Virologia medica

Virologia e batteriologia

Due compitini in itinere: virologia e batteriologia. Sono 8 domande aperte. Se si fanno entrambi e si accettano i voti, non si fa l’esame orale. Ci sarà una domanda sul laboratorio nella parte dei batteri. http://www.virology.ws

Struttura, genetica ed evoluzione dei virus

Definizione: agente infettivo di piccole dimensioni e di semplice composizione che è in grado di replicarsi all’interno di cellule viventi che siano cellule animali, vegetali o batteri (batteriofagi). È un microrganismo, ovvero organismo di piccolissime dimensioni. È composto solo da due parti fondamentali. Il virus non è autonomo nella sua replicazione. La parola virus deriva dal latino e significa veleno. David Baltimore dice che un virus è un pezzo di cattive notizie (materiale genetico che porta informazione) all’interno di un rivestimento proteico.

I virus sono ovunque, infettano tutto ciò che è di vivente, infettano le cellule. Noi portiamo dentro una quantità di virus enorme senza che ce ne accorgiamo. Ci sono circa 10 HIV sulla terra.

Da dove arrivano?

Esiste una branchia della virologia che si occupa dell’evoluzione dei virus. Esistono tre teorie:

• Teoria regressiva: i virus derivano da grandi parassiti intracellulari che, per motivi evolutivi, hanno perso tutto il materiale inutile, mantenendo solo l’essenziale.
• Il virus deriva da una cellula eucariotica: tramite un’evoluzione riduttiva si è trasformata in virus.
• Teoria dell’entità indipendente: i virus si sono evoluti in modo indipendente (ipotesi più accreditata). Questa teoria definisce alcuni concetti come quello dell’origine della vita tramite autocatalisi (RNA è la molecola che ha capacità di autocatalisi). I virus nascono insieme all’RNA. I virus evolvono continuamente.

Scoperta dei virus: il primo virus scoperto è quello della febbre gialla nel 1901.

I virus sono esseri viventi? I virus devono entrare in una cellula vivente per potersi replicare, ma sono microrganismi. C’è un dibattito che riguarda se i virus siano o meno cellule viventi. I virus non crescono. Hanno un’organizzazione troppo semplice per essere viventi. Dall’altra parte però possono moltiplicarsi e si sanno evolvere e in qualche modo sono in grado di rispondere a stimoli ambientali. Il virus è un agente passivo che ha come unico obiettivo replicarsi. Il virus non pensa, quello che succede è l’effetto di tanti fattori che sono esterni al virus. Il virus esiste in due forme: il virione o particella virale che non è esistente in natura, non è un organismo vivente, e la cellula infettata. In questo caso il virus acquisisce alcune proprietà degli esseri viventi.

Dimensioni e componenti dei virus

Quanto sono grandi? Un virus ha un diametro sempre inferiore al micron (si osserva in microscopia elettronica). È circa un decimo di un batterio. Il più piccolo virus conosciuto è 25 nm di diametro e il più grande 100 nm.

Il virus ha solo due componenti:

• Genoma: (acido nucleico DNA o RNA)
• Capside: (proteine)

Genoma e capside insieme prendono il nome di nucleo-capside. Alcuni virus possiedono un terzo componente che si chiama envelope (è l’equivalente della membrana cellulare) formato da un doppio strato fosfolipidico. Virus che non hanno l’envelope sono chiamati nudi.

Envelope

È costituito da un doppio strato fosfolipidico ed è la parte più esterna del virus, quindi contiene quelle strutture necessarie per il riconoscimento della cellula da infettare. Sull’envelope sono presenti siti di legame (binding sites). L’envelope deriva dalla cellula ospite, è una parte di membrana cellulare che rimane sul virus nel momento in cui questo esce dalla cellula. Sull’envelope sono presenti dei recettori, glicoproteine e altre proteine specifiche del virus che servono per riconoscere le cellule. C’è una specie-specificità: se il virus prende l’envelope dalla membrana cellulare, lo prenderà sempre e solo da lei. In generale può prendere dalla membrana cellulare, nucleare o degli organelli. I virus che hanno l’envelope entrano nella cellula attraverso una fusione delle membrane: il virus si avvicina alla cellula e unisce la propria membrana a quella della cellula. Il processo di fusione avviene grazie alle glicoproteine che stanno sull’envelope che hanno attività fusogena. Il processo di uscita del virus dalla cellula per esocitosi (si chiama budding o gemmazione). Le glicoproteine sono gli antigeni del virus nei confronti dei quali il nostro corpo produce anticorpi, sono riconosciute dagli anticorpi del nostro organismo.

Virus nudi

La parte più esterna è il capside che avrà i recettori per il riconoscimento della cellula. Questi recettori saranno anche antigeni che vengono riconosciuti dal sistema immunitario. Il capside è costituito solo da proteine molto piccole che si ripetono tante volte per formare il capsomeri. Queste piccole unità ripetute sono chiamate capsomeri che si dispongono nello spazio intorno al genoma sempre allo stesso modo, si distribuiscono intorno ad assi di simmetria in modo da formare una struttura icosaedrica intorno al genoma oppure elicoidale. I geni del virus devono essere corti e codificare per proteine da 20-30 aa, per questo non si utilizza una grande proteina che avvolga il genoma, ma è preferito il sistema dei capsomeri (economia genomica). Il sistema a capsomeri è vantaggioso oltre per l’economia genomica, per ottimizzare la protezione e per favorire a livello energetico l’assemblaggio del capside: massima stabilità al virus con minimo dispendio energetico. Dentro al capside c’è il genoma del virus. Ciascuna famiglia del virus è caratterizzata da un genoma differente: RNA o DNA. Il genoma può essere single o duoble strand. RNA può essere antisenso (complementare all’mRNA, non può legare i ribosomi, lo chiamo negativo) o senso (mRNA quindi lo chiamo positivo). I genomi possono essere lineari o circolari. Un genoma può essere composto da una molecola o da più molecole. Il capside può essere da 25 a 100 nm, a livello genomico il range è 3000-20000 bp. L’HIV ha un genoma di 6000 bp. Il 30% dei virus umani ha un genoma a DNA, di cui la maggior parte è a doppio filamento, fa eccezione la famiglia dei parvovirus che hanno genoma a singolo filamento. Tutti i virus a DNA hanno solo una molecola di DNA, tranne il virus dell’epatite B che ha un genoma a DNA che ha un genoma a DNA a doppio filamento circolare incompleto. Il 70% ha genoma a RNA che è sempre lineare, è sempre single strand tranne il genoma dei reovirus. Il genoma a RNA può essere composto da un’unica molecola o essere segmentato ad esempio il virus dell’influenza presenta 8 segmenti di RNA a singolo filamento. Virus dell’epatite C: molecola unica, a RNA singolo filamento positivo, il virus dell’ebola è negativo.

Mutazioni ed evoluzione

I virus che hanno RNA ha polarità negativa portano sempre con sé una polimerasi. Esiste un comitato (ICTV) per dare i nomi ai virus e come classificarli. Tutti i virus sono classificati secondo un ordine gerarchico, secondo una tassonomia. All’interno dell’ordine c’è una sottoclassificazione che è la famiglia sottofamiglia. Genere famiglia, all’interno della c’è una sottoclassificazione che è la. Poi si ha il e la specie. Evoluzione: i virus evolvono in seguito alle mutazioni che si inseriscono durante la replicazione grazie alle polimerasi. I virus a RNA mutano molto più facilmente dei virus a DNA. Quelli a DNA presentano molto meno sottospecie perché mutano più raramente. Ad ogni modo non muta l’envelope, non possono cambiare la simmetria del capside. Mutano solo pochi aminoacidi, non è mutare completamente la struttura del virus. L’obiettivo del virus non è quello di distruggere l’ospite, ma di replicarsi, quindi deve mantenere una certa costanza nel recettore e nel modello replicativo.

Rapporto virus-cellula

Come il virus si rapporta alla cellula che infetta? In natura ci sono moltissimi virus che infettano una cellula contemporaneamente. Il tipo di acido nucleico presente nel virione determina il modello replicativo che il virus segue. Ci sono però principi unificanti:

• Lo scopo di tutti i virus è quello di entrare nella cellula e moltiplicarsi creando tante copie identiche tra loro. Quindi lo scopo del virus è impacchettare il genoma all’interno della cellula e poi uscire dalla cellula.
• Il virus deve poi uscire dalla cellula per diffondersi di cellula in cellula e continuare il suo modello replicativo.
• Il genoma del virus, nonostante sia molto piccolo, contiene le informazioni necessarie all’inizio della replicazione. Il virus si appoggia poi alla struttura della cellula ospite, utilizzando i ribosomi/polimerasi/nucleotidi/enzimi cellulari.

Non è semplice per il virus completare il proprio ciclo replicativo: deve entrare nella cellula, replicarsi, uscire dalla cellula e sfuggire alla difesa dell’ospite. Tutti i virus in generale compiono il ciclo replicativo virale o ciclo vitale di un virus. Nonostante le differenze che ciascun virus ha nel ciclo replicativo, questo processo si riassume in:

1. Trovare una cellula ospite (host cell).
2. Legarsi alla cellula (riconoscerla e legarsi).
3. Entrare nella cellula.
4. Liberare le proprie informazioni genetiche nella cellula. Il rivestimento proteico non serve più una volta entrato nella cellula perché deve liberare il genoma all’interno, quindi il virus si sveste.
5. Replicare il proprio genoma.
6. Trascrivere e tradurre le proteine del capside, le polimerasi e le glicoproteine dell’envelope (trascrivere tutte le sue proteine).
7. Impacchettare il genoma creando nuove particelle virali.
8. Uscire dalla cellula.

Quindi se un virus entra nella cellula, ne escono milioni. In realtà tutti questi step sono anche sovrapposti tra di loro perché mentre un virus si attacca alla cellula, ce ne sono altri che stanno già replicando.

Definizioni

• Cellule suscettibili: le cellule suscettibili all’infezione di un virus sono cellule che permettono al virus di entrare nella cellula. Hanno recettori che vengono riconosciuti dal virus.
• Cellule permissive: permettono al virus di replicarsi al proprio interno.
• Cellule resistenti: sono cellule in cui il virus non può entrare perché sono prive di recettori specifici per il virus. Possono però essere permissive: può non avere recettori per l’ingresso, ma se li inietto questi possono replicarsi all’interno (in laboratorio).
• Cellule suscettibili e permissive: permettono sia l’ingresso che la replicazione del virus.

I virus a RNA compiono il loro ciclo replicativo all’interno del citoplasma, non entrano nel nucleo. I virus a DNA invece devono entrare anche nel nucleo.

Step della replicazione

1. Riconoscimento della cellula ospite suscettibile: il riconoscimento avviene ad opera del recettore virale nei confronti del recettore cellulare. I recettori sono molecole di natura proteica o eventualmente glicoproteica. Per quanto riguarda la parte virale i recettori dei virus nudi sono i capsomeri o una parte del capsomero, se il virus possiede l’envelope i recettori sono le glicoproteine presenti sull’envelope. Per quanto riguarda la cellula, il virus riconosce svariate proteine di membrana (immunoglobuline-like, recettori di membrana, canali e trasportatori transmembrana). Sono proteine che nella nostra fisiologia hanno una propria funzione, sono molecole preesistenti e che hanno altri ruoli sulla nostra cellula (proteine canale, recettore, trasportatore). Il legame tra il recettore cellulare e quello virale avviene in modo altamente specifico e determina il tropismo virale, ossia la capacità di legare solo a un particolare citotipo di un tessuto/organo. L’HIV ha un tropismo nei linfociti, il virus della rabbia ha un neurotropismo. Un recettore virale lega un recettore cellulare, ma ci sono virus più esigenti per i quali non è sufficiente un solo recettore; necessita quindi di co-recettori (esempio: HIV). Il che significa che un virus si lega mediante il suo recettore virale a quello cellulare, ma non è sufficiente perché si deve legare anche ad un altro recettore che prende il nome di co-recettore e questo determina ancora una volta il trofismo cellulare.
2. Ingresso nella cellula ospite: l’ingresso può avvenire con modalità differenti a seconda della presenza/assenza dell’envelope. Se il virus è nudo, in seguito al legame recettore-recettore si avrà quella che viene chiamata viropessi o endocitosi mediata da recettore: si crea una vescicola endocitotica di membrana che trasporterà moti virioni all’interno della cellula. Se il virus possiede l’envelope invece entra nella cellula tramite un processo di fusione (l’envelope si fonde con la membrana cellulare) delle membrane grazie alla presenza di glicoproteine virali che possiedono un dominio fusogeno. Questo processo può avvenire direttamente a livello della membrana cellulare oppure in un secondo momento, a seguito di un ingresso tramite endocitosi.
3. Perdita del capside: (step di svestimento-uncoating) il nucleocapside si disgrega perché probabilmente nel citoplasma trova un nuovo equilibrio energetico, in questo modo il genoma è liberato. Per i virus a DNA il genoma viene trasportato da proteine chaperone all’interno del nucleo.
4. Replicazione del genoma, trascrizione e traduzione dei geni: sono gli step cruciali per la replicazione del virus. (Questi passaggi sono affrontati in seguito)
5. Impacchettamento: attorno a ciascun singolo genoma si verrà a formare il capside. Questo impacchettamento avviene nel nucleo se abbiamo a che fare con virus a DNA, mentre avverrà nel citoplasma se parliamo di virus a RNA.
6. Maturazione: step di maturazione delle proteine che attraverso il Golgi vengono modificate e maturano. Le proteine maturano e diventano glicoproteine.
7. Uscita dalla cellula: esistono diverse modalità di uscita dalla cellula. I virus nudi, già completi con il loro genoma e il capside, escono dalla cellula tramite metodo litico, tramite lisi cellulare. Questo significa che i virioni maturi distruggono la cellula (caso dei virus a DNA che si accumulano nel nucleo) perché hanno accumulato già abbastanza virioni. La cellula si distrugge, esplode. Si può riassumere che i virus privi di envelope entrino per endocitosi nella cellula ed escano per lisi cellulare, anche se possono anche uscire mediante un processo di esocitosi. I virus che possiedono l’envelope escono diversamente in quanto devono acquisire l’envelope e le glicoproteine dell’envelope. Durante il processo di traduzione delle proteine, le glicoproteine virali dell’envelope tradotte dalla cellula vengono trasportate sulla membrana cellulare. Il virus che ha incapsidato il proprio genoma esce per gemmazione portandosi via una parte di membrana cellulare e le glicoproteine. La cellula diventa un po’ ibrida perché presenta anche delle particelle virali sulla sua membrana. Ci sono virus che acquisiscono l’envelope da membrane intracellulari, non necessitano quindi di uscire per budding ma escono tramite lisi cellulare.

Replicazione del genoma, trascrizione e traduzione dei geni virali

In base alla natura dell’acido nucleico, ciascun virus ha un metodo di replicazione differente. Baltimore nel 1971 divide i virus in sette classi di replicazione; ciò che sta al centro di tutte le classi replicative è l’mRNA o RNA positivo o ssRNA+ da cui derivano tutte le proteine. Baltimore identifica gli step necessari al virus per produrre un mRNA partendo dal proprio acido nucleico.

1. dsDNA: il DNA è rilasciato nel nucleo. I virus hanno quindi un genoma strutturato come quello della cellula ospite: questo permette di usare strategie replicative simili. Il DNA virale è diviso in regioni codificanti precocissime, regioni precoci e regioni tardive che vengono trascritte in tempi differenti. Viene trascritto prima l’mRNA immediate early delle regioni precocissime e viene tradotto immediatamente in proteine. Queste proteine sono regolatorie, ritornano nel nucleo e stimolano la trascrizione dei geni precoci, tradotti in geni early. All’interno delle proteine precoci non ci sono solo proteine regolatorie che stimolano la trascrizione dei geni tardivi, ma anche proteine funzionali (polimerasi) che stimolano la replicazione del DNA. Le proteine tardive sono le proteine strutturali del virus, ritornano nel nucleo e impacchettano i genomi. Alcuni virus a dsDNA hanno solo proteine precoci e tardive (virus con DNA corto); alcuni virus a dsDNA non sono in grado di codificare per una propria polimerasi e quindi per replicare il proprio genoma sfruttano le polimerasi cellulari.
2. ssDNA: sono i parvovirus. Appena entrati nel nucleo sfruttano una polimerasi cellulare e diventano a doppio filamento. Il processo è identico alla replicazione dei virus della I classe di Baltimore. Sono virus che codificano per due proteine, una tardiva e una precoce.
3. dsRNA
4. ssRNA (+): sono virus che hanno già un RNA codificante. Questo RNA positivo appena entra nella cellula (rimane nel citoplasma) si associa ai ribosomi cellulari e traduce immediatamente tutto il suo genoma. Crea un’unica grande poliproteina che viene poi tagliata in tutte le proteine virali in un processo detto clivaggio. A un’estremità ha un dominio autocatalitico che le consente di tagliarsi; il primo taglio crea una proteasi che taglia la poliproteina stessa, aiutata da proteasi cellulari. La replicazione del genoma avviene grazie a una RNApol virale (presente tra le proteine virali tagliate dalla poliproteina) che a partire dall’RNA+ crea il complementare negativo, detto intermedio replicativo. All’intermedio replicativo si lega una polimerasi che trascriverà tan