Vettori Virali

VETTORI VIRALI Prof. D’Onofrio

Indice

INTRODUZIONE AI VETTORI VIRALI ................................................................................................................................. 2

I RETROVIRUS ................................................................................................................................................................... 3

STRUTTURA ....................................................................................................................................................................... 3

GENOMA ........................................................................................................................................................................... 4

5’ CIS-ACTING REGIONS........................................................................................................................................ 5

3’ CIS-ACTING REGIONS........................................................................................................................................ 5

REGIONE CODIFICANTE ........................................................................................................................................ 5

IL CICLO REPLICATIVO ....................................................................................................................................................... 6

FASE DI RICONOSCIMENTO E FUSIONE ............................................................................................................................. 6

LA RETROTRASCRIZIONE DEL CORE STRUTTURALE ........................................................................................................... 6

INTEGRAZIONE .................................................................................................................................................................. 8

PROTEINE REGOLATORIE...................................................................................................................................... 9

MECCANISMO DI TRANSATTIVAZIONE DI TAT ..................................................................................................... 9

REV ..................................................................................................................................................................... 10

PROTEINE ACCESSORIE ....................................................................................................................................... 11

COSTRUZIONE DI VETTORI LENTIVIRALI ........................................................................................................................ 12

VETTORI DI PRIMA GENERAZIONE .................................................................................................................................. 12

VETTORI DI NUOVA GENERAZIONE ................................................................................................................................. 13

Seconda generazione .............................................................................................................................................. 13

Terza generazione ................................................................................................................................................... 14

TRANSFERT VECTOR ................................................................................................................................................ 14

LoxP ......................................................................................................................................................................... 15

PROMOTORI INDUCIBILI ......................................................................................................................................... 15

INTRODUZIONE AI VETTORI VIRALI

Esistono numerosi tipologie di vettori virali, tuttavia i più importanti sono 3:

- i vettori LENTIVIRALI

- i vettori ADENOVIRALI

- i vettori basati su VIRUS ADENO-ASSOCIATI (AAV)

Dei tre però quelli che hanno in assoluto la storia più lunga come vettori virali sono i lentivirus (-> RETROVIRUS).

I virus, nonostante posseggono tutte le molecole che appartengono alla vita, non hanno una replicazione autonoma

(mancanza di un apparato proto-sintetico). Per questo necessitano di una cellula ospite.

Dal punto di vista strutturale, i virus posseggono:

 

Acido nucleico a DNA o RNA, a singolo o doppio filamento con polarità positiva o negativa.

 

Struttura capsidica avvolge il genoma virale. Può essere fornito o meno del core.

 

Envelope struttura lipidica di membrana che viene acquisita dal virus nel momento in cui esce dalla cellula

ospite (viene costituito da parte delle vescicole del Golgi e dalle membrane di superficie; ciò produce la

distruzione della cellula). Oltre che alle proteine di membrana presenti nella cellula ospite, qui sono presenti

anche glicoproteine di origine virale, codificate dalla cellula ospite e “raccolte” nel momento della formazione

dell’envelope. Le glicoproteine sono proteine con affinità post traduzionale di zuccheri più o meno complessi.

I virus possono essere classificati in base alle caratteristiche morfologiche: dimensioni (ordine di nm), struttura

(icosaedrico, filamentosa), presenza di envelope, tipologia di acido nucleico (DNA, RNA).

Informazioni più specifiche sulla tipologia di virus ci sono fornite principalmente dalle caratteristiche del genoma in

termini di sequenza nucleotidica. È infatti possibile creare all’interno dello stesso genere dei sottogruppi in funzione

di mutazioni o acquisizioni di nuovi nucleotidi.

Nella classificazione, in generale abbiamo:

- Ordine

- Famiglia

- Sub-famiglia

- Genere

- Specie

Per definire le caratteristiche morfologiche del virus è possibile usare la microscopia elettronica, la quale ci permette

di osservare il virus in maniera dettagliata. Per scoprire però altre caratteristiche importanti (che non sono rilevabili al

microscopio) è possibile trattare il virus (ottenuto dal pellet dopo centrifugazione delle cellule infettate):

 con solventi organici che distruggono eventualmente l’envelope

Se presente, una volta trattati i virus perdono la capacità infettiva, al contrario ossia se privi di envelope, restano in grado

di infettare le cellule ospiti.

 Trattiamo il genoma isolato da virus con DNAasi e/o RNAasi. Ciò permette la comprensione della tipologia di

acido nucleico (non si vengono a formare, una volta infettate le cellule, nuove entità virali).

Ovviamente i diversi tipi di virus hanno differenti strategie replicative, in base alla tipologia del loro genoma:

 dsDNA (es. Poxvirus, Adenovirus, Herpesvirus) può essere lineare o circolare. Può essere direttamente

replicato dall’apparato cellulare, ed in particolare il pool nucleotidico all’interno del nucleo cellulare ad opera

della propria polimerasi. Il DNA così replicato può essere anche trascritto per formare un mRNA che verrà

tradotto nelle proteine che si assembleranno con i nuovi genomi e formare nuove particelle virali.

 

ssDNA Da solo non può fare molto perché, come sappiamo, il DNA per poter essere trascritto necessita di

essere a doppio filamento (il filamento negativo fa da stampo per la sintesi del filamento positivo). Di

conseguenza se il genoma è un ssDNA positivo, non può fare da stampo per cui deve generare un filamento

negativo (così come se è un ssDNA negativo deve far da stampo per il filamento positivo). Una volta formato il

genoma a doppio filamento si possono generare i nuovi genomi a singolo filamento che si aggregheranno a

formare le nuove entità virali. - +

RNA 

Esistono anche virus, sia a ds che a ss, che usano un intermedio a RNA. Da questo, ssDNA ssDNA

-

viene generato un nuovo filamento singolo a DNA (generalmente è tipico di virus a

ssDNA). Questo dipende soprattutto dal patrimonio enzimatico che ha a disposizione il virus (DNA polimerasi-

RNA dipendente o delle RNA polimerasi-DNA dipendente).

 

dsRNA in questo caso entrambi i filamenti possono essere usati come stampo. Ovviamente il filamento

positivo può essere direttamente tradotto in proteine virali che si uniranno nelle nuove entità virali.

 

ssRNA Anche in questo caso, il filamento può essere positivo o negativo. I filamenti positivi possono

codificare non solo le proteine ma anche generare i filamenti - +

RNA 

ssRNA proteine + nuovi genomi ssRNA

negativi che faranno da stampo per i nuovi genomi positivi.

Ovviamente lo stesso discorso vale per i genomi a ssRNA negativi.

Questi genomi possono essere interi o frammentati (es. virus influenzale).

I RETROVIRUS

Prima dell’HIV, dei retrovirus si conosceva molto poco. Dal 1981 in poi sono stati investiti miliardi nello studio di questo

virus tant’è che i retrovirus, non a caso, sono stati i primi ad essere sfruttati proprio come vettori.

Tutti i mammiferi hanno dei retrovirus. Alcuni possono essere esogeni (e dunque con caratteristiche infettive che

possono essere trasmessi) ed altri invece che sono endogeni (sono stati integrati in un certo momento della vita

evolutiva di una specie all’interno del genoma). Questi ultimi dunque possono essere trascritti in particelle ma non

sono comunque in grado di infettare le altre cellule.

Queste sequenze retrovirali endogene hanno contribuito alla filogenesi di molte specie.

Dal punto di vista tassonomico, anche i retrovirus vengono classificati in funzione delle loro caratteristiche

morfologiche (rilevate attraverso microscopia elettronica):

 

TIPO A non sono infettivi, sono privi di envelope. Appartengono ai cosiddetti retrovirus endogeni.

 

TIPO B Sono quelli provvisti di envelope, hanno particelle extracellulari condensate. Hanno capacità

infettive (es. MMTV – Mouse Mammary Tumor Virus).

 

TIPO C Simili al tipo B. Sono la maggior parte dei lentivirus (es. HIV, MCV, ALV, HTLV).

 

TIPO D non sono molto importanti.

Per quanto riguarda invece la classificazione generale, non solo basata sulla morfologia, abbiamo diversi generi:

 ALV

α -RETROVIRUS (Avian sarcoma Leukosis Virus)

 MMTV

β -RETROVIRUS (Mouse Mammary Tumor Virus)

 MLV

γ -RETROVIRUS (Murine Leukemia Virus)

 BLV

δ -RETROVIRUS (Bovine Leukemia Virus), HTLV (Human T-Lymphotropic Virus)

 

LENTIVIRUS HIV, sono presenti dei sub-generi.

STRUTTURA

Tutti i vettori lentivirali hanno quasi tutti le stesse caratteristiche. Il più famoso ed utilizzato è quello derivato dall’HIV.



- MATRICE caratterizzata dalle proteine di matrice che viene codificate dal gene gag. È quella immediatamente

sotto l’envelope.



- CAPSIDE Anche la proteina del capside è codificata dal gene gag. È la proteina più abbondante nel virus.



- CORE È formata sempre dalla proteina del capside (nucleocapside) con la funzione di proteggere il genoma virale.



- PROTEASI Grazie all’attività di questo enzima possiamo diversificare le varie proteine codificate dal virus.



- TRASCRITTASI INVERSA Forma un dsDNA nel genoma della cellula ospite.



- GLICOPROTEINA DI SUERFICIE Estremamente importante perché serve per interagire con la superficie dell’ospite

(permette l’infettività). 

- PROTEINE TRANSMEMBRANA interagisce con le glicoproteine di superficie.

Tutte queste proteine possono essere definite strutturali perché

sono presenti in tutti i virus.



HIV esempio peculiare.

All’interno troviamo due copie del genoma ad RNA positivo, a

queste sono già associate altrettante trascrittasi inverse. In

questo modo il genoma può essere direttamente retrotrascritto

ed anche tradotto immediatamente dopo l’infezione. Infatti, sono

presenti anche dei pool di nucleotidi e tRNA (i quali faranno da

primer). Ovviamente, questi permettono l’innesco della

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trascrizione mentre successivamente sono utilizzati quelli della cellula ospite.

I due genomi sono salvaguardati da un involucro costituito da proteine capsulari p24 e dalle proteine di matrice

p17 che avvolge il core (sono le più abbondanti).

HIV possiede anche un envelope dove sono presenti proteine di superficie in parte di origine cellulare ed altre

di origine virale. In quest’ultimo caso di grande importanza sono le gp41 e la gp120. Queste sono associate

l’una all’altra tramite ponti –S.

Queste proteine possono essere rilevate in SdS page in presenza di β-MERCAPTOETANOLO (il qual denatura e

rompe i ponti -S). Se invece facciamo un gel non riducente, le due glicoproteine rimangono associate e shiftano

verso l’alto come un'unica protein