Tossicologia e mutagenesi ambientale - Appunti Lezione 9

Il principio del test di Ames

Ceppi Salmonella typhimurium

 Fenotipo mutato

auxotrofi per l’istidina (his )

-

Reversione

 ripristino funzione genica

Ceppo prototrofo (his+)

 Fenotipo selvatico

comparsa colonie selvatiche

Il test di Ames: cronologia

1966 (Ames e Whitefield)

 utilizzo di ceppi mutanti di Salmonella istidina-dipendenti

per lo screening dei mutageni chimici

1971-1973

 introduzione del sistema di attivazione metabolica

(omogenato di fegato di roditori)

1973

 sviluppo del plate incorporation assay in sostituzione dello

spot test

1983 (Maron e Ames)

 “linee guida” per il test di reversione con Salmonella

rrelazione mutagenesi-cancerogen

Cancerogeni

Non mutageni Mutageni

Non cancerogeni

rrelazione mutagenesi-cancerogen

 Sensibilità del test

– % cancerogeni positivi (mutageni) al test

– cancerogeni non mutageni al test (falsi negativi)

Specificità del test

 – % non cancerogeni negativi (non mutageni) al test

– non cancerogeni mutageni al test (falsi positivi)

Valore predittivo del test

 77-90%

n o. cancerogeni mutageni cancerogenesi

no. cancerogeni mutageni + no. falsi positivi nei roditori

Concordanza del test

 no. sostanze identificate correttamente

no. sostanze totali database

iglioramento della sensibilità del te

Modificare geneticamente i ceppi di

1. Salmonella per renderli più sensibili

Ampliare le classi di mutageni chimici

2. identificabili (mutageni indiretti)

Sviluppare procedure di esecuzione del

3. test rapide e riproducibili

1.Aumento sensibilità ceppi

Introduzione mutazione rfa

 – impedisce la sintesi del lipopolisaccaride

– aumenta la permeabilità ai mutageni

Delezione gene uvrB e bio

 – impedisce il funzionamento del sistema di riparazione

error free

– determina la richiesta di biotina

Introduzione plasmide pKM101

 – introduce un sistema di riparazione error prone

– comporta la resistenza all’ampicillina

notipo dei principali ceppi di Salmon

∆

Mutazione Presenza Gene e sequenza Evento

uvrB- plasmide bersaglio reversione

ceppi Bio, rfa

hisG46 fosforilasi sostituzione

di base

→

-GGG- -GAG-

→

(leu pro)

TA1535 +,+ no

TA100 +,+ pKM101

hisD3052 istidinadeidrogenasi inser/delez

-1 bp -CGCGCGCG-

TA1538 +,+ no

TA98 +,+ pKM101

TA98NR +,+ pKM101

TA981.8-DNP +,+ pKM101

6

hisC3076 transaminasi inser/delez

+1 bp -CCC-

TA1537 +,+ no

2.Sistema attivazione metabolica

Mutageni diretti Mutageni indiretti

Analoghi di base

Derivati acido nitroso Fase I (ossidativo)

Agenti alchilanti Metabolismo Fase II (coniugativo)

Sostanza elettrofila Idrocarburi policiclici

aromatici

Ammine aromatiche

Benzene

Enzimi microsomiali provenienti da

omogenato di fegato di ratto (S9)

S9-mix NADPH + G6P + tampone fosfato

Fattori critici per il test

Quantità sostanza da testare e scelta delle dosi

 – 5 mg piastra (max)

– 4-5 dosi + controllo negativo e positivo

Selezione solvente

 – proprietà della sostanza

– caratteristiche chimico-fisiche e tossicologiche

solvente (Acqua - DMSO - acetone - diclorometano)

Selezione ceppi

 – caratteristiche chimiche delle molecole in esame

– miscele complesse

aria TA98

 acqua TA100



Condizioni di coltura dei ceppi

 – fase di crescita logaritmica

3.Inoculo e crescita dei batteri

100 µl S. typhimurium 20 ml terreno liquido completo

istidina-dipendenti (contiene istidina)

1x10 batteri

8 37°C per 6-10 h

5x10 batteri/ml 1x10 batteri/ml

6 9

Controllo trasmittanza a 580 nm

TA100 28

TA1535 TA1537 TA98 30 Batteri in crescita

TA98NR 32 esponenziale

TA981.8-DNP 42

6

3.Schema sperimentale plate test

100 µl 500 µl

100 µl

S. typhimurium S9-mix

Composto

istidina-dipendenti da testare

(10 batteri)

8 o solvente

2 ml

Top agar 42-45°C

(agar+NaCl+

tracce di istidina e biotina)

Terreno minimo

(agar+glucosio+VBS) 37°C per 48 h

Colonie revertenti

istidina-indipendenti

Piastre di TA100 trattate con NaN 3

Controllo

Dose 1 Dose 2