Virologia medica

PBS

sequenza (primer binding site) composta da 18 nucleotidi, sequenza alla quale si lega il tRNA per la lisina che il

virus si porta nel virione, quindi rappresenta l’inizio di tutta la retrotrascrizione. Poi c’è un’atra sequenza leader non

tradotta. Verso l’estremità 3’, dopo le sequenze codificanti, si trova una corta sequenza di 10 residui AG che si chiama

U3

PPT (poli purin tract). Poi si ha una regione (untranslated 3). Questo è l’RNA come entra nella cellula, quello

presente nel virione maturo. Ha i cap al 5’ e la coda di poli(A) al 3’.

Quindi riassumendo:

R region: corta sequenza ripetuta alle due estremità del genoma.

 U5: regione non codificante unica di 75-250 nt. È la prima parte del genoma ad essere trascritta formando

 l’estremità 3’ del genoma provirale.

PB: primer binding site di 18 nt complementari all’estremità 3’ dello specifico tRNA primer necessario all’inizio

 della trascrizione inversa.

Leader: regione relativamente lunga non tradotta a valle del sito d’inizio della trascrizione, presente

 all’estremità 5’ di tutti gli mRNA virali.

PPT: (polypurine tract) corta

 sequenza di 10 residui AG

responsabili dell’inizio della

sintesi del filamento positivo

durante la retrotrascrizione.

U3: regione non codificante unica

 di 200-1200 nt. Forma l’estremità

5’ del genoma provirale. Contiene

gli elementi promotore per la

trascrizione del provirus (TATA

box, CAT box).

Ciclo replicativo

Comincia con il legame tra il virus e la

cellula. Il recettore virale è costituito da

gp120 che va a riconoscere un esclusivo

recettore cellulare, un recettore ad alta

affinità: il CD4 presente per l’80% sui

linfociti T, ma che si trova in bassa

percentuale anche sui macrofagi, monociti,

cellule dendritiche e cellule gliali. HIV ha

bisogno anche di un corecettore, non gli

basta solo CD4 (CD4 è necessario, ma

non sufficiente). In realtà HIV riconsoce

due corecettori che si chiamano CXCR4 e

CCR5 che sono molecole che funzionano

da recettori per le chemochine solitamente.

Il primo si trova sui linfociti T, mentre il

secondo su macrofagi, monociti, cellule

dendritiche e cellule gliali.

Gp120 lega CD4

 A questo punto Gp120 più CD4 lega i corecettori CCR5/CXCR4

 Modificazione conformazionale di gp120 che si sposta e lascia libera la gp41 che ha un dominio fusogeno

 (permette la fusione tra HIV e cellula). La gp41 fonde l’envelope con la membrana cellulare.

Il virus può entrare nel citoplasma

 Il virus toglie il capside (uncoating)

 Il virus inizia le fasi di replicazione citoplasmatica che si riassumono con gli eventi di retrotrascrizione che

 avviene completamente ad opera della retrotrascrittasi (utilizza solo i nucleotidi cellulari, ma per il resto fa tutto

lei). La retrotrascrittasi parte da un RNA ss positivo (genoma virale) e crea un DNA double srand che viene

chiamato genoma provirale. La trascrittasi inversa utilizza ioni magnesio e un primer per iniziare la sintesi di

DNA a partire da RNA. Il primer è il tRNAlys complementare alla sequenza PBS presente nel genoma virale.

Step della retrotrascrizione:

1. RNA si lega al tRNA che si lega a sua volta al PBS

2. Legame tra tRNA e PBS permette la definizione di un primer per la retrotrascrizione. L’enzima si lega e

retrotrascrive il 5’ del genoma virale.

3. Si viene a creare un ibrido DNA-RNA, la

retrotrascrittasi agisce da RNAsi H quindi

taglia tutto l’RNA appaiato al DNA.

4. Primo salto della retrotrascrittasi: Il pezzo

di DNA si stacca e si sposta al 3’ dove

trova sequenze complementari (a livello

della regione r)

5. La retrotrascrittasi trascrive ciò che trova di

RNA a DNA e arriva al 5’. Si ha di nuovo

un ibrido DNA-RNA.

6. RNAsi H taglia tutto l’RNA appaiato a DNA. RNAsi H ha difficoltà a tagliare il tratto purinico quindi lascia un

pezzo di ibrido piccolissimo che serve come primer per la retrotrascrittasi.

7. Ora la retrotrascrittasi agisce come DNA polimerasi DNA-dipendente quindi si lega al tratto polipurinico e

sintetizza DNA.

8. Secondo salto della retrotrascrittasi: i due filamenti si staccano e quello sotto si sposta al 5’ perché incontra il

suo complementare, ovvero il segmento PBS.

9. La retrotrascrittasi finisce il suo lavoro formando due filamenti che hanno le estremità identiche.

La retrotrascrittasi agisce prima come DNA polimerasi RNA-dipendente, poi come RNAsi H e infine come DNA

polimerasi DNA-dipendente. Le due sequenze che si creano identiche alle estremità del ds DNA prendono il nome di

LTR (long terminal repeat). L’azione della retrotrascrittasi crea dei filamenti più lunghi dell’RNA di partenza. Il DNA a

doppio filamento va nel nucleo dove inizia gli eventi nucleari di replicazione. Il DNA provirale si va ad integrare all’interno

del nostro genoma grazie all’enzima integrasi che taglia il DNA dell’ospite e integra il DNA del provirus. Questo evento è

del tutto casuale per l’ospite quindi può avvenire in un punto a caso del nostro genoma. Il DNA del virus viene sottoposto

a tutti i processi di trascrizione e traduzione dell’ospite. Si creano le proteine virali e anche il genoma virale attraverso il

macchinario cellulare, che poi verrà impacchettato nel virione.

L’integrazione è dovuta all’enzima integrasi. È un evento specifico per quanto riguarda il virus, ma estremamente

casuale per l’ospite. Può integrarsi all’interno di un introne o di sequenze silenziate oppure in geni costitutivamente

espressi. Se il virus va a replicarsi all’interno di una sequenza silenziata, non verrà replicato. Non si parla di un solo

virus, ma di milioni quindi la probabilità è massima per cui il virus venga replicato.

Perché un virus preferisce integrarsi all’interno dell’ospite?

Il virus crea un’infezione persistente, rimane tutta la vita all’interno dell’ospite quindi è un vantaggio per il virus. Inoltre

per evadere dal sistema immunitario, il modo migliore è entrare nel genoma dell’ospite, di mimetizzarsi nel suo genoma.

Il motivo per cui HIV fa tutta la procedura di trascrizione è per riuscire a evadere il sistema immunitario e integrarsi.

Ottenuto il DNA e integrato

Utilizza le polimerasi cellulari per trascrivere il messaggero e tradurre le proprie proteine. Le LTR sono regioni trascritte,

ma non tradotte e hanno il compito di funzionare come promoter ed enhancer per la trascrizione (regioni regolatorie). La

traduzione delle proteine avviene secondo tempi diversi e si creano delle poliproteine tra cui la proteina env che viene

tagliata da una proteasi a creare le due glicoproteine di superficie. Poi si ha la sequenza codificante per gag che viene

tradotta in un’unica poliproteina successivamente clivata. In alternativa si crea una grande proteina gag-pol

successivamente modificata. HIV codifica anche per altre proteine chiamate accessorie tra cui la TAT (proteina

transattivante), la sua produzione ha il compito di favorire la trascrizione di altri geni e attivare ulteriormente la

replicazione del virus. Lega inoltre altri promotori virali, favorendo le coinfezioni (favorendo la replicazione di altri virus).

Le altre proteine partecipano ad un ulteriore evasione dal sistema immunitario oppure partecipano alla traslocazione

delle altre componenti del virus. Le particelle virali si assemblano nel citoplasma vicino alla membrana, nel momento in

cui inizia il budding, le proteasi tagliano tutte le proteine ancora non mature. Durante tutto questo processo di

replicazione e rilascio dei virioni, la retrotrascrittasi introduce delle mutazioni (in media almeno una per ciclo di

replicazione per ciascuno dei genomi).

Patogenesi

Modalità di trasmissione:

Via sessuale: attraverso rapporti sessuali non protetti sia omosessuali sia eterosessuali.

 Via parenterale (attraverso sangue infetto).

 Via verticale: si trasmette al momento del parto e con l’allattamento.



I virus, per la maggior parte dei casi, entra a livello delle mucose del sistema genitale, a livello delle mucose trova

principalmente cellule dendritiche, macrofagi e monociti (presenta il recettore CD4 anche se a minor livello). Nei primi

due giorni, queste cellule che hanno internalizzato il virus vanno a fondersi con i linfociti T CD4, il virus viene rilasciato

dalle cellule CCR5 e si diffonde a livello di tutti i T CD4. Questi linfociti si diffondono a livello sistemico, entra nel torrente

circolatorio e raggiunge gli organi più irrorati: milza, tessuto linfoide associato all’intestino, linfonodi, il cervello. In cinque

giorni il virus ha raggiunto tutti questi tessuti e inizia la fase di replicazione acuta. Ci sono linfociti T di memoria, che non

sono sempre attivi, ma che rappresentano per il virus un reservoir, non viene replicato il virus.

Le fasi di infezione che definiscono la patogenesi sono:

1. Infezione acuta

2. Latenza clinica

3. AIDS

Diagnosi

Il primo test diagnostico consiste nella ricerca degli anticorpi (ELISA) nei confronti del virus HIV nel sangue. Può succede

che il soggetto riceva un esito negativo dal test, è necessario che venga rifatto il test un mese dopo. Se l’esito è ancora

negativo, si dice con certezza che il virus non è presente, viceversa il virus è presente. Evidentemente il soggetto non

aveva abbastanza anticorpi per rilevare la presenza del virus un mese prima. Ad oggi il periodo di tempo tra l’infezione e

periodo finestra.

la comparsa degli anticorpi dura circa un mese e viene chiamato Questo periodo è il periodo più

pericoloso per la diffusione del virus, perché il soggetto è HIV positivo, ma non si rilevano gli anticorpi per cui il soggetto

è siero negativo. Il passaggio da sieronegativo a sieropositivo è chiamato sieroconversione. Attualmente l’iter-

diagnostico consiste in due ELISA INDIRETTI in due giorni di fila e se entrambi sono positivi si esegue un Western Blot

per dare la conferma. Una volta che un soggetto viene diagnosticato HIV positivo e sieropositivo viene inserito in un iter

di monitoraggio. Vengono ricercati due marker diagnostici:

Carica virale: quantità di virus che si sta replicando nel sangue (nei linfociti). Si fa la conta dei linfociti T CD4. Durante la

fase di infezione acuta diminuisce la conta dei CD4 perché i linfociti infetti muoiono, ma aumenta la carica virale perché il

virus si sta replicando in modo massiccio nel sangue. Nella fase di infezione asintomatica il numero delle cellule CD4

torna a livelli normali e la carica diminuisce perché il sistema immunitario sta cercando di eliminare il virus, inoltre c’è la

somministrazione della terapia farmacologica HAART (terapi