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Tossicologia e mutagenesi ambientale - Appunti Lezione 11

Appunti per l'esame di Tossicologia e mutagenesi ambientale del professor Scarpato - Lezione 11.
Test in vitro e colture cellulari;
linee primarie e stabilizzate;
linee cellulari di mammifero;
linee cellulari umane;
Test HPRT: mutazione genica;
test HPRT: il protocollo.

Esame di Tossicologia e mutagenesi docente Prof. R. Scarpato

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ESTRATTO DOCUMENTO

Test in vitro in cellule di mammifero

Test di mutazione genica

 − test HPRT

 Test di mutazione cromosomica

− test delle aberrazioni cromosomiche

− test del micronucleo in cellule binucleate

Test degli SCE

 Test di danno al DNA

 − test della cometa (single cell gel electrophoresis)

TEST CITOGENETICI

Test HPRT: mutazione genica

Locus genico: HPRT (cromosoma X Sindrome di

 Lesch-Nyhan)

− →

via di recupero delle purine: purine purine

monofosfato

− conversione analoghi purine (6-mercaptopurina -

tioguanina - 8-azaguanina) citotossica

 Metodo selettivo positivo

− perdita funzionalità enzimatica

− cellule con HPRT mutato sopravvivono in mezzo

selettivo (6-TG + 8-AG + 6MP)

Reversione in mezzo HAT (cellule HPRT-deficienti)

 − blocco sintesi de novo purine (via di recupero)

− revertenti HPRT

Test HPRT: il protocollo

1. Crescita cellule in coltura

2. Trattamento mutageno dopo 24 h

3. Crescita in terreno normale

4. Selezione mutanti

− crescita in terreno selettivo (ad alta densità)

5. Controllo vitalità cellulare

− crescita in terreno normale (a bassa densità)

6. Calcolo frequenza mutazione

Sviluppo della citogenetica

1879-1890 Visualizzazione cromosomi umani

1. 1914 Teoria della mutazione somatica del

2. cancro (Boveri)

1956 2n = 46

3. 1958-1959 Sindrome di Down Klinefelter Turner

4. 1960 Cromosoma Philadelphia: CML

5. 1970 Bandeggio cromosomico

6. 1973 Cromosoma Philadelphia: tra 9:22

7. 1969-1977 Citogenetica molecolare - FISH

8. Test citogenetici

Manifestazione di un effetto citologico (sistema

 cellulare in divisione)

− presenza di un danno al materiale genetico

− visibile e quantificabile al microscopio

Marcatore citogenetico

Alterazione grossolana del materiale genetico

 Cromosomi Nucleo

Analisi in metafase Analisi in interfase

“Aiuti” sperimentali

Fitoemoagglutinina

 − stimola cellule in G (linfociti periferici)

0

olchicina e suoi derivati (colcemid)

 C

− arresto delle cellule in metafase e condensazione dei

cromosomi

Soluzioni ipotoniche e fissativi

 − modulano l’allargamento dei preparati cromosomici

− consentono la conservazione a lungo dei preparati

cromosomici

Protocolli sperimentali

Messa in coltura

 − terreno - fitoemoagglutinina - siero fetale bovino -

antibiotici

Trattamento dopo 24 h (1 h - 48 h)

 − tipo cellulare

− marcatore genetico

Termine coltura (48 h - 72 h) - Recupero cellule

 − tipo cellulare

− marcatore genetico

Recupero cellule

1. Trattamento con soluzione ipotonica

(KCl 0.75M)

2. Prefissativo (ac. acetico:metOH 5:3)

3. Fissativo (metOH)

4. Lavaggi fissativo (2x)

metafase ac.acetico:metOH 1:2

interfase ac.acetico:metOH 1:5

5. Gocciatura su vetrino

6. Colorazione Giemsa 3-6%


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze e tecnologie per l'ambiente (Facoltà di Agraria, di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali)
SSD:
Università: Pisa - Unipi
A.A.: 2008-2009

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Dalaran191 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Tossicologia e mutagenesi e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Pisa - Unipi o del prof Scarpato Roberto.

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