Tossicologia e mutagenesi ambientale - Appunti Lezione 12

Test della cometa

Il DNA sottoposto a campo elettroforetico alcalino (pH=12) o neutro (pH=7) migra verso l’anodo. Ciò provoca la rottura dei legami a idrogeno fra le basi. Il DNA integro migra in maniera compatta, mantenendosi nei contorni del nucleo. Il DNA rotto (frammentato) produce una coda simile a quella di una cometa.

• SSB (pH alcalino)
• DSB (pH neutro)

Si quantifica il DNA frammentato (migrato) mediante:

• Lunghezza della coda
• Percentuale di DNA presente nella coda o rimasto nel nucleo

Protocollo sperimentale

• Intrappolamento cellule gel di agarorio
• Lisi cellulare
• Denaturazione DNA
• Corsa elettroforetica
• Colorazione DNA con bromuro di etidio
• Osservazione microscopio fluorescenza

Analisi in interfase

Analizzare una popolazione cellulare in divisione indipendentemente dal suo cariotipo.

Test del micronucleo (MN) in cellule binucleate

Ritardo migratorio in anafase causato da:

• Perdita cromosomica, evento aneuploidogeno
• Rottura cromosomica, evento clastogeno

Analisi in fluorescenza: tutti i cromosomi.

Test di aneuploidia in cellule binucleate

Non disgiunzione e perdita cromosomica analizzate in fluorescenza su alcuni cromosomi.

Test del MN in cellule binucleate

Piccolo nucleo accessorio dotato di membrana propria, si divide autonomamente e origina da rottura cromosomiche o da interi cromosomi in ritardo migratorio durante l’anafase.

• Frammento cromosomico acentrico
• Intero cromosoma

Citocalasina B:

• Fungo Helminthosporum dematoideum
• Blocca la citodieresi
• Riconoscere cellule in divisione (aspetto binucleato)

Formazione MN

Perdita di un cromosoma intero (aneuploidia) o perdita di un frammento cromosomico (evento clastogeno).

• Formazione MN
• Perdita intero cromosoma
• Perdita frammento cromosomico

Protocollo MN con cytB

Inizio coltura:

• Trattamento Cyt B
• Recupero 0 h, 24 h, 44 h, 72 h

FISH

Citogenetica molecolare (FISH): analisi di sequenze di DNA del genoma (sequenze bersaglio) con sequenze complementari di DNA (sonde).

Ibridi sonda-bersaglio sono visualizzabili tramite molecole fluorescenti (FITC, Cy5, TRITC, Cy3) nel sito di ibridazione. Marcatura della sonda può essere diretta (fluorocromo) o indiretta (anticorpi + fluorocromo).

Analizzare cellule in divisione o quiescenti (tumori solidi).

Campi applicazione FISH

• Diagnostica clinica (pre- e post-natale)
• Mutagenesi (analisi in metafase od interfase)
• Riarrangiamenti cromosomici e aneuploidia
• Meccanismi di formazione del danno