Tossicologia Appunti Morari

Tossicologia

Tossicocinetica: il metabolismo

La tossicocinetica è la farmacocinetica delle sostanze tossiche. La maggior parte delle sostanze diventano tossiche dopo la metabolizzazione, in seguito a una disfunzione cellulare che causa tossicità. Solo poche sostanze risultano essere tossiche prima di essere metabolizzate, essendo gli acidi e i sulfamidici.

Per metabolismo si intende l'insieme di reazioni enzimatiche finalizzate alla biotrasformazione delle sostanze esogene (non solo farmaci) in composti più polari ed idrosolubili, più facilmente eliminabili dall'organismo. Il metabolismo riguarda dunque anche gli xenobiotici, ovvero molecole di qualsiasi tipo, di origine naturale o sintetica, estranee a un organismo (etanolo).

Il metabolismo ha una doppia valenza: detossificante e bioattivante (tossificante). La detossificazione porta alla formazione di metaboliti stabili, mentre la bioattivazione porta alla formazione di metaboliti reattivi, che magari inizialmente non erano tossici, ma lo diventano dopo questa bioattivazione (esempio il paracetamolo, che assunto in gran quantità determina la formazione di un metabolita tossico, l'N-para-acetil-benzochinone).

È importante studiare il metabolismo perché esso permette di:

• Stabilire e adattare la posologia.
• Evidenziare la presenza di altri composti (attivi, inattivi, tossici) e prevedere nuove sintesi. Per esempio dalle benzodiazepine si può sintetizzare l'oxazepam, usato nei casi di ansia e agitazione per la sua azione psicosedativa.
• Prevedere interferenze metaboliche con altri farmaci, determinando in seguito il ritiro dal commercio del farmaco.
• Prevedere variazioni di risposta in seguito a trattamento protratto (induzione e repressione enzimatica, che può determinare un aumento o diminuzione dell’effetto di un farmaco).
• Prevedere la suscettibilità individuale a xenobiotici presenti nell’ambiente, nei luoghi di lavoro ecc.

Le reazioni metaboliche possono essere presistemiche (prima dell’assorbimento) e sistemiche, le quali si distinguono in extracellulari localizzate negli enzimi plasmatici, ed intracellulari localizzate negli enzimi microsomiali e mitocondriali.

Il metabolismo è costituito da alcune fasi:

1. Funzionalizzazione; inserzione o messa in evidenza di gruppi funzionali (ossidazioni, perossidazioni).
2. Riguarda i coniugati con sostanze per rendere la molecola più idrofila (coniugazioni con acido glicuronico, glutatione). La scissione di glicuronidi nell’intestino dovuta alle betaglicuronidasi batteriche può prolungare la permanenza degli xenobiotici nell’organismo (circolo entero epatico).
3. Riguardano i coniugati con il glutatione, i quali vengono degradati fino alla formazione di acidi mercapturici. Il glutatione è contenuto in tutte le cellule fino a 10 nanometri, ed è un ottimo scavenger di radicali liberi, e trasportatore di composti endogeni.

Responsabili della metabolizzazione di circa l’80% dei farmaci sono le ossidasi. Tra le famiglie di enzimi coinvolti maggiormente nella metabolizzazione ricordiamo i citocromi CYP, che sono delle emoproteine. Essi derivano da circa 300 geni e si classificano in:

• CYP1: derivano da geni molto diversi tra loro, con una analogia < del 40%.
• CYP1A: derivano da geni non molto diversi tra loro, con un'analogia compresa tra il 40% - 55%.
• CYP1A1: derivano da geni simili tra loro, con un’analogia > del 55%.

Questi enzimi si trovano a livello del fegato, della cute (importanti per i tumori della cute), del tratto intestinale, nei polmoni, nei reni, ecc. Non si trovano invece nel cuore, nella milza, nell’utero. I citocromi sono eme-dipendenti, nell’eme il Fe oscilla da 2+ a 3+.

Tra le famiglie di citocromi importanti ricordiamo sicuramente:

• CYP1A1, CYP1A2.
• CYP3A4, che metabolizza circa il 50% dei farmaci. Non è polimorfo, cioè non ha altre isoforme, importanti per la suscettibilità individuale.
• CYP2D6, CYP2C19 sono polimorfi.
• CYP2E1 metabolizza l’etanolo. Dopo un’assunzione cronica, l’alcol viene metabolizzato più velocemente perché aumenta la concentrazione del CYP2E1. Ciò può causare problemi dopo l’assunzione di paracetamolo, il quale determinerà maggiormente epatotossicità, dovuta appunto a una maggiore presenza di CYP2E1.

Tutti questi citocromi si trovano a livello del fegato, a parte i CYP1A1, i quali si trovano nei polmoni e nella cute. Questi citocromi possono essere anche indotti, determinando così un aumento della loro quantità.

Modificazioni del metabolismo

Il metabolismo può essere modificato da alcuni fattori:

1. Polimorfismo genetico: si presenta negli individui con diverse capacità metaboliche, per la presenza di isoenzimi con attività ridotta o aumentata. Polimorfismi di interesse clinico: NAT1 e 2 (N-amino-transferasi); Alcol e aldeide deidrogenasi importanti per il metabolismo dell’etanolo.
2. Interazione con altri xenobiotici (repressione e induzione enzimatica).
3. Patologie.
4. Età e sesso: con l’avanzare dell’età si riduce l’attività enzimatica.
5. Abitudini: fumo, caffè, dieta.

La presenza di polimorfismi genetici può conferire la capacità di rispondere ai farmaci o determinare effetti collaterali. Gli individui si possono differenziare in:

• Omozigoti: quando hanno 2 alleli che codificano per l’enzima “normale”.
• Eterozigoti: quando hanno 1 allele normale e 1 allele che codifica per un enzima a funzione ridotta.
• Lento metabolizzanti: quando hanno 2 alleli che codificano per un enzima con attività ridotta o nulla.
• Alto metabolizzanti: quando hanno 2 alleli che codificano per un enzima con attività eccessiva.

L’impatto clinico dei polimorfismi dipende da alcuni fattori:

• Presenza di vie di metabolizzazione alternative.
• Dose del farmaco (es. aloperidolo è metabolizzato a basse dosi dal CYP2D6 e a dosi elevate da CYP3A4).

Principali polimorfismi a carico dei citocromi sono:

• CYP2D6: coinvolto nell’eliminazione di circa il 25% dei farmaci (alcuni beta-bloccanti, antidepressivi). È stato il primo ad essere stato individuato come polimorfismo. È un lento ed ultra metabolizzante. Esso converte la codeina in morfina; negli ultra metabolizzanti l’effetto della morfina si sentirà in modo più rilevante.
• CYP2C9: coinvolto nel metabolismo di più di 100 farmaci tra cui anticoagulanti dicumarolici, sulfoniluree. È coinvolto nel caso clinico della warfarina (anticoagulante), in quanto è responsabile della sua metabolizzazione. Solo la presenza di polimorfismi CYP2C9 e VKORC1 può giustificare il 50% della terapia senza avere grossi problemi; il warfarin infatti ha un indice terapeutico molto basso.
• CY2C19: metabolizza soprattutto inibitori di pompa (omeprazolo, lansoprazolo e pantoprazolo).

Nel metabolismo la variabile è rappresentata dall’interazione tra farmaci, i quali possono determinare induzione o inibizione farmacometabolica. L’inibizione farmacometabolica è un processo per cui l’esposizione a due sostanze porta all’inibizione del metabolismo di un farmaco e all’aumento della sua concentrazione con possibili effetti tossici. Ciò risulta pericoloso soprattutto per sostanze rapidamente metabolizzate e con basso indice terapeutico. Questa inibizione procede attraverso alcuni meccanismi d’azione:

• Competizione per lo stesso enzima.
• Inattivazione dell’enzima (inibitori suicidi).

Tra gli inibitori ricordiamo soprattutto antibiotici macrolidi, succo di pompelmo, Ca antagonisti. L’induzione farmacometabolica prevale a livello epatico, ed ha un’insorgenza lenta. Questa induzione procede attraverso 2 meccanismi d’azione:

• Aumento della sintesi degli enzimi.
• Stabilizzazione della proteina alla degradazione (CYP2E1).

Tra gli induttori ricordiamo: benzopirene (recettore Ah); fenobarbitale (recettore CAR); isoniazide (non aumenta la sintesi del CYP2E1, ma ne aumenta la vita); PCN (recettore PXR); acido clofibrico (recettore PPAR). Questi induttori si differenziano per il diverso meccanismo d’azione. L’induzione avviene attraverso l’attivazione di un recettore, il quale migra nel nucleo, ed insieme a delle proteine va a legare delle sequenze specifiche del DNA (XRE), ed attraverso questo legame reprime un promotore responsabile della sintesi dell’enzima. Ogni gruppo di induttori si legherà a recettori differenti.

Meccanismi di tossicità

Gli effetti tossici delle sostanze dipendono da vari fattori: caratteristiche della sostanza, dalla dose, dal meccanismo d’azione, dalla via di somministrazione, dalla suscettibilità individuale e anche dalla durata dell’esposizione, la quale può essere acuta (1 o più somministrazioni nell'arco di 24 ore); sub-acuta e sub-cronica (più somministrazioni per < 1 mese o < 3 mesi rispettivamente); cronica (più somministrazioni per > 3 mesi). La durata dell’esposizione è importante perché in alcune sostanze gli effetti cronici sono differenti da quelli acuti. Il benzene per esempio in acuto è neurotossico, in cronico dà problemi al midollo osseo alterando l’emopoiesi.

Gli effetti tossici possono essere classificati in:

• Insorgenza: comprendono effetti immediati (avvelenamento da cianuro) e ritardati (cancerogenesi) nel tempo.
• Decorso: comprendono effetti reversibili (al fegato), ed irreversibili (al SNC). Dipendono dalla capacità di rigenerazione tissutale.
• Localizzazione: comprendono effetti locali (nella sede di contatto: pelle, tratto gastrointestinale), e sistemici (dopo l’assorbimento: sangue, organi viscerali).
• Prevedibilità: comprendono effetti prevedibili (dose dipendenti, caratterizzati da un limite soglia) ed imprevedibili (non dose dipendenti, in cui non esiste una soglia).

Una sostanza tossica può: alterare il microambiente, oppure interferire con i costituenti cellulari. Inoltre sappiamo che una sostanza può essere tossica già tale, oppure divenirlo dopo una bioattivazione. Tra i principali metaboliti tossici ricordiamo: elettrofili (paracetamolo) e radicali liberi.

Le sostanze tossiche possono poi agire attraverso meccanismi non selettivi come:

• Scompaginazione e distruzione della membrana plasmatica (es. radicali liberi e perossidazione lipidica; alterazioni stato dei sistemi redox: glutatione).
• Legami covalenti con strutture cellulari (es. radicali liberi ed addotti col DNA, proteine, etc.).

Le sostanze tossiche possono poi agire attraverso meccanismi selettivi come:

• Blocco dei canali di membrana (es. i glicosidi digitalici).
• Bloccano la sintesi proteica (es. la folloidina impedisce la formazione di actina determinando lesione della membrana).
• Presenza di antigeni, che causano reazioni allergiche.

La sostanza tossica interagisce con il bersaglio attraverso:

• Legami non-covalenti (es tcdd e ah).
• Legami covalenti (tipici degli elettrofili/radicali liberi).
• Sottrazione di un h (es perossidazione lipidica).
• Trasferimento di elettroni.

Di conseguenza l’azione del tossico sul bersaglio può portare a:

• Distruzione della molecola bersaglio.
• Disfunzione della molecola bersaglio.
• Alterazione morfologica delle proteine.

L’entità del danno dipenderà da:

• Funzione ed importanza del componente cellulare alterato.
• Capacità di riparazione tissutale.
• Capacità di rigenerazione tissutale.

Le sostanze velenose si possono distinguere in lesionali (portano alla morte cellulare) e funzionali (portano a danni cellulari). I veleni funzionali possono causare danno alla cellula attraverso:

• Alterazione dell’espressione genica (per interazione con fattori di trascrizione nucleari).
• Alterazioni delle vie di trasduzione (es. equilibrio tra fosforilazioni e defosforilazioni, tra kinasi e fosfatasi).
• Alterazioni dell’attività cellulare (stimolazione/blocco dei recettori per i neurotrasmettitori, canali, pompe di membrana).

I veleni lesionali possono causare morte cellulare attraverso:

• Alterazioni sulla sintesi di ATP: es. il rotenone sostanza usata come insetticida, nei ratti determina morbo di Parkinson. Ciò dimostra come neurotossine ambientali sono direttamente coinvolte nella patologia. Sostanze che agiscono sulla sintesi di ATP sono: Inibitori della produzione di NADH e FADH₂ (es. inibitori del ciclo di Krebs); Inibitori del trasporto dell'O₂; Inibitori della fosforilazione dell'ADP (inibitori ATP sintetasi, es. clordecone).
• Regolazione del Calcio⁺⁺: le sostanze tossiche possono aumentare le concentrazioni intracellulari di Calcio, attraverso:

• Aumento dell'ingresso di calcio: tramite canali accoppiati al ligando (es. glutammato); tramite detergenti, enzimi idrolitici attraverso la distruzione della membrana.
• Riduzione dell'uscita di calcio dalla cellula: tramite i bloccanti della Calcio-ATPasi (Paracetamolo, ossidanti tiolici) che non permettono al calcio di uscire dalla cellula.

Il calcio è un segnalatore intracellulare importante, se i suoi livelli rimangono troppo elevati all’interno della cellula, può insorgere apoptosi e necrosi. Inoltre si può avere un’alterazione del citoscheletro (alterazione delle proteine contrattili, actina). I bersagli principali in questo contesto possono essere Ca-ATPase e Ca-uniporter.

I radicali liberi

I radicali liberi sono delle molecole contenenti uno o più elettroni spaiati nell’orbitale esterno. Si formano per accettazione o perdita di un elettrone o per scissione omolitica di legami covalenti. Tra i radicali liberi ricordiamo quelli dell’O: anione superossido (O₂), radicale idroperossilico (HOO) e radicale idrossilico (OH). Quest’ultimo è il più pericoloso perché appena si forma si attacca subito, ed è difficile tamponarlo.

Poi ricordiamo i derivati dall'azoto (RNS) come l'ossido nitrico (NO), il quale è prodotto dalle NO sintasi ed è coinvolto nella risposta immunitaria, è un potente vasodilatatore. Esistono poi anche i radicali liberi del carbonio. Essi si formano per scissione omolitica di legami covalenti. Tra essi ricordiamo: sostanze elettrofile (paraquat, nitrofurantoina), si formano dopo aver accettato 1 elettrone dalle reduttasi; sostanze nucleofile (benzopirene e IPA) si formano dopo la perdita di 1 elettrone ad opera di ossidasi.

Nei liquidi biologici può inoltre avvenire la reazione di Fenton. Essa avviene quando c’è una bassa presenza di metalli (Fe, Cu), importanti perché sono dei catalizzatori. In questa reazione l’H₂O₂ viene scissa in OH-OH, formando così 2 radicali liberi. I radicali liberi possono innescare degli eventi che porteranno alla morte cellulare:

• Perossidazione delle membrane
• Ossidazione e deplezione di GSH (glutatione)
• Ossidazione dei tioli e delle proteine omeostasi ionica (pompe)
• Alterazione al DNA al citoscheletro mitocondriale
• Danno deplezione dell’ATP
• Alterazione di siti di fragilità sulle membrane
• Comparsa della morte cellulare.

La formazione di radicali liberi può essere evitata attraverso l’utilizzo di scavenger (sostanze antiossidanti), essi annullano e tamponano i radicali liberi. Esistono pure dei sistemi enzimatici che neutralizzano i radicali liberi, essi sono: superossido-dismutasi, che trasforma l’anione superossido in H₂O₂ (non è un’ottima azione perché l’H₂O₂ può dare vita a 2 radicali liberi attraverso la reazione di fenton); catalasi, nei perossisomi (riduce H₂O₂ senza formazione di radicali liberi); glutatione perossidasi (riduce H₂O₂ mediante l’ossidazione di 2 molecole di glutatione).

Meccanismi di riparazione

La riparazione può essere molecolare (DNA, proteine, lipidi), cellulare, tissutale (proliferazione, apoptosi). Le riparazioni più studiate sono quelle che riguardano il DNA. Esso è soggetto a milioni di lesioni giornaliere, per questo motivo la sua riparazione risulta essere essenziale. Tra i principali meccanismi di danno al DNA ricordiamo: disaccoppiamento e perdita di basi; danno strutturale; formazione di addotti. Oggi esistono diverse patologie che derivano dalla mancata o insufficiente capacità di riparare il DNA.

Tra i meccanismi di riparazione molecolare più importanti ci sono:

• Riparazione del DNA, possono essere:
• Diretti: rimuovono l’addotto, cioè il gruppo che è responsabile del danno.
• Per escissione: rimuovono la base o i nucleotidi.
• Per ricombinazione: è un meccanismo post-replicativo, la lesione è riparata dopo la replicazione del DNA.

RIPARAZIONE DEI LIPIDI

• I lipidi perossidati sono riparati attraverso una cascata di eventi che coinvolge alcuni agenti riducenti (es. tocoferolo) e gli enzimi glutatione, perossidasi e reduttasi.

RIPARAZIONE DELLE PROTEINE

• Mantenere i gruppi tiolici delle proteine in forma ridotta è fondamentale per preservarne la funzione.

Tra i meccanismi di riparazione cellulare ricordiamo l’azione del NGF (fattore di crescita neuronale). Esso è un’eccezione in quanto la maggior parte delle cellule danneggiate tendono a morire ed a essere sostituite da altre cellule.

Tra i meccanismi di riparazione tissutale ricordiamo sicuramente la sostituzione delle cellule morte per apoptosi o necrosi. La differenza principale tra necrosi e apoptosi è che l’apoptosi è una morte programmata della cellula, richiede la sintesi di nuove proteine; mentre la necrosi è un processo passivo. La riparazione tissutale può però fallire se viene alterato il suo decorso normale. Il tessuto può andare incontro a necrosi, cancerogenesi dovuta a...