Tossicologia e mutagenesi ambientale - Appunti Lezione 12

Test del MN in cellule binucleate

Piccolo nucleo accessorio

 − dotato di membrana propria

− si divide autonomamente

− origina da rottura cromosomiche o da interi cromosomi

in ritardo)

itardo migratorio durante l’anafase

 R

− frammento cromosomico acentrico

− intero cromosoma

C

 itocalasina B

− fungo Helminthosporum dematoideum

− blocca la citodieresi

− riconoscere cellule in divisione (aspetto binucleato)

Formazione MN

Perdita di un cromosoma intero

(aneuploidia) MN

MN

Perdita di un frammento cromosomico

(evento clastogeno)

Formazione MN

Perdita intero Perdita frammento

cromosoma cromosomico

Protocollo MN con cytB

Inizio coltura Trattamento Cyt B Recupero

0 h 24 h 44 h 72 h

FISH

Citogenetica molecolare (FISH)

 − sequenze di DNA del genoma (sequenze bersaglio) +

sequenze complementari di DNA (sonde)

Ibridi sonda-bersaglio

Visualizzazione ibridi: molecole fluorescenti (FITC Cy5

- TRITC Cy3 sito ibridazione)

Marcatura della sonda: diretta (fluorocromo)

indiretta (anticorpi + fluorocromo)

Analizzare cellule in divisione

o quiescenti (tumori solidi)

Campi applicazione FISH

Diagnostica clinica (pre- e post-natale)

 Mutagenesi (analisi in metafase od interfase)

 − riarrangiamenti cromosomici e aneuploidia

− meccanismi di formazione del danno genomico

Biologia cellulare

 Genetica del cancro

 Genetica di base

 − organizzazione ed architettura dei genomi

− relazioni evolutive fra specie diverse

Aspetti metodologici della FISH

Invecchiamento preparati da ibridare

 − favorisce l’accessibilità sonda ai siti bersaglio

Denaturazione (sonda - sequenza bersaglio)

 − temperatura (80-90°C) (2-10 min)

− soluzioni denaturanti (formammide 2XSSC) (70°C

2 min)

Ibridazione

 − alta stringenza ibridi + stabili

− ↓[SSC] - ↑T - agenti denaturanti (16 h a 37-45°C in

2XSSC 70% formammide)

 Lavaggi post-ibridazione

− eliminano legami aspecifici

− ↓[SSC] - ↑T - agenti denaturanti (3x 2-10 min -

37-45°C in 2XSSC 50% formammide)

Chromosome painting

Analisi fluorescente di riarrangiamenti cromosomici

stabili (traslocazioni)

Provenienza sonde

 − amplificazione sequenze ripetute (Alu PCR) ibridi

uomo-topo

− microdissezione di cromosomi - amplificazione

(DOP-PCR)

− separazione citofluorimetrica con FACS (flow

activated cell sorter)

Cocktail di sonde

 − 3 coppie cromosomi (≈ 20% genoma) marcati con

medesimo fluorocromo o con fluorocromi differenti

− controcolorazione resto del genoma (ioduro di propidio -

DAPI)

Valutare cambiamenti nel pattern di fluorescenza fra

 Chromosome painting

Analisi in fluorescenza di MN

Sonda di DNA alfoide pancentromerica

DNA centromerico (alfoide) non marcato

Ibridazione e marcatura del DNA centromerico

Controcolorazione del DNA non alfoide

MN contenente un MN contenente un

frammento acentrico intero cromosoma

Analisi in FISH di nondisgiunzione

Sonda di DNA alfoide

cromosoma-specifica

Ibridazione del DNA centromerico

Controcolorazione del DNA non marcato #9 #22

1) 2) 3)

Cellula binucleata Nondisgiunzione Perdita cromosoma #22

normale cromosoma #9 mediante formazione MN