Tossicologia e mutagenesi ambientale - Appunti Lezione 11

Test in vitro e colture cellulari

Utilizzo di microrganismi

Utilizzo di microrganismi (procarioti ed eucarioti unicellulari) per la crescita delle cellule "in provetta" (colture cellulari).

Utilizzo di cellule di eucarioti superiori

Le colture cellulari possono utilizzare cellule di eucarioti superiori (mammiferi, compreso l'uomo).

Allestimento in vitro di colture cellulari disperse

Le colture cellulari possono essere linee primarie o stabilizzate.

Linee primarie

• Fibroblasti
• Linfociti
• Cellule di midollo

Le linee primarie hanno un numero finito di cicli cellulari (ad esempio, fibroblasti umani: 60) e un cariotipo ± stabile, portando alla senescenza.

Linee stabilizzate

Le linee stabilizzate subiscono un processo di immortalizzazione, caratterizzato da proliferazione incontrollata e indefinita, instabilità del cariotipo e perdita di differenziazione.

Immortalizzazione

Linee cellulari di mammifero

Roditore

• Numero di divisioni più alto
• Alta frequenza spontanea di immortalizzazione
• Breve tempo di replicazione

Esempi:

• A. V79 (hamster cinese) - fibroblasti del tessuto polmonare
• B. CHO (hamster cinese) - fibroblasti del tessuto ovarico

Linee cellulari umane

• Numero di divisioni inferiore
• Bassa frequenza spontanea di immortalizzazione
• Tempo di replicazione più alto

Esempi:

• A. Fibroblasti primari (qualsiasi tessuto)
• B. Linfociti di sangue periferico (linfociti T)
• C. Linee di fibroblasti trasformate (virus SV-40)
• D. Linee linfoblastoidi trasformate (virus Epstein-Barr)
• E. Linee tumorali - HeLa (carcinoma collo utero) - tumori ematologici

Test in vitro in cellule di mammifero

Test di mutazione genica

• Test HPRT

Test di mutazione cromosomica

• Test delle aberrazioni cromosomiche
• Test del micronucleo in cellule binucleate

Test degli SCE e danno al DNA

• Test della cometa (single cell gel electrophoresis)

Test citogenetici

Test HPRT: mutazione genica

Locus genico: HPRT (cromosoma X Sindrome di Lesch-Nyhan).

• Via di recupero delle purine: purine purinemonofosfato
• Conversione di analoghi purinici (6-mercaptopurina → tioguanina - 8-azaguanina) citotossica
• Metodo selettivo positivo
• Perdita di funzionalità enzimatica
• Cellule con HPRT mutato sopravvivono in mezzo selettivo (6-TG + 8-AG + 6MP)
• Reversione in mezzo HAT (cellule HPRT-deficienti)
• Blocco della sintesi de novo delle purine (via di recupero)
• Revertenti HPRT

Test HPRT: il protocollo

1. Crescita delle cellule in coltura
2. Trattamento mutageno dopo 24 ore
3. Crescita in terreno normale
4. Selezione dei mutanti - crescita in terreno selettivo (ad alta densità)
5. Controllo della vitalità cellulare - crescita in terreno di controllo