Vettori Virali

VPR VPU

tale in quanto presenta un segnale di splicing. C’è però

una regione che viene trascritta ma non tradotta (UTR

al 5’). Dopo l’evento di splicing (che avviene nel nucleo)

con l’eliminazione degli introni si viene a formare l’ORF

(Open Reading Frame).

La polimerasi si attacca sul promotore a livello della

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sequenza TATA BOX che si trova a circa -25,-40 nt dal

sito di inizio. Ovviamente il numero di volte in cui la polimerasi deve agire saranno determinati da fattori di

trascrizione che si legheranno successivamente e che possono essere ubiquitari o tessuto-specifici.

Quando inizia la trascrizione quindi, a livello della regione R si viene a formare una forcina che

prende il nome di TAR. TAR, ha la capacità di legare TAT, una proteina regolatoria prodotta dal

virus. Questa struttura si forma in maniera spontanea poiché in seguito alla trascrizione si hanno

delle sequenze di omologia molto elevate che portano all’accoppiamento (dove non c’è si forma

il BULGE).

È proprio questa struttura che viene riconosciuta dalla TAT.

5 Mitogeno: fattore di crescita, segnale extracellulare capace di indurre la duplicazione e la proliferazione.

6 Non tutti i geni hanno TATA BOX, in questo caso viene riconosciuta un'altra sequenza. 8

PROTEINE REGOLATORIE

Tra le proteine prodotte ce ne sono 2 importanti: TAT (Trans Activator of HIV promoter) e REV (Nuclear export of late,

unspliced RNA to the cytoplasm).

Come detto TAT è importante per la trascrizione, mentre REV è quella proteina che permette, quando si raggiunge

una certa concentrazione, di trasportare molto velocemente sia gli unspliced sia i single RNA dal nucleo al citoplasma,

permettendo così la formazione di proteine strutturali.

 TAT

Si produce per splicing alternativo dell’RNA, in modo particolare dai geni che producono VPR, VPU e REV.

Questo però non è importante solo per il virus ma anche per il genoma della cellula ospite, infatti ha proprietà

trans-attrattive con conseguenze oncogeniche. Ha una lunghezza di circa 101 aa.

TAT può essere suddiviso in due esoni: il primo da 1-72 aa ed il secondo da 72-101 aa.

Dal punto di vista proteico, è costituito da:

o porzione acida

o porzione ricca di cisteine

o core 

o RNA Binding Domain lega la TAR



o Regione basica contiene il segnale di

localizzazione nucleare. È importante per far sì

che TAT, una volta sintetizzato vada nel nucleo.

TAT però non interagisce solo con TAR ma anche con i fattori trascrizionali della cellula ospite come per

esempio Questi fattori di trascrizione si legano alla polimerasi II.

TFIID, TFIIB, TFIIM, pTEFb.

MECCANISMO DI TRANSATTIVAZIONE DI TAT

Come detto, TAT viene prodotta per splicing alternativo (overlappa REV in termini di sequenza codificante,

impedendone la trascrizione).

TAT è in grado di legare la sequenza TAR che si forma grazie ad una sequenza secondaria dell’RNA. Oltre a questo

esiste anche un’azione transattivatoria di alcuni geni della cellula ospite (protoncogene), tra queste proprietà infatti

c’è la sua capacità di interagire con le proteine checkpoint nella replicazione cellulare (ne aumenta la loro affinità).

Si è visto infatti che se prendiamo delle cellule in cui costruiamo una cassetta di espressione (plasmide) con un

promotore forte (di tipo ubiquitario), ORF di TAT ed un segnale di poli-A e poi confrontiamo tali cellule transfettate

con altre cellule, che però non sono transfettate oppure lo sono state ma con un plasmide contenente una cassetta di

espressione diversa da TAT, facendo un analisi dei geni che vengono attivati vediamo che alcuni di questi sono molto

più trascritti rispetto ad altri. Appare quindi evidente l’effetto trascrizionale di TAT.

Questo però è valido non solo nella fase di iniziazione, ma anche durante le fasi di elongazione e clearance.

Per esempio si è anche visto che TAT può interagire con il

complesso CDK9-T1.

In assenza di TAT, la trascrizione del genoma avviene lo stesso ma

in maniera meno efficace.

Tra i geni che vengono transattivati da parte di TAT troviamo molti

geni legati ad una serie di citochine:

- TGF β (Fattore di crescita trasformante β)

- TNF

- IL-2 e IL-6. 9

Tuttavia, l’attività transattivatoria di TAT permette anche di ridurre l’attività di alcuni geni, come per esempio il

promotore di MHC di classe 1 il quale viene represso (Down regulation). Pertanto a livello dei macrofagi (che

presentano sia MHC di classe I che MHC di classe II), si impedisce l’esposizione degli antigeni essendo i macrofagi le

cellule bersaglio di HIV. Da qui quindi deriva la sindrome di immunodeficienza (deplezione di CD4+).

L’attività di TAT, inoltre può essere misurata a livello trascrizionale.

È necessario overesprimere TAT nelle cellule (non è possibile infettare le cellule poiché altrimenti non

capiremmo chi ha generato gli effetti); il virus infatti produrrebbe anche altri elementi: quindi TAT viene isolato

e fatto esprimere nelle cellule.

Dato che sappiamo che come target TAT ha le LTR del virus legando TAR e funziona anche a livello di U3 (il

promotore virale), è possibile realizzare 2 costrutti:

o Uno ci permette di overesprimere TAT nel momento in cui lo transfettiamo all’interno delle cellule (ad

esempio usiamo il promotore di CMV) seguito dall’ORF di TAT.

o Uno che ci permette di leggere l’attività di TAT (ad esempio si usa il promotore di MHC-I)

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Inseriamo il secondo plasmide all’interno delle colture cellulari valutando in questo modo la sua attività .

In seguito co-transfettiamo altre cellule con il plasmide che contiene TAT ed il plasmide che contiene CUC e misuriamo

nuovamente con l’illuminometro. Troveremo che il quantitativo di fotoni è 100 volte più elevato (ciò dimostra che TAT

ha interagito con il promotore).

REV

REV è una proteina precoce molto importante. Infatti se è possibile eliminare TAT da i nostri vettori, REV è

indispensabile. Questo perché trasporta gli RNA unspliced e single spliced molto velocemente dal nucleo al citoplasma;

pertanto, senza di esso non avremo nuovi genomi e non avremo neanche l’espressione delle proteine tardive.

Per poter funzionare deve legare una sequenza detta RRE (Rev Response Elements) all’interno del genoma ad RNA.

Possiamo quindi testare l’attività di REV facendo un costrutto che produce REV ed una volta transfettate le

cellule, si mette la RRE all’interno degli RNA e si misura quanto velocemente questi vengono trasportati dal

nucleo al citoplasma (ovviamente quelli trasportati più velocemente saranno anche tradotti più velocemente).

Oltre alla sequenza che riconosce RRE, all’interno di REV è presente una sequenza di localizzazione citoplasmatica ed

una sequenza di localizzazione nucleare (perché dopo essere stato tradotto nel citoplasma questo, a causa della sua

funzione, dovrà continuamente spostarsi all’interno di tali compartimenti cellulari).

La struttura di RRE è molto complessa, è caratterizzata dalla presenza di numerose forcine ognuna delle quali è stata

attentamente studiata. Ad una estremità, REV lega dunque l’RNA (tramite

la sequenza RRE) mentre all’altra estremità lega un

complesso multiproteico fatto da CRM1-RAN che fa

da shuttle e dunque che ha la capacità di trasporto

attraverso i pori nucleari.

All’interno del citoplasma poi, per qualche motivo

non chiaro, questo complesso viene destabilizzato e

viene rilasciato l’RNA. Infine REV e CRM1-RAN

ritornano all’interno del nucleo dove si riassembla il

complesso.

7 Tramite l’illuminometro che misura la quantità di fotoni prodotti 10

PROTEINE ACCESSORIE

 

Nef Viene prodotto dal full-splicing RNA (cioè quando si accumulano TAT e REV), come TAT anche lui oltre a

dare una down-regulation di MHC-1, dà una regulation del CD4 impedendo così la multi-infezione.

 

Vif E’ indispensabile all’interno del vettore. Ha un’attività molto importante perché contrasta l’attività di un

fattore antivirale che è naturalmente presente nei linfociti T (APOBEC3G).

 

Vpu Coadiuva l’attività di Nef. Mentre Nef riduce o inibisce la sintesi di CD4, Vpu aumenta la degradazione di

questo elemento (non viene più riciclato).

 

Vpr Causa l’arresto del ciclo cellulare in fase G2/M perché è in fase mitotica: in questo modo mantiene la

cromatina aperta permettendo un maggior accesso dei fattori di trascrizione ai geni di interesse (aumento

trascrizionale del provirus).

 

APOBEC3G Apolipoprotein B mRNA-editing Enzyme, Catalytic polypeptide 3G

Questo enzima è in grado a livello della retrotrascrizione di indurre delle ipermutazioni: durante la sintesi del



DNA, tutte le volte che trova una G viene trasformata in A (Guanina Adenina). Pertanto, Vif ha una funzione

importante nel contrastare l’azione di questo enzima. Non si sa ancora molto bene come funziona l’attività di

APOBEC3G, tuttavia si pensa che:

o APOBEC3G subisce il packaging in maniera aspecifica. Quindi, viene introdotto all’interno del virus

durante il ciclo replicativo in maniera specifica, cioè quando si assemblano le nuove particelle virali,

APOBEC3G essendo presente nel citoplasma, rimane in parte all’interno del virus (questo però non

Ipotesi funziona perché è presente Vif).

o APOBEC3G si trova all’interno del virus perché ha un’interazione specifica con GAG, o lega un

particolare RNA presente nel virus detto 7scRNA, o può essere incapsidato perché ha un’interazione

specifica con il genoma di HIV.

Il provirus integrato all’interno del genoma viene trascritto dalla RNA polimerasi II formando il full-lend RNA che

subisce splicing con conseguente accumulo delle proteine precoci, tra cui Rev che porta (una volta entrato nel nucleo)

il genoma virale nel citoplasma dove si vengono a formare i prodotti di GAG, POL e ENV. All’inizio però si viene a

produrre anche Vif: questo si accumula nel citoplasma dove è presente anche APOBEC3G. La loro interazione porta

alla formazione di un complesso che viene trasportato nel proteosoma dove viene degradato.

Tuttavia, una piccola frazione di APOBEC3G può entrare nei nuovi virioni, la quale può generare ipermutazioni:

 Se le ipermutazioni sono utili per l’infettività si

formerà una nuova progenie virale che sarà

mantenuta

 Se le ipermutazioni sono sfavorevoli alla

replicazione virale i nuovi virioni non si formeranno.

Questa interazione però no