Tossicologia e mutagenesi ambientale - Appunti Lezione 11

Linee primarie e stabilizzate

Primarie

 − fibroblasti - linfociti - cellule di midollo

− numero finito di cicli cellulari (fibroblasti uomo: 60)

− cariotipo ± stabile

Senescenza

Stabilizzate (immortalizzazione delle colture)

 − proliferazione incontrollata ed indefinita

− instabilità del cariotipo

− perdita differenziazione

Immortalizzazione

Linee cellulari di mammifero

Roditore

 − numero di divisioni più alto

− alta frequenza spontanea immortalizzazione

− breve tempo replicazione

A. V79 (hamster cinese)

− fibroblasti tessuto polmonare

B. CHO (hamster cinese)

− fibroblasti tessuto ovarico

Linee cellulari umane

Numero di divisioni inferiore

 Bassa frequenza spontanea immortalizzazione

 Tempo replicazione più alto

 A. Fibroblasti primari (qualsiasi tessuto)

B. Linfociti di sangue periferico (linfociti T)

C. Linee fibroblasti trasformate (virus SV-40

D. Linee linfoblastoidi trasformate (virus

Epstein-Barr)

E. Linee tumorali

− HeLa (carcinoma collo utero)

− tumori ematologici

Test in vitro in cellule di mammifero

Test di mutazione genica

 − test HPRT

 Test di mutazione cromosomica

− test delle aberrazioni cromosomiche

− test del micronucleo in cellule binucleate

Test degli SCE

 Test di danno al DNA

 − test della cometa (single cell gel electrophoresis)

TEST CITOGENETICI



Test HPRT: mutazione genica

Locus genico: HPRT (cromosoma X Sindrome di

 Lesch-Nyhan)

− →

via di recupero delle purine: purine purine

monofosfato

− conversione analoghi purine (6-mercaptopurina -

→

tioguanina - 8-azaguanina) citotossica

 Metodo selettivo positivo

− perdita funzionalità enzimatica

− cellule con HPRT mutato sopravvivono in mezzo

selettivo (6-TG + 8-AG + 6MP)

Reversione in mezzo HAT (cellule HPRT-deficienti)

 − blocco sintesi de novo purine (via di recupero)

− revertenti HPRT

Test HPRT: il protocollo

1. Crescita cellule in coltura

2. Trattamento mutageno dopo 24 h

3. Crescita in terreno normale

4. Selezione mutanti

− crescita in terreno selettivo (ad alta densità)

5. Controllo vitalità cellulare

− crescita in terreno normale (a bassa densità)

6. Calcolo frequenza mutazione

Sviluppo della citogenetica

1879-1890 Visualizzazione cromosomi umani

1. 1914 Teoria della mutazione somatica del

2. cancro (Boveri)

1956 2n = 46

3. 1958-1959 Sindrome di Down Klinefelter Turner

4. 1960 Cromosoma Philadelphia: CML

5. 1970 Bandeggio cromosomico

6. 1973 Cromosoma Philadelphia: tra 9:22

7. 1969-1977 Citogenetica molecolare - FISH

8. Test citogenetici

Manifestazione di un effetto citologico (sistema

 cellulare in divisione)

− presenza di un danno al materiale genetico

− visibile e quantificabile al microscopio

Marcatore citogenetico

Alterazione grossolana del materiale genetico

 Cromosomi Nucleo

Analisi in metafase Analisi in interfase

“Aiuti” sperimentali

Fitoemoagglutinina

 − stimola cellule in G (linfociti periferici)

0

olchicina e suoi derivati (colcemid)

 C

− arresto delle cellule in metafase e condensazione dei

cromosomi

Soluzioni ipotoniche e fissativi

 − modulano l’allargamento dei preparati cromosomici

− consentono la conservazione a lungo dei preparati

cromosomici

Protocolli sperimentali

Messa in coltura

 − terreno - fitoemoagglutinina - siero fetale bovino -

antibiotici

Trattamento dopo 24 h (1 h - 48 h)

 − tipo cellulare

− marcatore genetico

Termine coltura (48 h - 72 h) - Recupero cellule

 − tipo cellulare

− marcatore genetico

Recupero cellule

1. Trattamento con soluzione ipotonica

(KCl 0.75M)

2. Prefissativo (ac. acetico:metOH 5:3)

3. Fissativo (metOH)

4. Lavaggi fissativo (2x)

metafase ac.acetico:metOH 1:2

interfase ac.acetico:metOH 1:5

5. Gocciatura su vetrino

6. Colorazione Giemsa 3-6%

Rotture cromosomiche

Rottura diretta del DNA (SSB - siti abasici - DSB)

 − radiazione ionizzante - ROS - bleomicina

S-indipendenti

Replicazione sito danneggiato in 1 elica DNA (SSB)

 − conversione SSB a DSB durante fase S

− mutageni chimici

S-dipendenti

Inibizione sintesi del DNA

 − presenza agente durante la fase S

− conversione SSB a DSB succesiva fase S

− farmaci antitumorali

S-dipendenti

Terminologia

Agenti S-indipendenti I metafase

 − lesione in G /G AC cromosomiche

0 1

− lesione in S/G AC cromatidiche

2

Agenti S-dipendenti Fase S

 − lesione in G /G I metafase AC cromatidiche

0 1

− lesioni in S/G II metafase AC cromatidiche

2

Agente clastogeno Agente aneuploidogeno

Aberrazioni strutturali Aneuploidia

Analisi in metafase

Test delle aberrazioni cromosomiche (AC)

 − strutturali

− (numeriche)

ipoploidia

 iperploidia



Test delle aberrazioni cromosomiche con

 bandeggio

− alternanza di bande chiare e scure caratteristica

per ciascuna coppia di omologhi

Test degli scambi tra cromatidi fratelli (SCE)

