus si appoggia alla cellula utilizzando i suoi ribosomi, enzimi, nucleotidi. Per il virus non è semplice completare il proprio ciclo replicativo perché deve trovare una cellula da infettare, riconoscerla, infettarla, replicarsi e uscire; la cellula oppone resistenza. Il virus deve risolvere in particolare 3 problemi per potersi replicare:

• Deve replicare una copia di sé stesso all’interno della cellula.
• Uscire da cellula e diffondersi di cellula in cellula.
• Evadere, superare le difese dell’ospite.

Se riesce a fare questo, causerà una malattia, una patologia. Tutti i virus attuano delle proprie, singole strategie per risolvere questi problemi e compiono il ciclo replicativo o ciclo vitale di un virus (inizia quando il virus riconosce la cellula e termina quando esce da essa).

Il ciclo comprende 8 steps sempre nello stesso ordine:

• Trovare una cellula dell’ospite in cui potersi replicare
• Legarsi alla cellula
• Entrare nella cellula
• Svestirsi, rilasciare il proprio genoma all’interno della cellula per:
• Replicare il proprio genoma
• Trascrivere e tradurre il genoma in proteine virali (proteine del capside e glicoproteine dell’envelope e polimerasi)
• Impacchettare il genoma e le proteine creando nuove particelle virali
• Uscire dalla cellula

Da un virus si ottengono milioni di virus: crescita della produzione. Non esiste una "consecutio temporum" così netta: ci possono essere virus in varie fasi del ciclo che si sovrappongono. Ciascun virus esce dalla cellula esattamente come è entrato (salvo piccole mutazioni).

Cellule suscettibili e permissive

Cellula suscettibile: permette al virus di entrare nella cellula. La cellula ha dei recettori specifici funzionali che vengono riconosciuti dal virus.

Cellula resistente: non permette al virus di entrare nella cellula perché non ha recettori specifici per esso.

Cellula permissiva: permette al virus di replicarsi al suo interno (specificità, alcune cellule possono esserlo per alcuni virus, altre no).

NB: Una cellula può essere suscettibile e permissiva a un virus: permette al virus di entrare e di replicarsi. Una cellula può essere resistente, ma permissiva: anche se non ha recettori, se si inietta il virus al suo interno essa permette la sua replicazione. Può essere anche una cellula suscettibile, ma non permissiva.

Regola generale:

• I virus a RNA compiono il loro ciclo replicativo completamente all’interno del citoplasma e non entrano nel nucleo, non ne necessitano per replicarsi (tranne eccezioni: ortomixovirus).
• I virus a DNA devono entrare nel nucleo della cellula ospite, si replicano in parte nel nucleo ma in parte anche nel citoplasma.

Riconoscimento della cellula ospite

Avviene mediante riconoscimento e legame da parte di recettori virali e cellulari: parte del virus riconosce parte della cellula suscettibile. Sia il recettore virale sia il recettore cellulare sono molecole di natura proteica o glicoproteica già presenti sulla superficie della cellula per altri motivi.

Recettori virali

• Virus nudo: si trovano sul capside.
• Virus con envelope: recettori sono le glicoproteine o spike sulla superficie.

Recettori cellulari

Il virus può riconoscere svariate proteine di membrana già presenti sulla superficie cellulare che normalmente svolgono altre funzioni:

• Molecole appartenenti a superfamiglia immunoglobuline-like.
• Recettori associati a membrana.
• Trasportatori e canali transmembrana.

Già dal primo legame con la cellula il virus va a sovvertire la funzione della cellula. Il legame tra il recettore virale e cellulare è forte e altamente specifico: ciascun virus riconosce uno o più specifici recettori cellulari, il che determina il tropismo del virus.

Es.: Virus rabbia: riconosce recettore acetilcolina su cellule nervose.