Tossicologia e mutagenesi ambientale - Appunti Lezione 7

N -CH N

N 3 NH

NH 2

2

Riparazione indiretta

Riparazione per excisione

 – Base excision repair (BER)

– Nucleotide excision repair (NER)

Riparazione post-replicativa

 – Translesion synthesis

Riparazione di tipo ricombinativo

 – Riparazione dei legami crociati

– Riparazione dei DSB

Generalità riparazione indiretta

Riconoscimento dell’alterazione

 Eliminazione di una sequenza più o meno

 estesa a monte e a valle del sito alterato

Nuova sintesi della sequenza rimossa e

 saldatura dei frammenti (excisione)

Scambio di sequenze di DNA e saldatura dei

 frammenti (ricombinazione)

BER

Rimuove basi alterate da lesioni non voluminose

 – Modificazioni spontanee ~10 siti AP/cellula/g

4

– Lesioni ossidative (ROS) ~10 siti ossidati /cellula/g

4

– Prodotti di alchilazione

Enzimi specifici (11 DNA glicosilasi) riconoscono la base

 alterata e creano siti abasici

– Citosina deaminata: uracil DNA glicosilasi (UNG)

– 8-idrossi guanosina: 8-oxoG glicosilasi (OGG1)

DNA polimerasi (β) e ligasi ripristinano l’integrità dell’elica

 – La sequenza rimossa varia da 1 a 10 nucleotidi

BER e mutazioni

β:

Fedeltà replicativa DNA pol 1/10

 4

– No correzione di bozze

Mutazione predominante: inserzione 1 bp

 – Allineamento non corretto stampo-elica nuova

– DNA pol inserisce una base complementare ad un

nucleotide adiacente

Sovraespressione della DNA pol (β) incrementa di 2-4 il

 tasso di mutazione

– Forme mutate/alterate nel 30% dei tumori

– DNA pol (β) induce tumori in topi immunodeficienti

NER

Rimuove lesioni voluminose al DNA e dimeri di pirimidina

 – Transcription coupled repair (TCR)

– Overall genome repair (OGR)

Sono coinvolti > 30 enzimi

 – Fase di riconoscimento

– Srotolamento doppia elica

– Rimozione (12-30 nucleotidi) - Sintesi - Ligazione

Mutazioni nei geni del NER causano malattie genetiche

 – Xeroderma Pigmentosum (XP)

– Sindrome di Cockayne (CS)

– Tricotiodistrofia (TTD)

TCR - OGR

Enzimi diversi per la fase di riconoscimento

TCR

 – Agisce a livello dell’elica trascritta dei geni

– Riparazione rapida ed efficace (error free)

OGR

 – Agisce sull’elica non trascritta e sul resto del

genoma

– Riparazione lenta e meno efficace (error prone)

Difetti genetici NER

Xeroderma pigmentosum (XP)

 – Sette gruppi di complementazione (XPA-G)

– Mutazioni in geni coinvolti in TCR e OGR

– Ipersensibilità ai mutageni, instabilità genomica e sviluppo

tumori

Sindrome di Cockaine (CS)

 – Due gruppi di complementazione (CSA-CSB)

– Mutazioni in geni coinvolti in TCR

– Ipersensibilità ai mutageni, instabilità genomica

Tricotiodistrofia (TTD)

 – Tre gruppi di complementazione (TTDA - XPB - XPD)

– Mutazioni in geni coinvolti in TCR e OGR

– Instabilità genomica

Translesion synthesis

Alcune DNA polimerasi continuano la replicazione del

DNA in presenza di una lesione nell’elica stampo

La replicazione non viene arrestata

 x

In corrispondenza del sito alterato le DNA pol

 inseriscono una base a caso nell’elica nascente

– η, κ

DNA normale DNA pol error-free

– ζ, ι

Mutazione DNA pol error-prone

DSB

La lesione del DNA più pericolosa perché difficile da

 riparare

– Può dare origine a delezioni – inversioni - traslocazioni

SSB od altre lesioni al DNA DSB dopo un ciclo

 replicativo

DSB sono l’evento che innesca i processi ricombinativi

 durante la meiosi degli eucarioti (lieviti - topo - uomo)

Vengono prodotti durante la ricombinazione somatica

 V(D)J per creare la diversità antigenica

Riparazione dei DSB

Riconoscimento danno

Mutageni fisici

(chimici) Sensori

ATM/ATR

p53 Trasduzione ed amplificazione

Effettori risposta al danno

Arresto ciclo Riparazione Apoptosi Necrosi

cellulare DNA

Riparazione dei DSB

1. Ricombinazione omologa

Tarda fase S-G

• 2

• DNA duplicato

• Cromatidi fratelli fungono da stampo

2. Ricombinazione non omologa (NHEJ)

G -inizio fase S

• 1

• DNA non è duplicato

1.HR

Ripara i DSB formati dai legami crociati

 inter-elica

Si basa sull’omologia di sequenza e

 richiede uno stampo non danneggiato

ATM - Otto geni FAN(1-8) - BRCA1-2 -

 BLM

(elicasi RecQ)?

Anemia di Fanconi

 − Instabilità genomica

− Predisposizione al cancro

Meccanismo molecolare

Introduzione DSB in un omologo

Resezione a dare estremità 3’OH

libere

Invasione dell’omologo intatto da parte

di un’elica e formazione ansa D

Nuova sintesi di DNA su stampo ansa

D ed estensione dell’ansa

Appaiamento con l’elica che non

aveva invaso

Nuova intesi e saldatura dei frammenti

→ doppia HJ

Risoluzione della struttura

2.NHEJ

Ripara i DSB formati dalla radiazione ionizzante o

 dalla duplicazione replicativa di 1 SSB

Si basa sull’omologia di struttura fra le sequenze

 scambiate e non richiede eliche non danneggiate

ATM/ATR - ku70/ku80 - DNA-PK proteina Artemis

 Mutazioni nel gene ATM Atassia

 telangiectasia