Microbiologia e virologia medica

Struttura, genetica ed evoluzione dei virus

Definizione

Tratta dall'enciclopedia britannica: "Un virus è un agente infettivo di piccole dimensioni e di semplice composizione, in grado di replicarsi in cellule viventi (animali, piante e batteri)".

Il microrganismo è composto solo da due parti fondamentali: parte proteica e parte genomica (acidi nucleici). Non è possibile una replicazione autonoma, avviene solo in una cellula ospite.

Il virus deriva dal latino 'veleno'. D. Baltimore: "il virus è un pezzo di cattive notizie all'interno di un rivestimento proteico".

Un virus ha una porzione di informazione (materiale genetico) racchiuso in un involucro proteico e infetta tutto ciò che è vivente. Ci sono più virus in un litro di acqua di mare che persone sulla Terra. Nel materiale genetico umano sono presenti anche porzioni di origine virale.

Origine

Esistono tre diverse teorie che cercano di spiegare l'origine dei virus:

• Teoria Regressiva: derivano da parassiti intracellulari, hanno perso la maggior parte del materiale genetico, mantenendo solo i geni essenziali.
• Evoluzione Riduttiva: virus derivano da cellule eucariotiche, mitocondri si sono evoluti e sono diventati virus.
• Teoria dell'entità indipendente: virus vi sono fin dall'origine della vita, hanno avuto un'evoluzione indipendente rispetto alle cellule, teoria più accreditata.

È necessaria informazione genetica per la replicazione, capacità di autocatalisi dell'RNA: alcune molecole di RNA catalizzano la propria sintesi. L'origine della vita richiede molecole con l'abilità di catalizzare la produzione di molecole uguali a se stesse. L'RNA può sia contenere l'informazione genetica che catalizzare reazioni (ad esempio di sintesi di molecole uguali ad esse). I virus nascono insieme all'RNA 5 bilioni di anni fa, poi hanno acquisito le proteine e evolvono continuamente.

Storia

• 1901: scoperto il primo virus umano, quello della febbre gialla.
• 1903: scoperto virus della rabbia.
• 1906: scoperto virus del vaiolo.
• 1908: scoperto poliovirus.
• 1911: scoperto virus del sarcoma di Rous.
• 1915: scoperti batteriofagi.
• 1933: scoperto virus dell'influenza.

I virus possono essere considerati come viventi?

È necessario che entrino in una cellula vivente per poter essere replicati. Un essere vivente presenta:

• Crescita: aumento in numero e dimensione delle cellule.
• Organizzazione: complessa, basata sulle molecole derivanti dal carbonio.
• Riproduzione, di cui i virus sono capaci.
• Capacità di evoluzione e adattamento a diverse condizioni ambientali.

È importante evitare di immaginare il virus come qualcosa di antropomorfico, non si deve pensare che il virus 'decide' di fare qualcosa. È un agente passivo. La replicazione è l'unico scopo del virus. Tutto ciò che succede è frutto del caso e dell'evoluzione, effetto di diversi fattori che stanno all'esterno.

Il virus esiste in due diverse forme:

• Virione/particella virale: quando non si trova all'esterno di una cellula vivente, è inerme.
• Virus: quando infetta una cellula vivente, assume caratteristiche di vivente.

Dimensioni

I virus sono visibili solo al microscopio elettronico. Hanno dimensioni inferiori al micron (nm). Il parvovirus è quello che ha dimensioni minori: 25 nm di diametro. L'herpes è quello che ha dimensioni maggiori: 100 nm di diametro. I virus che infettano l'uomo hanno dimensioni comprese tra 25 e 100 nm.

Componenti di un virus

• Genoma: acidi nucleici DNA/RNA (mai contemporaneamente, solo uno o l'altro).
• Capside: genoma è circondato da involucro proteico.
• Envelope: rivestimento più esterno rispetto al capside, biochimicamente identico alla membrana cellulare.

Il genoma più il capside formano il nucleocapside. Solo alcuni virus sono dotati anche di un envelope. Se il genoma più il capside è un virus nudo, l'envelope è una doppia membrana fosfolipidica, la parte più esterna di alcuni virus. Contiene strutture per il riconoscimento delle cellule da infettare: recettori e binding site. Di natura cellulare, deriva dalla membrana della cellula ospite (durante esocitosi, quando esce dalla cellula). Presenti alcune glicoproteine (spikes) codificate dal virus che servono a riconoscere le cellule, sono specifiche per virus.

L'envelope viene acquisito durante la gemmazione di un nucleocapside attraverso una membrana cellulare. Può essere una membrana di qualsiasi cellula, ma è virus-specifica. Eccezione: alcuni virus lo acquisiscono mentre sono nella cellula, da membrana del nucleo, del reticolo, del Golgi. Se acquisito da nucleo, rompe la cellula per uscire. Preso sempre o da membrana, o da nucleo, ecc...

Penetrazione mediante fusione

Entrata nella cellula mediante fusione delle membrane, avvicinamento tra envelope del virus e membrana della cellula da infettare.

Glicoproteine

Poste sull'envelope, possono legare i recettori della cellula ospite. Sono proteine transmembrana, una di esse ha attività fusogena e aiuta a fondere la membrana e l’envelope. Sono la parte più esterna di un virus, proteine antigeniche quindi possono essere sviluppati degli anticorpi contro di esse, permettendo il riconoscimento del virus da parte di anticorpi.

Naked virus

I Polyomavirus e Adenovirus sono dotati di capside, che protegge il genoma virale dalle endonucleasi. È composto da capsomeri, contiene siti di binding e recettori per riconoscere la cellula ospite (antigeni riconoscibili dal sistema immunitario). Il capside è formato solo da proteine molto piccole, ripetute tante volte, capsomeri uguali, unità ripetute che si dispongono intorno al genoma, sempre nello stesso modo. Formano struttura con diversi assi di simmetria: icosaedrica o elicoidale. Capsomeri sempre lo stesso gene che si ripete, economia genomica, consente di avere un genoma più piccolo, geni molto corti. Numero massimo di informazione, nel numero minimo dei nucleotidi possibili.

Ripetizione di tanti capsomeri uguali perché sono sostituibili nel caso in cui si rompa una proteina, meglio se ce ne sono tante uguali e che svolgono la stessa funzione. Simmetrie sono favorite a livello energetico, danno massima stabilità con il minimo dispendio energetico. Fra capsomeri vi sono interazioni deboli, non legami covalenti.

Simmetria icosaedrica

Il capsomero è formato da diverse subunità. Il triangolo è un'unità che si ripete nel capsomero. Il capsomero è formato da subunità diverse (VP1, VP2, VP3, VP4). Diversa disposizione simmetrica dei capsomeri, formano una struttura elicoidale. I capsomeri si dispongono come se fossero gradini di una scala a chiocciola, seguendo l'andamento elicoidale dell’acido nucleico. I batteriofagi hanno una simmetria complessa.

Genoma virale

• Grandezza
• RNA o DNA
• Numero dei filamenti (a singolo o doppio filamento)
• Polarità del filamento singolo di RNA (senso o antisenso)
• Lineare o circolare
• Molecola unica o segmentato

Dimensione

I virus che infettano l'essere umano hanno un genoma lungo da un minimo di 3.000 paia di basi, fino a 200.000 pb.

Genoma a DNA

Il 30% dei virus hanno un virus a DNA, soprattutto a doppio filamento, circolare o lineare. Eccezioni:

• Hepadnavirus (epatite B, HBV): circolare ma a doppio filamento segmentato, ha dei gap.
• Parvovirus: lineare a singolo filamento.

Genoma a RNA

Il 70% dei virus hanno RNA sempre lineare, quasi sempre a singolo filamento. Eccezioni:

• Reovirus: RNA a doppio filamento segmentato.
• Orthomyxovirus (influenza): a singolo filamento, segmentato, otto segmenti, 8 molecole che compongono il genoma.

Replicazione e trascrizione avvengono soprattutto nel citoplasma. Otto segmenti di RNA singolo filamento antisenso, polarità negativa. Blu è il capside che riveste RNA. Sono visibili 8 capsidi, se il genoma è segmentato, vi è un capside per ogni segmento. I virus che hanno polarità negativa portano sempre con sé una RNA polimerasi (in rosso, una per ogni segmento di RNA).

Polarità

• Filamento senso: come mRNA (Poliovirus).
• Filamento antisenso: complementare all'mRNA (Rabdhoviridae, Morbillivirus, Orthomixovirus).

Nomenclatura

Il nome dei virus è basato su:

• Malattia che provocano: Poliovirus, Rabies virus.
• Localizzazione geografica: Sendai virus, Coxsackie virus.
• Nome dello scopritore: Epstein-Barr virus.
• Come si pensava si potessero contrarre inizialmente: Dengue virus (evil spirit), Influenza virus (influenza dell'aria cattiva).
• Combinazione dei precedenti: Rous Sarcoma virus.

Sistema di classificazione universale, tassonomia di tipo gerarchico:

• Ordine (-virales)
• Famiglia (-viridae)
• Sottofamiglia (-virinae)
• Genere (-virus)
• Specie

Non tutte le famiglie appartengono a un ordine. Non tutte le famiglie hanno una sottofamiglia. Certe famiglie hanno un solo genere, altre hanno più generi.

Caratteristiche dei virus da tenere in considerazione:

• Natura dell'acido nucleico: RNA o DNA
• Simmetria del capside
• Presenza o assenza di un'envelope
• Dimensione del virione e del capside

Evoluzione

Dovuta alle mutazioni che avvengono nel genoma quando si replicano. RNA soggetto molto più facilmente alle mutazioni, RNA polimerasi non hanno attività proofreading (1 errore ogni 10.000 pb). DNA ha un sistema evolutivo limitato, DNA polimerasi hanno attività proofreading. Le mutazioni si verificano durante la replicazione, evoluzione può avvenire solo se si verificano mutazioni nella popolazione. Alterazioni estreme nel genoma virale non sopravvivono alla selezione.

L'evoluzione dei virus deve seguire certe regole:

• Non può essere persa o acquisita envelope.
• Genoma a DNA non può diventare a RNA e viceversa.
• Non può cambiare la strategia replicativa.
• Il capside non può cambiare simmetria.

Se un virus muta così tanto da diventare nuovo, presenta nuovi antigeni che non vengono riconosciuti, in seguito all'infezione morirebbe tutta la popolazione. Ma ciò non è conveniente per il virus, perché il suo scopo non è quello di distruggere l'ospite, ma di replicarsi ininterrottamente e in miliardi di copie mantenendo costante il recettore e il modello replicativo.

Infezione e replicazione all'interno di una cellula da parte di un virus

In natura molteplici virus infettano una cellula. Tutti i virus impacchettano il proprio genoma all'interno di una particella che media la trasmissione del genoma virale da un ospite all'altro. Esistono diverse categorie di un virus, determinate prevalentemente dal tipo di acido nucleico presente nel capside. L'acido nucleico determina il tipo di replicazione. Il genoma virale contiene le informazioni per iniziare e completare un ciclo di infezione in una cellula suscettibile e permissiva.

Principi che valgono per la replicazione di tutti i virus:

• Lo scopo di tutti i virus è quello di formare una particella virale che sia identica a se stessa, entrare nella cellula, moltiplicarsi e creare tante copie identiche a se stesso, impacchettare il genoma all'interno della cellula ed uscire dalla cellula.

Diffusione di cellula in cellula, continuazione del modello replicativo.

Il genoma contiene le informazioni per iniziare la replicazione, utilizzo di enzimi e di organelli della cellula. Non è semplice completare il ciclo replicativo: trovare, riconoscere, entrare, replicarsi ed uscire da una cellula (che oppone resistenza), risoluzione del problema per motivi meccanicistici e di evoluzione.

3 problemi principali:

• Il virus si deve replicare, creare copia di se stesso e produrre mRNA per la produzione di proteine.
• Deve uscire.
• Deve evadere le difese della cellula ospite.

Tutti i virus devono risolvere questi problemi nel ciclo vitale di un virus. Esistono differenze da virus a virus, ma il ciclo può essere riassunto in otto diversi step:

• Trovare una cellula ospite nella quale può replicarsi.
• Legarsi alla cellula in seguito al riconoscimento.
• Entrare.
• Rilasciare il suo genoma dal rivestimento proteico per poterlo replicare.
• Replicazione del genoma.
• Trascrivere e tradurre il genoma in proteine virali (del capside, polimerasi, glicoproteine dell'envelope).
• Packaging del genoma, creazione di nuovi virioni.
• Uscita dalla cellula.

Da uno, ottengo milioni di virus.

Definizioni

• Cellula suscettibile alle infezioni di un virus: permesso al virus di entrare nella cellula, ha recettori che sono riconosciuti dal virus.
• Cellule resistenti al virus: non permessa l'entrata, non hanno recettori specifici per il virus.
• Cellule permissive: permessa replicazione del virus all'interno della cellula.
• Una cellula può essere permissiva e suscettibile.
• Una cellula può essere resistente ma permissiva (es. se virus iniettato in laboratorio).
• Una cellula può essere suscettibile ma non permissiva.
• Solo una cellula permissiva e suscettibile può permettere l'entrata di un virus e la sua replicazione all'interno.

Regola: i virus ad RNA compiono il loro ciclo replicativo all'interno del citoplasma, non entrano mai nel nucleo (eventuali eccezioni). I virus a DNA devono entrare nel nucleo, replicano sia nel nucleo che nel citoplasma (alcuni step). In una cellula possono trovarsi diverse particelle virali che si trovano a step diversi del ciclo replicativo.

Ciclo virale di un virus

1) Attacco alla cellula ospite

Riconoscimento da parte del recettore virale di specifico recettore cellulare, legame. I recettori sono molecole di natura proteica o glicoproteica. Se il virus è nudo, i recettori virali saranno una parte del capsomero. Se il virus ha envelope, i recettori sono le glicoproteine.

Riconosciute proteine della membrana cellulare (immunoglobuline, recettori di membrana, canali e trasportatori transmembrana) che hanno delle funzioni fisiologiche, molecole preesistenti che fanno altro. Il virus sovvertisce l'equilibrio della cellula legandosi a queste proteine. Il riconoscimento è molto specifico, esclusivo di una molecola presente sulle cellule, altissima specificità di riconoscimento recettore virale e recettore cellulare.

Specificità determina il tropismo virale: in base ai recettori presenti su una cellula, specifico virus attacca solo cellule di un determinato tessuto/organo, tipo di cellule ospiti nelle quali il virus può replicarsi. HIV ha tropismo per i linfociti. Rabbia ha neurotropismo (cellule del sistema nervoso). Di solito un recettore virale lega un recettore cellulare. Ma alcuni virus richiedono la presenza di un corecettore, es. recettore HIV CD4, co-recettore CCR5.

2) Penetrazione nella cellula ospite

Può avvenire attraverso modalità differenti a seconda che il virus sia nudo oppure con envelope:

• Se virus nudo: legame recettore/recettore si ha viropessi o endocitosi mediata da recettore, si crea vescicola di membrana che trasporta all'interno della cellula i virioni, formazione di introflessioni della membrana rivestite di clatrina, in alcuni casi entra solo l'acido nucleico.
• Se virus possiede envelope: entra mediante processo di fusione envelope/membrana cellulare, glicoproteine virali hanno dominio fusogeno, eventuale entrata con endocitosi e fusione con vescicola endocitotica.

3) Uncoating

Svestimento, il virus deve perdere il rivestimento proteico. Uno degli step meno studiati, non interferisce con step successivi di replicazione. Il capside si disgrega, formato da capsomeri uniti da legami deboli (basato su energia).

4) Replicazione del genoma e espressione dei geni virali

5) Assemblamento e maturazione

Impacchettamento, maturazione del virus. Coinvolge componenti necessarie affinché il virione diventi una particella virale matura (virus). Formazione del capside, impacchettamento avviene nel nucleo se virus a DNA, nel citoplasma se virus a RNA. Maturazione, il virus diventa infettivo. Cambiamenti strutturali nella particella virale, clivaggio di proteine specifiche del capside, cambiamenti conformazionali, utilizzo di proteasi.

6) Rilascio del virus dalla cellula

Se virus nudo, senza envelope: uscita attraverso metodo litico, lisi cellulare. Il virus ha accumulato talmente tanti virioni che la cellula esplode (es. Herpes, poliovirus). Alcune volte possono uscire mediante processo di esocitosi (raro).

Se hanno envelope devono acquisirlo prima di uscire, serve envelope e glicoproteine. Durante trascrizione delle glicoproteine trasporto sulla membrana cellulare, glicoproteine tradotte nella cellula, glicosilate nel Golgi e poi spostate sulla membrana, il virus si avvicina alla membrana e porta via porzione di membrana (ha glicoproteine). Sulla membrana sono presenti anche antigeni virali, facile attacco da parte del sistema immunitario. Normalmente i virus con envelope (da membrana cellulare) escono per budding/gemmazione, il virus fuoriesce dalla cellula portandosi dietro un pezzo di membrana plasmatica. Herpes virus prende membrana dal nucleo, non necessita di uscire per budding, quindi distrugge la cellula (lisi, non gli serve prendere la membrana perché ce l'ha già dal nucleo).

Replicazione del genoma ed espressione delle proteine virali

In base alla natura del proprio acido nucleico, ciascun virus ha diversa strategia di replicazione. Tutti i virus possono essere suddivisi in 7 gruppi secondo uno schema proposto nel 1971 da David Baltimore.